利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成

利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成

杨宇,吴元华3,郑雅楠　(沈阳农业大学植物保护学院,辽宁沈阳110161)

摘要　重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法。该技术在目的基因的人工合成及外源蛋白在宿主中的高效表达等方面显示出良好的应用前景。综述了重叠延伸PCR技术的原理、反应条件的优化及其应用。关键词　重叠延伸PCR;基因合成中图分类号　Q7　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2006)09-1810-02AmplificationofDNASequencewithOverlap2extensionPCR

YANGYuetal　(PlantProtectionCollegeofShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning110161)Abstract　GenesplicingbyoverlapextensionisanapproachforrecombiningDNAmoleculesatprecisejunctionsirrespectiveofnucleotidesequencesattherecombinationsite.Theprimersaredesignedsothattheendsoftheproductscontaincomplementarysequences.Whenthetwoproductsaremixed,de2natured,andreannealed,thestrandshavingthematchingsequencesattheir3’endsoverlapandactasprimersforeachother.Thissimpleandwidelyap2plicableapproachhasgreatadvantagesoverotherrecombinantDNAtechniquesinsynthesisofgene.Thisarticlesummarizedtheprinciple,reactioncondi2tions,andapplicationsoftheSOE2PCR.Keywords　SOE2PCR;Synthesisofgene

　　DNA的人工合成一直是基因研究工作的重要环节,目前获得目的基因的方法主要有2种:一种为采用PCR的方法直接对模板的目的区域进行扩增;另一种为利用DNA合成仪器直接合成单链的DNA片段。前者在大量制备DNA时要求事先具备高质量的DNA模板,后者在保证合成质量的前提下,合成的DNA片段长度一般不超过90bp。若想获得一段长度大于100bp的基因片段,又没有合适的DNA模板,以上

2种方法显然都不合适。19年,Horton等成功建立了重叠

接,这种方式主要适用于小片段基因(<400bp)的合成(图

1a)。②核心模板方式,由Donato等[4]提出,引物的设计从目

的基因的中间开始,每一轮的反应以中间合成的片断为模板,以两端片段为引物,每一轮的PCR反应均为从中间向两头延伸的过程(图1b)。重叠延伸PCR反应引物的设计通常要注意以下2个方面:①引物的长度。考虑到合成每个碱基的成本以及连续反应的次数,每条寡聚核苷酸链的长度在75～80个碱基较好,长度过长不利于合成,长度过短则会增加反应次数,提高成本。②引物间重叠区域的选择。相连引物间的重叠区域以25～30个碱基为宜,重叠区域中应尽量避免富含AT(ATTTA、AATAA、AATTAA等)[5]的序列。在片段合成过程中,接头区富含AT的区域极易发生错配[6]。同时在引物设计中,需考虑引物Tm值的控制,避免出现2级结构及引物二聚体等。

延伸PCR(genesplicingbyoverlapextension:SOE2PCR)技术,并应用该技术成功地构建了一种杂交基因[1]。1999年姚泉洪等根据重叠延伸PCR技术的原理提出了“连续延伸PCR基因合成法”,成功合成了透明颠菌血红蛋白基因[2,3]。自20世纪90年代至今,随着分子生物学技术的迅猛发展,重叠延伸PCR技术经过不断的实践与改进已日渐成熟,并在多个研究领域得以应用。

1　重叠延伸PCR技术的原理

重叠延伸PCR技术是根据目的基因的核苷酸序列,将目的基因分成70～90bp不等的多条引物,分段进行合成,利用相连片段间20～30bp重叠的核苷酸部分互相搭桥、互为模板,通过几轮连续的PCR反应将各个片段组合成为目的基因。

2　重叠延伸PCR反应条件的优化

在PCR反应中,反应液的组成及热循环反应条件的优化是决定反应成败的关键,对于重叠延伸PCR反应而言更是如此。同一般PCR反应相比,重叠延伸PCR反应在引物的设计、缓冲液成分及循环条件上均有所不同。

2.1　引物的设计　在重叠延伸PCR反应中,引物的设计是

整个实验最重要的一个环节,引物的设计对PCR反应的成功与否起着决定性的作用。目前,重叠延伸PCR反应引物设计的方式根据所合成基因的长短主要有2种:①将目的基因拆分成若干条寡聚核苷酸片段后,全部放在一起进行退火、拼

作者简介　杨宇(1981-),男,辽宁沈阳人,硕士研究生,研究方向:植物

病害的生物防治。3通讯作者。

收稿日期　2006202213

图1　引物的设计原理

2.2　Taq酶的选择　为了最大限度地避免碱基的错配,重叠

延伸PCR反应一般采用高保真DNA聚合酶。高保真DNA

聚合酶(Pfu)不仅具有一般Taq酶5′～3′聚合酶的活性,还具有3′～5′外切酶的活性。在连续延伸反应中,高保真聚合酶可有效地校正扩增产物末端的错配碱基。传统的Pfu虽具有较好的校正能力,但其扩增效率一直难以令人满意。近年

34卷9期　　　　　　　　　　　　　　杨宇等　利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成1811

来,一些既具有校正功能又具有很强延伸能力的DNA聚合酶已陆续被开发应用。

目前已有多家公司推出了高保真DNA聚合酶与高保真扩增试剂盒,如TLIDNAPolymerase(Promege公司);KODDNA

Polynerase、KODPlus(Toyobo公司);PyrobestNAPolymerase(Takara公司)等,这些新型聚合酶的使用,极大地提高了重叠

中国农科院罗会颖等采用此方法对来源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因进行改造,同样获得了高效表达的重组酵母菌转化子[5]。

4　展望

重叠延伸PCR反应技术从建立开始就得到世界各国学者的关注,它的建立使得长链DNA的人工合成变为可能,促进了对基因及其功能的研究水平的提高。经过十几年不断的实践与总结,重叠延伸PCR方法的体系已日趋成熟,重叠延伸PCR已在许多研究领域发挥重要作用。但是,作为一种没有标准化反应条件的技术体系,重叠延伸PCR技术在应用过程中还存在很多问题需要解决,例如:最合适的引物长度,最佳连续延伸的循环数,还有对合成进度合理的分步控制等等。这些问题还需要进行系统的研究,才能为该技术的应用提供更有力的理论支持。

重叠延伸PCR反应体系为许多基因、蛋白方面的研究开拓了新思路。相信随着对其研究的不断深入,标准化反应体系的建立以及保真性更高的DNA聚合酶的出现,重叠延伸

PCR反应也会逐渐成为分子生物学的常规研究方法,并发挥

延伸PCR反应的效率与准确性。

2.3　Mg2+　Mg2+是DNA聚合酶活性的依赖离子,其浓度不

仅影响酶的活性与准确性,而且会影响到引物的退火、二聚体的形成以及扩增产物的特异性。Mg2+浓度过低会影响聚合酶活性,过高会造成非特异性扩增[7]。常规PCR反应的

Mg2+浓度在1.5～2mmol/L,有研究表明:Pfu聚合酶的忠实

度在Mg2+浓度为2.0mmol/L时最高,且忠实性随着Mg2+浓度的增加而降低[8]。重叠延伸PCR中通常采用的方法是:在保证产物扩增效率及特异性的前提下,尽可能降低Mg2+的浓度,以最大限度地提高DNA聚合酶的保真性。2.4　热循环条件　对于重叠延伸PCR反应,变性温度不宜

过高,时间不宜过长,高温会损伤DNA,造成DNA酶终止合成。反应的退火温度因引物而异,在保证产物扩增效率的前提下,应尽量提升退火温度以提高产物特异性,为下一轮

PCR反应提供高质量的模板。在具体实验过程中,可采用梯

越来越重要的作用。参考文献

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度退火的方法来摸索最佳退火温度。考虑到DNA聚合酶的扩增效率、错配率以及PCR的诱导错配效应,每一轮反应的循环数控制在20～25个为宜。循环次数过多,碱基错配的几率增大;循环次数太少,则得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。

2.5　其他因素　重叠延伸PCR反应应使用厚度均匀的薄壁

管,反应体系不宜过大,以免影响热传导效率。一次连续延伸的几轮反应最好在同一PCR仪上完成。不同的PCR仪对反应结果会有影响,相同的扩增条件在不同的PCR仪上可能得到不同的结果[9],估计是由于不同仪器热循环过程中升降温速率不同造成的。

3　重叠延伸PCR反应技术的应用

目前,重叠延伸PCR反应主要应用在目的基因的人工合成、氨基酸密码子的改造以及外源蛋白在宿主中的高效表达等研究领域。例如:袁盛凌等应用核心模板的方式对毒蛇类凝血酶CalobincDNA序列进行了人工合成[6];王秀利等对人降钙素基因进行了合成[10];王宝利等利用重叠延伸PCR技术合成了人骨保护素N端编码序列[11];中国科学院微生物所张朝春等应用连续延伸PCR对编码神经营养素-3基因的密码子进行了优化[12],提高了其在毕赤酵母中的表达量;

　　科技论文写作规范———题名

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