叩闽种 专题论述 盐溶蛋白电泳技术及其在玉米种子鉴定中的应用 肖海峻 孟利前 李凌燕 田 璐祝国辉 （北京农业职业学院食品与生物工程系，１０２４４２） 摘要：盐溶蛋白电泳方法具有样品提取时间和电泳时间短、 电泳谱带清晰、分辨率高、品种问谱带差异大、组合间互补带明 显等优点．因而在玉米种子纯度鉴定中具有重要意义 本文综述 了盐溶蛋白电泳技术检测玉米种子纯度的原理、操作要点、谱带 分析及在电泳过程中常出现的问题及解决办法．旨在为从事种 子鉴定的同行提供参考 关键词：盐溶蛋白：蛋白质电泳技术：种子纯度鉴定 随着新育种方法的广泛应用以及种子加工业对种 子质量的特殊要求．传统的形态学检验方法已不能满 足种子生产、运输和加工各个环节对检验的要求．迫切 需要新的精确的检验手段的应用 ２０世纪７Ｏ年代以 来．蛋白质电泳技术开始应用于种子品种鉴定和纯度 检验，并得到迅速推广。１９９１年国际种子检验协会把 蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法．从而 使蛋白质电泳技术在种子品种鉴定和纯度检验上占有 重要地位，对防止伪劣种子流入市场、保护优良种质防 止退化、维护育种家们的知识产权和权益等方面具有 重要意义。 随着电泳技术的迅速发展．玉米种子纯度盐溶蛋 白质鉴定方法于２００１年９月被列为行业标准．使得应 用蛋白质电泳鉴定种子纯度的技术得到迅速普及 盐 溶蛋白电泳方法具有样品提取时间和电泳时间短、电 泳谱带清晰、分辨率高、品种间谱带差异大、组合间互 补带明显等优点 １盐溶电泳技术的原理 从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶 的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用 下进行分离．通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉 米品种由于遗传组成的不同．种子内所含的蛋白质种 类有差异．这种差异可利用电泳图谱加以鉴别．从而对 种子真实性和品种纯度进行鉴定 ２盐溶电泳技术的操作要点 ２．１样品制备 按ＧＢ／Ｔ ３５４３．２的要求．从送验样 品中随机抽取玉米种子至少１００粒．用单子粒粉碎器 粉碎，放人１．５ｍｌ离心管中．用滴管加入与样品体积 相同的样品提取液，摇匀，放置５ｍｉｎ后，再摇１次， ３０ｍｉｎ后，用离心机离心ｆ５０００ｒ／ｍｉｎ）１５ｍｉｎ，取上清液 用于电泳。 ２．２凝胶制备胶室制备将预先洗净晾干的玻璃 板装入胶条中．然后把胶条固定在垂直板电泳槽内，保 持水平．短板向正极．拧紧螺栓，备用。封底缝根据电 泳槽大小．取适量分离胶溶液于烧杯中．用微量进样器 加入适量３％的过氧化氢溶液ｆ一般每５ｍ１分离胶溶液 加２０ｔｘｌ ３％过氧化氢溶液１，迅速摇匀，并从长玻璃板 外侧沿玻璃板倒人，振动电泳槽３次．放平。灌分离胶 底缝封住后．用滤纸条插入两玻璃板之间．吸去因聚合 而析出的水；量取分离胶溶液适量．加入３％过氧化氢 溶液ｒ一般每１５ｍ１分离胶溶液加３％过氧化氢２０１Ｍ）：Ｇ 速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之 间。高度距短玻璃板上沿１．２ｃｍ：放平电泳槽并在试验 台上振动３次后．迅速加入适量的正丁醇封住胶面。待 凝胶聚合后．吸出分离胶表面上的正丁醇．并用去离子 水冲洗胶面３次．用滤纸吸干 灌浓缩胶量取浓缩胶 溶液适量，加入３％过氧化氢溶液ｆ一般每５ｍｌ浓缩胶 溶液加３％过氧化氢溶液４０１ｘｌ１，迅速搅匀，倒人两玻 璃板之间．马上插好样品梳．样品梳底部距分离胶顶部 ０．５ｃｍ。 ２．３点样浓缩胶聚合后．拔出样品梳并将样品槽清 理干净．用微量进样器在每个样品槽中加人不同子粒 的样品上清液１５１ｘｌ，每点一粒后．都要用去离子水清 洗进样器３次 ２．４电泳、染色加样完毕后．倒人电极缓冲液，上槽 电极缓冲液面要高于短玻璃板．下槽电极缓冲液面要 高于铂金丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽；接通 电源．采用５００Ｖ稳压进行电泳．待甲基绿指示剂下移 至胶底部边缘时，关闭电源。倒出电极液，从电泳槽内 取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色 液中。在３Ｏ℃恒温条件下染色２～４ｈ。之后取出胶片，用 ０．５％的不加酶洗衣粉水洗净 ２．５结果计算 电泳测定值计算 待整个供检样品 电泳结束后．在观片灯上鉴定胶片上电泳谱带的特征 和一致性．计数供检样品粒数和非本品种粒数．并按公 专题论述 寸田种廿 式Ｘ ｆ％＇）：１００ｘ（供检样品一非本品种颗粒）／供检样品粒 数．计算电泳测定值Ｘ。 样品纯度值计算将电泳测定值Ｘ代人公式Ｙ＝ ５２．９＋０．４６１Ｘ．计算出样品纯度值Ｙ．再将Ｙ与ＧＢ ４４０４．１ 中的纯度值进行比较，判定样品是否合格。 ３盐溶蛋白质电泳常见谱带分析法 ３．１根据谱带特征、血缘关系和鉴定方法可将谱带 分为公共带和特征带两类 杂交种中均有公共谱带． 这些谱带由于起源进化的历史和生态条件相同．具有 数目不等的相同谱带，在鉴定工作中．可以不检查鉴 定这些谱带。不同品种的特征谱带具有重复性高、明 确可靠的特征．所以只要检查鉴别这些谱带就可以鉴 别品种。 ３．２按杂交种的谱带特征可将电泳谱带分为以下几 类 互补型谱带 杂交种具有来自母本谱带和父本谱 带的一种谱带类型．多数杂交种都呈此类型，也是杂交 种中最常见的 互补带呈多种形式表现，不同的杂交 种互补带有呈现１对、２对或者３、４对的；另外．来自 父母本的２条互补带间距也不同．有较宽和较窄的。 杂交型谱带 杂交种所具有而其父母本没有的谱带类 型．只有杂交种才具有的新产生的谱带。偏亲型谱带 杂交种谱带与双亲中的一种谱带相同．即同于母本谱 带型称偏母型．同于父本谱带称为偏父型。这种类型 的杂交种出现较少 新型谱带 这种类型在观察同一 品种不同子粒的谱带时偶尔发现有１粒或几粒表现出 其他杂交种不具有的一条谱带，而其他谱带相同．这种 情况应判断为杂交种。缺带型谱带在谱带观察时通 常会发现有１粒或几粒杂交种丢失的一条谱带．而其 他标志谱带相同，这可能是由于杂交不完全造成的。 正反交杂交种谱带通过试验表明．正反交杂交种谱 带是完全相同的．因为它们来自相同的亲本．遗传基础 相同．因此谱带表现形式一致 谱带的着色程度 在 谱带观察中．还可以借助同一胶版上父母本及其杂交 种谱带着色程度不同进行对比判断。一般杂交种着色 较深．双亲谱带着色较浅．这在判断是否为自交系时可 作为辅助参考 ４盐溶电泳常出现问题及解决办法 ４．１浓缩胶或分离胶聚合缓慢或不聚合 产生原因 可能是：试剂不纯；在试剂配制过程中各种试剂的用 量不准确：胶液过期；催化剂失效。解决办法：在配制 溶液时．应使用分析纯试剂：按照ＮＹ／Ｔ４４９～２００１规 定．按比例配制；应控制试剂配制数量，最好是即配即 用：此外还需注意试剂低温保存。 ４．２灌胶室时出现漏胶现象产生原因可能是：封底 不严；胶条两侧有缝隙。解决办法：在封底前用滤纸擦 干玻璃板及胶条上的水分。倾斜电泳槽，将足够量的分 离胶沿长玻璃板外侧倒入．左右晃动一下．使胶液均匀 分布于底部，不留空隙；在灌底胶时，放胶的速度要慢 一些．避免产生气泡 ４．３样槽制作不理想产生原因：在插入样梳时，插 入速度太快可使样孔底部产生气泡：在拔出样梳时。用 力不均匀使样孔撕破：在制作样槽时浓缩胶的灌人量 是关键因素。如果灌入浓缩胶的量不足．制成的样槽 低于短玻璃板．点样时样品容易漂流到旁边的样槽，造 成样品混合：如果灌人浓缩胶的量过多，多余的凝胶液 凝固后沉积在样孔处封住点样孔．不利于点样。解决 办法：插入样梳时小心，垂直插入。拔样梳时，应当用力 均匀，缓慢拔出样梳。以免撕裂样孔；控制好浓缩胶的 灌入量．量的多少应视样品梳的薄厚决定．一般灌人的 胶面应低于短玻璃板．在样梳插入后胶面与短玻璃板 的顶端刚好齐平 ４．４出现谱带不正常 谱带出现拖尾现象产生原 因：主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起 的。解决办法：如果是由于样品溶解效果不佳引起的 需要在加样前离心或加适量样品促溶剂：电泳缓冲液 使用时间长了．需要重新配制。凝胶聚合不充分．需要 延长凝胶聚合时间以使凝胶充分聚合 谱带出现弯曲 产生原因：当凝胶的中间部分 凝固不均匀．谱带出现两边翘起中间凹下现象。多出 现于较厚的凝胶中 谱带出现两边向下中间鼓起的 现象．一般是由于两板之间的底部间隙气泡未排除 干净。解决办法：如果谱带出现两边翘起中间凹下现 象．需等凝胶充分凝固再作后续实验：谱带出现两边 向下中间鼓起的现象．可在两板间加入适量缓冲液． 以排除气泡 ４．５ 已染色的蛋白质谱带又褪色 产生原因：染色液 多次利用和长期放置：染色剂试剂着色效果不是很好。 解决办法：固定与染色分离。分别配制三氯乙酸和考 马斯亮蓝溶液 将蛋白质谱带首先在三氯乙酸固定液 中固定３０ｍｉｎ以上．再放在清水盘内加几滴考马斯亮 蓝溶液染色 这样既可以使染色液和固定液多次重复 利用．又保证了染色效果。 ４．６电泳时间延长产生原因：多次重复使用电极缓 冲液：配制缓冲的蒸馏水不新鲜。解决办法：电极缓冲 液最好不要重复使用；如重复使用，可在使用前应测定 ｐＨ值，通过加入适量的乳酸将其调整到标准要求。用 呻固舯业 专题论述 作等白执旱性鲞足携掠＆ 法 段志龙王长军 （陕西省延安市农业科学研究所，延安７１６０００） 摘要：干旱是一个世界性问题。目前已在许多方面对作物抗 旱性进行了探讨．文章概述了作物适应干旱的机理．作物的生理 理抗性和结构特性以及生长发育进程的节奏与农业气 候因素变化相配合的程度决定的 植物的抗旱性由多 基因控制．也是多途径的 Ｌｅｖｉｔｔｌ３１认为植物适应干旱的 机理可分为３类：避旱ｆｄｒｏｕｇｈ ｔｅｓｃａｐｅ１、御旱（ｄｒｏｕｇｈｔ ａｖｏｉｄａｎｃｅ）和耐旱（ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏ ｌｅｒａｎｃｅ）．其中又把御旱性 和耐旱性统称为抗旱性ｆｄｒｏｕｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ１。Ｌｅｖｉｔｔ在对 作物适应干旱的机理进行了更进一步的分析之后指 代谢与抗旱性的关系． 并对已有的评价抗旱性的指标及方法 进行了分析。 关键词：作物：抗旱性；方法 世界上１／３的可耕地处于干旱或半干旱状态．其 他耕地也常受到周期性或难以预期的干旱而减产 干 旱是我国广大粮食产区的重要问题．表现在生长发育 的各个阶段，如种子萌发、营养生长和生殖生长，直到开 花结实。同时影响各种生理代谢过程，如光合作用，呼 吸代谢．水分和营养元素的吸收运转．各种酶的活性和 有机物质的转化、运输、积累等，是作物生产发展的重 出：避旱、高水势下耐旱、低水势下耐旱是作物适应干 旱的３种方式 避旱即通过调节生长发育进程避免干 旱的影响．高水势下耐旱是通过减少失水或维持吸水 达到的．低水势下耐旱的途径是维持膨压或者是耐脱 水或干化。其中．减少失水或耐干化的耐旱性都是以降 低产量为代价的 作物适应干旱的机理有３种：御旱、 耐旱和高水分利用效率 御旱主要通过扩展根系和调 节气孔来维持体内的高水势．耐旱的主要机制是渗透 调节，高水分利用效率的作物和品种则能够在缺水条 件下形成较高的产量 几位学者对作物适应干旱机理 的认识各有千秋．又不乏共同之处 现在人们引用最多 的是Ｌｅｖｉｔｔ的分类 要因素Ｉ１－２］。解决这一问题的途径，除了开辟水源、 节水灌溉以提高水的利用率之外。作物高产稳产的关 键之一就是改善作物本身的抗旱能力．即选育抗旱性 强、具有优良农艺性状的品种。由于遗传或长期适应的 结果．不同植物种类或品种会对干旱作出不同反应，这 就是植物抗旱性差异的根本性所在。能否准确、迅速地 鉴定亲本材料和高代品系的抗旱性．则关系到抗旱育 种的成败。本文综述了目前国内外科学家在不同作物、 不同生育期、不同水分胁迫处理下进行的形态、产量、 生理生化等方面的方法与指标的研究 ２干旱处理方法 要鉴定作物的抗旱性．首先要给作物创造一个适 当的干旱胁迫环境．然后选择恰当的指标来区分作物 间的抗旱性差异 目前主要有以下几种干旱处理方法。 ２．１不同干旱地区田间试验法将供试品种在不同 地区的旱地上栽种．以自然降水造成干旱胁迫．直接按 照作物产量或生长状况来评价品种的抗旱性 此方法 木爿ｃ木木术术术术木丰木术术木木木木木木术术术爿（术 １作物适应干旱的机理 一个品种在特定地区的抗旱性表现是由自身的生 基金项目：陕西省科学技术研究发展计划项目（２００７Ｋ０１－０９－０２） 木爿ｃ爿（木木术木）ｌｃ术术术术木术木木木木木木木木木术新鲜的蒸馏水，最好用重蒸水配制电极缓冲液。 ４．７前沿指示剂向相反方向移动产生原因：电泳时 前沿指示剂甲基绿不是沿电泳槽向下移动．而是向 上移动．几分钟后彻底从槽中消失了．这是由于把电 参考文献 【１】阮禹松，赵文明．种子盐溶球蛋白的结构特征．西北植物学报，２００２，２２ （４）：９９９￣１００３ ｆ２１吕素友，李树清．蛋白酶电泳技术在玉米杂交种纯度鉴定中的应用．农 业科技通讯，２００２，１：７ 源的正负极接错造成的。解决办法：盐溶蛋白质电泳 是在酸性条件下进行的．蛋白质带正电荷．向负极移 动。连接电源线时应注意短玻璃板接正极，长玻璃板 接负极 ［３］赖相红，李静，李冰，等．蛋白质电泳技术在品种鉴定和纯度检验上的 应用．农垦科技．２００３．４：３１－３３ 【４】苗艳玲．玉米蛋白质凝胶电泳中易出现的问题分析．中国种业。 ２００９，１ １：７７ ［５］李素力．玉米种子纯度盐溶蛋白电泳操作技术．中国种业，２００６，５：４８ ｆ收稿日期：２０１０—０６．１６１
