猪β干扰素成熟蛋白编码基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达与纯化

动物医学进展。２００６，２７（１２）：７５ｌｌ７８　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅ￣ｔｉｅｉｎｅ　猪Ｉ３干扰素成熟蛋白编码基因的　克隆及其在大肠埃希菌中的表达与纯化　吴　阳　。，李玲玲：～，李玉林　，李晨阳　。，王岁楼　（１．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州４５０００２；　２．河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７；３．河南省生物工程技术研究中心，河南郑州４５０００２）　中图分类号：￥８５２．４；Ｑ７８５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２００６）１２　００７５　０４　摘　要：从猪肝脏中提取基因组Ｉ）ＮＡ，利用　配合使用，增强免疫效果；也可以单独使用，提高动　ＰＣＲ法直接扩增了猪Ｊ３干扰素成熟蛋白编码　物的免疫机能。猪干扰素应用前景广阔，成为了近　基因。将ＰＣＲ产物亚克隆至ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）　株后进行测序。序列分析结果表明，克隆片．　段舍编码猪Ｊ３干扰素成熟蛋白质的４９５个核　苷酸，与ＧｅｎＢａｎｋ上（登录号：Ｓ４¨７８）的序　年来的研究热点　］。本研究直接扩增猪Ｂ干扰素　　／ｐＱＥ　。／ＩＦＮ口，　栽体，转化入大肠埃希茵Ｔ（　，筛选出阳性菌　成熟蛋白编码基因，构建工程菌Ｍ。表达的猪Ｂ于扰索仅带有额外的６×Ｈｉｓ纯化标签，　纯化方便，为猪Ｊ３干扰素的生产和应用奠定基础　ｌ材料与方法　列同源性达到１００　９／６。在此基础上，构建了猪　ｐ干扰素原核表达载体ｐＱＥ。。／ｐｏｌＦＮ—ｐ并转　化入大肠埃希菌Ｍ　该工程菌在３７℃经　０．０３　ｍｍｏｌ／Ｉ　ｌＰＴＧ诱导４　ｈ后，进行ＳＩ）Ｓ　１．１　材料　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ　ＴＧｌ菌株，ｐＧＥＭ一７Ｚ　ｆ（＋），ｐＱＥ　ｏ　质粒由本实验室保存。性核酸内切酶，Ｔ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ购自华美生物工程公司；Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，　尸　ＤＮＡ聚合酶，核酸分子质量标准购自ＴｉａｎＧｅｎ　ＰＡＧＥ电泳，结果在分子质量约２ｏ　ｋｕ的位　公司；核酸纯化试剂盒（Ｗｉｚａｒｄ＠ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　置出现了明显的目的蛋白条带，表达产物主　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；金属亲和　要以包涵体形式存在。经凝胶分析软件　层析介质（Ｈｉ　Ｆｒａｐ　ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　ｃｏｌｕｍｎ）购自　Ｂａｎｄｓｃａｎ分析，表达产物约占茵体总蛋白的　Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；其他试剂均为分析纯。新鲜猪肝取　ｌ８　９／６。包涵体用６　ｒｎｏｌ／Ｉ　盐酸胍溶解，经过　自郑州市郑荣肉联厂。　Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析法纯化．获得了纯度较高　１．２　基因组Ｉ）ＮＡ提取　的目的蛋白，为下一步对猪Ｊ３干扰素进行复　性及活性研究打下了基础。　参照文献［８］的方法从新鲜猪肝组织中提取基　因组Ｉ）ＮＡ。　关键词：猪Ｊ３干扰素成熟蛋白；基因克隆；原　】．３　引物设计与基因的扩增　核表达；亲和纯化　调节细胞生长和免疫调节功能的细胞因子［Ｊ　］。目　根据ＧｅｎＢａｎｋ上（登录号：Ｓ４１１７８）发表的猪口　ｍｅｒ５．０　干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）是一类具有抗病毒、　干扰素的基因序列，利用引物设计软件Ｐｒｉ设计一对引物（Ｐ１和Ｐ２）扩增猪０干扰素成熟蛋白　划线部分为酶切位点）。　上游引物Ｐ１；５＂－ＣＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＴＧＣ　ＴＴＣ　Ｇ一３　（Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ）　前已知的猪干扰素有ａ，ｐ和　３种，其中ａ和ｐ属于　编码基因。引物由三博远志公司合成，序列如下（下　Ｔ型，　属于ｎ型。猪Ｇ干扰素全基因为５６１　ｂｐ，编　码１８６个氨基酸，其中前２１个氨基酸为信号肽，后　ｌ６５个氨基酸为成熟蛋白［　２。＿　猪病毒性疾病一直是困扰我国养猪业的一大问　题，给我国养猪业造成了很大的经济损失。试验表　下游引物Ｐ２：５．－ＣＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣ＂ｉ、Ｃ人（　ＴＴＣ　ＣＧＧ　ＡＧＧ　Ｉ＇ＡＡ　ＴＣＴ　Ｇ一３　（ＥｃｏＲ　１）　明，猪水疱性口炎病毒、猪流感病毒、猪轮状病毒等　都对猪８干扰素敏感［５ｊ。猪８干扰素既可以与疫苗　收稿日期：２００６—０９—１１　以从猪肝中提取的猪基因组Ｉ）ＮＡ为模板，用　ＰＹ“ＤＮＡ聚合酶进行扩增，反应条件为：９４。Ｃ预变　作者简介：昊　阳（１　９８０一）．男．湖北随州人．硕士研究生．主要从事生物制药研究。＊通讯作者。　维普资讯 http://www.cqvip.com

７６　动物医学进展２００６年第２７卷第１２期（总第１５９期）　性５　ｍｉｎ；９４℃变性５０　ｓ，５５　Ｃ退火５Ｏ　ｓ，７２℃延伸　５０　ｓ，循环扩增３Ｏ次；最后７２℃延伸５　ｍｉｎ。　液（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００，０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ（ＰＨ　８．５），０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，０．１５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１）搅　１．４产物的克隆及测序　猪Ｂ干扰素ＰＣＲ产物用核酸纯化试剂盒回收　拌洗涤，然后以１０　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１０　ｍｉｎ，弃上清，　收集沉淀包涵体。包涵体用变性缓冲液（６　ｍｏｌ／Ｌ　后与ｐＧＥＭ一７Ｅｌ（＋）质粒载体均用ＥｃｏＲ　Ｉ和　／３ａｍＨ　Ｉ酶切，然后把酶切后的猪Ｂ干扰素基因和　载体连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＧ　菌株，涂于含有Ｘ－ｇａｌ和　ＩＰＴＧ的氨苄青霉素抗性ＬＢ平板，３７　Ｃ培养过夜。　筛选白色菌落，先用菌落ＰＣＲ法鉴定，然后提取质　粒，用ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｂａｒｎ　Ｈ　Ｉ酶切鉴定。阳性质粒送北　京奥科生物技术公司测序。　１．５　猪Ｉ３干扰素原核表达载体的构建　将重组质粒ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）／ｐｏＩＦＮ—Ｂ用／３ａｍ　Ｈ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｔ酶切，用核酸纯化试剂盒回收ｐｏＩＦＮ—Ｂ　基因片段，插入ｐＱＥ　。质粒的ＢａｍＨ　Ｉ和＆　Ｉ位　点。所构建的质粒命名为ｐＱＥ。。／ｐｏＩＦＮ—Ｂ，转化　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＧ。菌株，先用菌落ＰＣＲ法鉴定，然后提取　质粒，用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｈｉｎｄ　ｒｌｌ酶切鉴定。将阳性质粒　转化Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ，。菌株，涂含有氨苄青霉素和卡那霉　素的ＬＢ平板。挑取单克隆，接种于３　ｍＩ　含有氨苄　青霉素和卡那霉素的Ｉ　Ｂ液体培养基的试管中，于　３７℃、２ＯＯ　ｒ／ｒａｉｎ摇床培养过夜。　１．６　诱导表达　小样诱导，优化条件：分别将１００　Ｌ活化的　Ｍ　。／ｐＱＥ∞／ＩＦＮ—Ｄ菌液接种于５支３　ｍＬ含有氨苄　青霉素和卡那霉素的ＬＢ液体培养基的试管中，编　号为１号～５号。于３７℃、２ＯＯ　ｒ／ｒａｉｎ摇床培养至　ＯＤ６　约为０．６～０．７。加入ＩＰＴＧ开始诱导，１号　和２号的诱导浓度分别为０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ和　０．３　ｍｍｏｌ／Ｌ，于２５℃、２ＯＯ　ｒ／ｒａｉｎ培养１２　ｈ；３号和　４号的诱导浓度分别为０．０３　ｍｍｏｌ／Ｉ　和　０．３　ｍｍｏｌ／Ｌ，于３７℃、２００　ｒ／ｒａｉｎ培养４　ｈ。５号于　３７℃、２ＯＯ　ｒ／ｒａｉｎ培养４　ｈ，作为未诱导对照。　大样诱导，按０．０３　ｍｍｏｌ／！　ＩＰＴＧ，于３７℃、４　ｈ　的培养条件做１　Ｌ摇瓶发酵。　１．７　表达产物的提取与纯化　将ｌ　Ｌ发酵液以５　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１０　ｒｎｉｎ，收集　菌体，再用０．０２　ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ（ｐＨ　７．８）缓冲液洗　涤，以５　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１０　ｒａｉｎ，弃上清。将菌体用　０．０２　ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ（ｐＨ　７．８）缓冲液重悬，超声波裂　解。将裂解液以１０　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１０　ｒａｉｎ，收集沉　・淀即初制猪Ｂ干扰素包涵体。将初制包涵体用洗涤　盐酸胍，０．３　ｍｏｌ／Ｌ氯化钠，０．０２　ｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲　液，ｐＨ　７．８）溶解。以１０　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｍｉｎ后收　集上清备用。Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析柱先用０．０２　ｍｏｌ／Ｌ　的ＰＢＳ（ｐＨ　７．８）缓冲液平衡，再用变性缓冲液平　衡。将蛋白液上样于层析柱，先用含０．０５　ｍｏｌ／Ｌ眯　唑的变性缓冲液洗涤，然后用含０．２　ｍｏｌ／Ｌ咪唑的　变性缓冲液洗脱，并分段收集。　２　结果　２．１　猪Ｉ３干扰素基因的克隆及测序　以从新鲜猪肝细胞中提取的总ＤＮＡ为模板，　应用引物Ｐ１和Ｐ２，进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物经琼　脂糖凝胶电泳后可见一条约５００　ｂｐ的条带，与预期　相符（图１）。重组质粒ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）／ｐｏＩＦＮ—Ｂ测　序结果表明，克隆基因片段序列与ＧｅｎＢａｎｋ上（登　录号：￥４１１７８）发表的猪Ｄ干扰素成熟区的基因序列　完全一致。　２．２表达载体的构建　用Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｉ酶切重组质粒ｐＧＥＭ一　７Ｚｆ（＋）／ｐｏＩＦＮ—ｐ，将回收后的ＩＦＮ—ｐ基因片段插入　ｐＱＥ　。质粒的Ｂ　Ｈ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ位点之间。对所构　建的质粒ｐＱＥ　。／［ＦＮ一日，用ＢａｍＨ　Ｉ和Ｈｉｎｄ　ｒｌｌ酶切　鉴定，结果与预期一致（图２）。　２．３表达条件的优化　工程菌Ｍ。。／ｐＱＥ。。／［ＦＮ—Ｊ３在不同条件下诱导　培养后，取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳（图３）。　分析不同诱导条件下的电泳条带可知，在　３７℃、０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４　ｈ的诱导培养条　件最佳。低温并没有增加表达产物的水溶性，较高　的诱导剂浓度也对表达产生了抑制。　２．４表达产物的纯化　工程菌发酵液离心收集后进行纯化，从ＳＤＳ－　ＰＡＧＥ电泳结果可以清晰地看出在相对分子质量约　２Ｏ　ｋｕ处有明显的目的蛋白条带，表达产物主要以包　涵体形式存在。经凝胶分析软件Ｂａｎｄｓｃａｎ分析，表　达产物约占菌体总蛋白的１８％。包涵体用６　ｍｏｌ／Ｌ　盐酸胍溶解，经过Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析法纯化，获得了　纯度较高的目的蛋白（图４）。　维普资讯 http://www.cqvip.com

吴　阳等：猪８干扰素成熟蛋白编码基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达与纯化　７７　２　３　４　２　０００　ｂｐ　２　０００　ｂｐ　１　０００　ｂｐ　１　０００　ｂｐ　７５０　ｂｐ　７５０　ｂｐ　５００　ｂｐ　５００　ｂｐ　２５０　ｂｐ　２５０　ｂｐ　１００　ｂｐ　１００　ｂｐ　１．ＤＮＡ标准ＤＩ　２　０００；２．ＰＣＲ产物　１．ＤＮＡ标准ＤＬ　２　０００；２．ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）／ｐｏｌＦＮ—Ｂ的ＢａｍＨ　Ｉ＋Ｘｈｏ　Ｉ酶　切产物ｔ３．ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）的ＢａｍＨＩ＋　０　Ｉ酶切产物１４．ｐＱＥ３ｏ／ｐｏｌＦＮ—日　的ＢａｍＨ　Ｉ＋Ｓａｌ　Ｉ酶切产物ｌ５．ｐＱＥ３ｏ的ＢａｍＨ　Ｉ＋Ｓａｌ　ｌ酶切产物　１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＩ　２　０００｛２．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００　ｌ　２．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐＧＥＭ　７Ｚｆ（＋）／ｐｏｌＦＮ一日　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＢａｍＨＩ＋Ｘｈｏ　Ｉ｝３．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐＧＥＭ一７Ｚｆ（＋）ｍｍＨ　Ｉ＋　Ｘｈｏ　Ｉ；４．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐＱＥ３ｏ／ｐｏｌＦＮ　Ｂ　ＢａｒｎＨ　Ｉ＋Ｓａｌ　Ｉ　Ｉ　５．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐＱＥ３ｏＢａｍＨ　Ｉ＋＆　ｌ　图ｌ　ＰＣＲ产物凝胶电泳　图２重组载体酶切电泳　Ｆｉｇ．１　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒ０ｐｈ０ｒｅｓｉｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｆｉｇ．２　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　４　５　６　７　８　９　４　７２．６　ｋＵ　４７　０　ｋｕ　３３．６　ｋｔｌ　２４．０　ｋｕ　２ｌ　６　ｋｕ　Ｉ４　４　ｋＵ　１～２．２５℃，０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｉｔ　ＴＧ诱导１２　ｈ的菌体裂懈液　１．蛋白分子质量标准；２．诱导的全菌裂解物；３．诱导菌的　清ｌ　的上清　沉淀；３～４．２５　Ｃ，０．３　ｍｍｏｌ／１　ＩＰＴＧ诱导１２　ｈ的菌　４．诱导菌的沉淀；５．Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析纯化的猪口一干扰索　体裂解液的上清　沉淀｛５～６．３７℃．０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导　４　ｈ的菌体裂解液的上清与沉淀ｌ　７～８．３７℃．０．３　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ　诱导４　ｈ的菌体裂解液的卜清与沉淀；９．未诱导的全菌裂解物　１—２．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｙｓａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　２５℃．　１．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ；２．Ｗｈｏｌｅ　ｅｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，１２　ｈ；３－４．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓｌ　３．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓｔ　４．Ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｙｓａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　２５　ｕｃ．０．３　ｍｍｏｌ／Ｌ　１ＰＴＧ，１２　ｈｌ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓ；５．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｆ一　…　ｂｙ　Ｎｉ—ＮＴＡ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　５－６．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｙｓａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　３７℃。　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ・４　ｈ：７－８．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｙｓａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　３７℃．０．３　ｍｍｏｌ／Ｉ　ＩＰＴＧ．１２　ｈｌ　９．Ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｎｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓ　图３　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ｐｏｌＦＮ一８在不同条件下的表达　图４　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ｐｏｌＦＮ—Ｂ的纯化　Ｆｉｇ．３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌＦＮ一日ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　Ｆｉｇ．４　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌＦＮ一口ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　维普资讯 http://www.cqvip.com

７８　动物医学进展　２００６年第２７卷第ｌ２期（总第１５９期）　３讨论　一步对猪ｐ干扰素进行复性及活性研究奠定了基　本研究从猪肝脏中提取基因组ＤＮＡ，利用ＰＣＲ　础。　法直接扩增了猪ｐ干扰素成熟蛋白编码基因。此法　参考文献　比先扩增出猪ｐ干扰素全基因后，再设计引物亚克　［１］　Ｓｅｎ　Ｇ　Ｃ。Ｌｅｎｇｙｅｌ　Ｐ．Ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａ　ｂｉｒｄ’ｓ　ｅｙｅ　ｖｉｅｗ　ｏｆ　隆其成熟蛋白编码基因更简便［　。测序结果表明，　ｉｔｓ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ。１９９２。２６７（８）ｌ５Ｏ１７—５０２０．　本试验克隆的猪０干扰素成熟蛋白编码基因与Ｇｅｎ—　［２］　Ｓａｍｕｅｌ　Ｃ　Ｅ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｆｅｒ０ｎｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　Ｒｃｖ．２００１，１４（４）：７７８　８０９．　Ｂａｎｋ上（登录号：Ｓ４１１７８）发表的猪０干扰素成熟蛋　［３］　Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ　Ｋ，Ｇｏｂｌ　Ａ。Ｌｉｎｄｅｒｓｓｏｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　白编码基因同源性为１００　９，６，说明猪０干扰素成熟蛋　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ｂｅｔａ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　白编码基因是相当保守的。　Ｒｅｓ．１９９２．１２（３）：１５３－１６０．　考虑到尽量减少对猪０干扰素表达活性的影　［４］　夏春。刘　津。杨琪，等．猪干扰素Ｂ基因的分子克隆与序　响，同时方便纯化。本研究将猪０干扰素基因克隆　列测定ｒＪ］．中国兽医杂志，２０００．２６（６），６－７．　［５］　Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ　Ｊ　Ｂ．Ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｖｉ—　到原核表达载体ｐＱＥ　。中，成功表达了Ｎ端带有６×　ｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｃａｎ　Ｊ　Ｖｅｔ　Ｒｅｓ，１９８９，５３（１）ｔ　５２・５５．　Ｈｉｓ纯化标签的猪０干扰素，带有６×Ｈｉｓ纯化标签　［６］　Ｂｒｏｗｎ　Ｃ　Ｃ。Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ　Ｊ。Ｇｒｕｂｍａｎ　Ｍ　Ｊ．Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　的猪０干扰素能够利用Ｎｉ—ＮＴＡ亲和层析法纯化。　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃａｔｔｌｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆｏｏｔ．－ａｎｄｎ－ｍｏｕｔｈ　初步研究了温度，诱导剂浓度对表达的影响。结果　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ，ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ／ｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｎ　Ｊ　表明低温并没有促进产物的水溶性表达，较高的诱　Ｖａｔ　Ｒｃｓ．２０００，６４（２）ｌ　１３０—１３３．　导剂浓度也对表达产生了抑制，表达的最佳条件为。　营瑞慝．周国栋，周海霞．等．猪Ｂ　Ｆ扰素在毕赤酵母中的分泌　表达及　对伪狂犬病毒的抑制作用ｆＪ］．微生物学报，２００６，４６　３７℃，０．０３　ｍｍｏｌ／Ｉ　ＩＰＴＧ诱导培养４　ｈ。表达产物　（３）ｔ　７９　８４．　主要以包涵体形式存在，约占菌体总蛋白含量的　［８］　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｄ　Ｗ．分子克隆实验指南（第３版）［Ｍ］．黄　１８　。包涵体用８　ｍｏｌ／Ｌ尿素仍不能完全溶解，而　培堂。等．译．北京。科学出版社。２００２，４８３—４８５．　能在６　ｍｏｌ／ｌ　盐酸胍中完全溶解，经过Ｎｉ～ＮＴＡ亲　［９］　曹瑞兵。包晶晶，周海霞，等．猪Ｂ干扰索的原核表达及其对流　和层析法纯化，获得了纯度较高的目的蛋白，为下　行性腹泻病毒的抑制作用研究［Ｊ］．中国病毒学，２００４，１９（４）一　３６４—３６８．　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ。ｐ　Ｍａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ　ｉａ　ｃｏｌｉ　ＷＵ　Ｙａｎｇ　～，ＬＩ　Ｉ　ｉｎｇ—ｌｉｎｇ。～，ＬＩ　Ｙｕ—ｌｉｎ　，ＬＩ　Ｃｈｅｎ—ｙａｎｇ　～，ＷＡＮＧ　Ｓｕｉ—ｌｏｕ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｙ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ３，Ｅｎｇ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖ．ｏＪ　Ｌｉｇｈｔ　ｌｎｄ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ．４５０００２．Ｃｈｉｎａｌ　Ｚ．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｙ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｍ’ｅｓ。Ｈｅｎｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｘｉｎｘｉａｎｇ，Ｈｅｎａｎ，４５３００７，Ｃｈｉｎａ　ｌ　３．Ｈｅｎａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ。Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ。Ｈｅｎａｎ．４５０００２．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ一　８（ｐｏｌＦＮ一１３）ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｂ—ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）　ｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＧ１．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｐｏｌＦＮ一０　ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ　４　９　５　ｂｐ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　１　００　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｏｌＦＮ一８　ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＧｅｎＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｓ４１１７８）．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＱＥ３０ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５．Ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｔ　３７℃ｆｏｒ　４　ｈｏｕｒｓ　ｂｙ　ａｄｄｉｎｇ　ＩＰＴＧ　ｔｏ　ａ　ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎ—　ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　０．０３　ｍｍｏｌ／Ｌ，ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂａｎｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　２０　ｋｕ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｍａｉｎｌｙ　ｉｎ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｗｈｉｃｈ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　ａｂｏｕｔ　１８％ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｉｎ　６　ｍｏｌ／Ｌ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｐｕｒｌ—　ｌｆｅｄ　ｂｙ　Ｎｉ—ＮＴＡ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｉｇｈｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｏｌＦＮ一８　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｓｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｂａｓｉｃ　ｗｏｒｋ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｐｏｌＦＮ一８’ｓ　ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ一０　ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｆｆｉｎｉｔ　ｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ