环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

姓名：梁建军申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学

指导教师：宋发军

20090501

中南民族大学硕士学位论文

摘 要

环糊精（Cyclodextrin），简称CD，它是由D-葡萄糖以α-1，4糖苷键连接成的环状低聚糖，根据聚合度分为α，β和γ-CD，它们的聚合度分别为6、7和8，其中β-CD在各个领域中的应用最广。本文首先合成了β-CD的对甲苯磺酰氯衍生物(β-CD-6-OTs)。其次，进行了β-CD-6-OTs与生物分子相互作用的研究。同时，还研究了羟丙基环糊精与生物大分子以及有机小分子之间的相互作用，为研究β-CD及其衍生物作为模拟酶以及在分子识别、分子间的相互作用提供一些理论和实践基础。

1.β-CD-6-OTs与核糖核酸酶相互作用：用β-CD-6-OTs分别与核糖核酸酶以及经变性复性的核糖核酸酶相互作用，以核糖核酸为底物进行酶促反应，研究β-CD-6-OTs对酶促反应的影响。结果表明：β-CD-6-OTs具有较强的催化活性，比同浓度的核糖核酸酶催化活性要高2.1倍；β-CD-6-OTs能与核糖核酸酶结合形成的非共价修饰物，在核糖核酸酶变性处理后更容易与之结合，形成的非共价修饰物具有比核糖核酸酶的催化活性要高8.8倍；

2．羟丙基环糊精与酶分子间的相互作用：用羟丙基环糊精分别与胃蛋白酶、核糖核酸酶、淀粉酶、胰蛋白酶相互作用，研究其对酶促反应的影响。结果表明：HP-β-CD与核糖核酸酶形成的非共价修饰物比核糖核酸酶的催化活性要高27%；HP-β-CD与胃蛋白酶形成的非共价修饰物比胃蛋白酶的催化活性降低了21.3%；HP-β-CD与淀粉酶形成的非共价修饰物比淀粉酶的催化活性要高46.8%；HP-β-CD与胰蛋白酶形成的非共价修饰物是胰蛋白酶的催化活性的3.2倍；

3．羟丙基环糊精与三聚氰胺分子间的包结作用：结果表明羟丙基环糊精与三聚氰胺分子间能形成稳定的包合物；形成包合物的摩尔包合比为1:1；

4. 羟丙基环糊精对冬凌草甲素相互作用的研究 ：结果表明HP-β-CD在水中能与冬凌草甲素(ORD)形成稳定的包合物；HP-β-CD与ORD形成包合物的摩尔包合比为1:1；包合物的溶解度是 ORD的溶解度的1.46倍。

关键词：环糊精；羟丙基环糊精；三聚氰胺；冬凌草甲素；

I

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

Abstract

Cyclodextrin (CD) is cyclic oligosaccharide of glucose which is formed by 1,4-glucoside bonds. CD has three formations and β-CD with polymerization degree 7 is the most widely used formations. In the presented thesis, we studied the interaction of the derivatives of β-CD and bio-macromolecular or organic chemicals. Firstly, we synthesized the β-CD-6-OTs through reaction between p-toluene sulfonyl chloride and β-CD. Secondly, we studied interaction between β-CD-6-OTs and organic chemicals such as melamine and oridonin. β-CD-6-OTs can form 1:1 (mol ratio) catharses with these two chemicals, which can increase solubility of melamine and oridonin. Thirdly, we studied interaction between β-CD-6-OTs and enzymes, such as ribonuclease, pepsin, amylase and trypsin. At the presence of β-CD-6-OTs, the activity of ribonuclease elevate 2.1 times. The non-covalent complex between β-CD-6-OTs and enzymes showed higher activity than pure enzymes. The results show that ribonuclease complex has 8.8 times activity than pure ribonuclease; amylase and trypsin complex increase their activities 46.8%, and 27% respectively；only pepsin complex decrease activity 21.3%. From the present study, we know that β-CD derivatives show excellent performance to improve activities and solubility of enzymes and organic chemicals.

Key words：cyclodextrin; hydroxypropylcyclodextrin; melamine; oridonin

II

中南民族大学学位论文原创性声明

本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

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日期： 年 月 日

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第一章 绪 论

1.1环糊精简介

环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6~12个D-吡喃葡萄糖单元。其中研究得较多并且具有实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α、β和γ-环糊精(图1.1)。根据X-线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果，确定构成环糊精分子的每个D(+)- 吡喃葡萄糖都是椅式构象。各葡萄糖单元均以1，4-糖苷键结合成环。由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，环糊精不是圆筒状分子而是略呈锥形的圆环。其中，环糊精的伯羟基围成了锥形的小口，而其仲羟基围成了锥形的大口。

由于环糊精的外缘(Rim)亲水而内腔(Cavity)疏水，因而它能够象酶一样提供一个疏水的结合部位，作为主体(Host)包络各种适当的客体(Guest)，如有机分子、无机离子以及气体分子等。这种选择性的包络作用即通常所说的分子识别，其结果是形成主客体包络物(Host-Guest Complex)。环糊精是迄今所发现的类似于酶的理想宿主分子，并且其本身就有酶模型的特性。因此，在催化、分离、食品以及药物等领域中，环糊精受到了极大的重视和广泛应用。

图1.1 β-环糊精分子结构

1.2 β-环糊精

根据X-射线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果，确定构成环糊精分子的每个D(+)- 吡喃葡萄糖都是椅式构象。各葡萄糖单元均以1，4-糖苷键

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结合成环，且连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，环糊精不是圆筒状分子而是略呈锥形的圆环。其中，环糊精的伯羟基围成了锥形的小口，仲羟基围成了锥形的大口。 由于β-环糊精中各个葡萄糖单元皆处于椅式构象，其C-2和C-3原子上的伯羟基都位于锥形环较大的开口端，C-6上的伯羟基则处在锥形环较小的开口端，所以β-环糊精分子的外侧是亲水的。虽然在β-环糊精空腔中的一圈糖苷键上含有氧原子，但它们处于空腔内侧C-H键的屏蔽之下，故β-环糊精内空腔是疏水的。β-环糊精这种独特的内疏水、外亲水结构以及能与多种底物形成包结复合物,极似酶的性质，这使得环糊精不仅在模拟酶、手性分离、主-客体化学、分子识别、光谱探 针等领域显示了重要的理论价值，更在医药﹑食品化妆品﹑环境保护等领域显示出重要的使用价值。β-环糊精分子和底物的结合常数通常可达104mol・L- 1 , 但是不及某些酶对底物的结合常数大。由于β-环糊精在水中具有一个完整的氢键网络，且它的锥形圆环结构呈对称并有刚性，使它在水中的溶解度特别小，以致了它的应用；另外，β-环糊精上羟基的催化能力也有限的。因此，近年来，以环糊精作为母体的模拟酶研究工作过去主要集中在对环糊精的结构修饰上,即在环糊精的两个面上引入其他的催化功能基团,通过引入柔性或刚性的疏水基团,进而改善环糊精的疏水结合能力和催化功能,这样得到的修饰环糊精通常具有单包结部位和双重识别作用。这些衍生物对底物具有多部位包结作用,故具有多重识别功能,可以实现酶促反应的高效性和高选择性，从而在很大程度上改善β-环糊精的性能，使其在各个领域的应用更具有优越性。

1.3 羟丙基环糊精

羟丙基环糊精(Hydroxypropylcyclodextrin, HPCD)是环糊精的一类无定型多组分化学衍生物，由羟丙基取代环糊精2、3或6位羟基的H原子而得到[（见图1.2）。

图1.2 羟丙基环糊精分子结构

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由于β-环糊精在C2、C3羟基之间形成分子内氢键，导致其在水中溶解度较低（1.85g/100ml, 20℃），了β-环糊精的应用。研究者通过化学改性的方法打开环糊精分子内氢键，对其结构进行修饰，使得环糊精能复合较大分子的客体物质, 并改善其功能特性。这些化学改性环糊精被称为第二代环糊精。羟丙基-β-环糊精水溶性大大提高，溶血性更低，可用作注射制剂添加物，并且已经通过美国食品药品管理局(FDA)的审批，是目前最有应用潜力的环糊精材料。

1.4研究目的、意义及主要内容

环糊精的最重要特点是能在分子空腔内包络有机分子、无机化合物乃至气体分子，形成分子包络物（inclusion complex）。包络物的稳定性取决于主体环糊精空腔的容积、 客体分子的大小、基团性质及空间构型等。只有当客体分子与环糊精空腔的几何形状相匹配时，形成的包络物才稳定。CD的功能并不只是限于形成主体。CD分子或多或少地改变了被包含客体的物理化学性质。有时对客体具有类似酶的作用，可以有效地选择性地将客体分子转化成另一类化合物。这表明环糊精对底物具有一定的识别能力，因而成为优良的人工酶模型，并在有机合成中得到日益广泛的应用。

本文以环糊精作为母体的模拟酶研究工作集中在对环糊精的结构修饰上,即在环糊精的两个面上引入其他的催化功能基团,通过引入柔性或刚性的疏水基团,进而改善环糊精的疏水结合能力和催化功能,这样得到的修饰环糊精通常具有单包结部位和双重识别作用。这些衍生物对底物具有多部位包结作用,故具有多重识别功能,可以实现酶促反应的高效性和高选择性，从而在很大程度上改善β-环糊精的性能，使其在各个领域的应用更具有优越性。

本文的研究内容主要包括以下几个方面： 1.β-环糊精衍生物的合成；

2.β-环糊精衍生物与核糖核酸酶的相互作用；

3.羟丙基环糊精与核糖核酸酶，淀粉酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶的相互作用；

4.羟丙基环糊精与三聚氰胺的相互作用； 5.羟丙基环糊精与冬凌草甲素的相互作用。

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第二章 β-环糊精衍生物与核糖核酸酶的相互作用

牛胰核糖核酸酶(E.C.2.7.7.16 ，Bovine pancreatic ribonuclease)存在于牛胰中，简称RNaseⅠ。牛胰核糖核酸酶由124个氨基酸组成，有四对二硫键。牛胰核糖核酸酶通过4个二硫链及次级键，肽链盘曲折叠成三级结构，具有催化活性。牛胰核糖核酸酶是具极高专一性的内切酶，可以使RNA水解，其作用点为RNA的嘧啶核苷-3ˊ-磷酸与其它核苷酸之间连接的酯键，产物为3ˊ-嘧啶核苷酸；或以3ˊ-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。最适pH7.0～8.2，十分耐热。目前不但全部理解了该酶的结构，而且还成功进行了人工合成。牛胰核糖核酸酶含非极性氨基酸苯丙氨酸（Phe）3个、丙氨酸（Ala）12个、 缬氨酸（Val）7个、亮氨酸（Leu）2个、异亮氨酸（Ile）3个、甲硫氨酸（Met）4个、脯氨酸（Pro）3个，共34个非极性氨基酸残基，其分子量为140654。核糖核酸酶结构见图2.1所示。

Fig. 2.1 Bovine pancreatic ribonuclease A contains 124 amino acid residues, none of which are tryptophan. Four intrachain disulfide bridges (S-S) form cross-links in this polypeptide between Cys26 and Cys84, Cys40 and Cys95, Cys58 and Cys110, and Cys65 and Cys72. These disulfides are depicted by yellow bars.

核糖核酸酶中具有非极性氨基酸残基，在理论上是可以和β-环糊精衍生物的疏水性空腔形成包结化合物。

2.1实验材料

2.1.1试剂与药品

β-环糊精 天津市博迪化工有限公司

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对甲苯磺酰氯 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司 吡啶 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司 核糖核酸酶 华美生物公司

2.1.2 仪器

754PC型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司

BS124S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 真空干燥箱 上海亚荣生化仪器厂

2.2 β-环糊精衍生物的合成

2.2.1试剂的预处理

在吡啶中加入适量的粒状固体KOH，干燥数日，使用前加无水苯蒸馏，收集114 ℃馏分备用；将新购的β-环糊精在去离子水中经过两次重结晶纯化后，于100～110 ℃干燥箱中干燥15～20小时，再放在真空干燥器中，以P2O5为干燥剂，真空干燥12 小时以上备用。

2.2.2 β-环糊精衍生物的合成

在装有带无水CaCl2干燥管的冷凝管、恒压漏斗、机械搅拌机的250 mL三口烧瓶中，加入8.33 g干燥β-CD(7.34 mmol)和80 mL干燥无水吡啶，微热至β-CD全部溶解，再冷却至室温(22 ℃)，继续搅拌30分钟。在恒压漏斗中加入80 mL无水吡啶和1.0 g(5.25 mmol)对甲苯磺酰氯(p-TsCl)配成溶液，室温下，在2～3 小时内将对甲苯磺酰氯吡啶溶液慢慢滴入三口瓶中，继续搅拌反应，用TLC板(GF254自制，展开剂：V(CHCl3)∶V(Hac)∶V(CH3CH2OH)=5∶3∶2)监测反应进程。反应需12小时以上。反应完成后，旋转蒸发器蒸干溶剂。固体用200 mL无水乙醚洗涤，并不断搅拌，抽滤，沉淀经3次重结晶后，得白色粉末即为β-CD-6-OTs。

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2.3 β-环糊精衍生物与核糖核酸酶的相互作用

2.3.1 核糖核酸酶对核糖核酸的水解

称取0.001g核糖核酸用磷酸缓冲液配成100μg/mL溶液，再称取0.0001g核糖核酸酶，配成10μg/mL的酶液，二者混合，立刻以磷酸缓冲液为参比在260nm波长下测其不同时间的紫外吸收值，测定核糖核酸酶的催化活性。

2.3.2 β-CD -6-OTs与核糖核酸的相互作用

称取0.001g核糖核酸用磷酸缓冲液配成100μg/mL溶液，再称取0.0001g

β-CD -6-OTs配成10μg/mL的溶液，二者混合，然后立刻以磷酸缓冲液为参比

在260nm波长下测其不同时间的紫外吸收值，检测β-环糊精衍生物是否具有催化活性。

2.3.3核糖核酸酶和β-CD -6-OTs的混合物与核糖核酸的相互作用

称取0.001g核糖核酸用磷酸缓冲液配成100μg/mL溶液，再分别称取0.0001gβ-CD -6-OTs 和0.0001g核糖核酸酶，均配成10μg/mL的溶液，三者混合，然后立刻以磷酸缓冲液为参比在260nm波长下测其不同时间的吸光值，检测其催化活性。

2.3.4核糖核酸酶变性然后加β-CD -6-OTs复性

称取核糖核酸酶0.001g溶解在10mL磷酸缓冲液中，然后向其加入3mLβ-巯基乙醇和0.961g尿素（8mol/L）静置4 小时，然后向其加入β-CD -6-OTs 0.001g振荡8个小时，装入玻璃纸透析去除变性剂，然后将所得透析液定容为100mL。

2.3.5变性复性后的产物与核糖核酸的相互作用

将变性复性后的产物配成核糖核酸酶的浓度为10μg/mL，量取10 mL，称取0.001g核糖核酸配成100μg/mL的溶液，二者混合，立刻以磷酸缓冲液为参比在260nm波长下测其不同时间的吸光值，检测其催化活性。

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2.4结果与讨论

2.4.1不同作用方式测得的吸光度变化值

4种不同处理方法测得的紫外吸光度变化值见表2.1。

Table 2.1 The data of ΔA by different methods

Time(min)

ΔA of method a

ΔA of method

b

ΔA of method

c

ΔA of method

d

0 0 0 0 0 5 0.004 0.004 0.017 0.061 10 0.007 0.017 0.023 0.080 15 0.010 0.022 0.030 0.111 20 0.014 0.027 0.034 0.129 25 0.016 0.032 0.041 0.151 30 0.017 0.039 0.046 0.170 35 0.019 0.044 0.050 0.192 40 0.023 0.050 0.057 0.210 45 0.026 0.053 0.061 0.241 50 0.027 0.058 0.067 0.259 55 0.029 0.065 0.072 0.281 60 0.033 0.069 0.074 0.291

2.4.2 不同处理方法所得的酶的催化活性比较

从表1.1中可以看出0.069是0.033的两倍多，说明β-CD-6-OTs具有一定的催化活性，且比核糖核酸酶同浓度下的催化活性要高；0.074大于0.069 和0.033，但是又小于0.069 和0.033二者之和，可以得出未变性复性的核糖核酸酶和β-CD-6-OTs混合物的催化活性要比同浓度下核糖核酸酶和β-CD-6-OTs单独存在时的催化活性要高，但是又没有两者协同催化作用时高，这有两种可能：一是核糖核酸酶和β-CD-6-OTs混合后二者包合形成了非共价修饰物，且这种非共价修饰物具有较高的催化活性；二是核糖核酸酶和β-CD-6-OTs在对核糖核酸的作用

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位点处相竞争；核糖核酸在变性复性的酶和β-CD-6-OTs混合物溶解的磷酸缓冲液中作用60分钟后ΔA值为0.291。与前面几组数据比较可以看出：0.291均大于0.033、0.069 、0.074，且比未变性复性的酶和β-CD-6-OTs混合物溶解的磷酸缓冲液中的核糖核酸的吸光值0.074大四倍。表明核糖核酸酶和β-CD-6-OTs混合变性复性后的催化活性要比同浓度下核糖核酸酶和β-CD-6-OTs单独存在时高得多，比二者直接相互混合后的催化活性也要高，可以推测，核糖核酸酶在经过变性后，在β-CD-6-OTs存在下复性包合后，形成了更多的具有催化活性的非共价修饰物，或者是形成了具有更高催化活性的非共价修饰物。

2.4.3形成酶的非共价修饰物机理探讨

从本文合成的β-CD-6-OTs与核糖核酸、核糖核酸酶混合后与核糖核酸的反应结果来看，β-CD-6-OTs不仅具有催化作用，而且有比核糖核酸酶更强的催化活性；无论是核糖核酸酶是否经过变性复性处理，混合物的催化活性比单独存在时的催化活性强，但是变性处理过的核糖核酸酶比未变性处理核糖核酸酶的活性要高得多。可以推测其结合的原理为：核糖核酸酶在β-巯基乙醇和尿素（8mol/L）作为变性剂的情况下由原来的球形刚性结构变成了线型的松散结果，这样就使得核糖核酸酶的疏水基团得以暴露，从而有利于β-CD-6-OTs对其包合，形成稳定的非共价修饰物。

酶是高效、专一的生物催化剂，以其高度的选择性及在低浓度下能催化底物反应的能力，在各领域中具有广泛的应用价值，但其对环境过于敏感，对操作条件要求苛刻，易失活，价格昂贵[5]。本文表明β-CD-6-OTs不仅具有较强的催化作用，而且和酶结合后还可以改变酶的催化活性，环糊精稳定的结构且来源非常丰富。因此，随着超分子科学的不断发展，以环糊精为基本骨架的人工酶的分子设计在不久的将来，将得到推广和应用，届时将会有更多更新的以环糊精为模型的模拟酶出现，对酶制剂领域必将带来更大的进步。

2.4.4结论

β-CD-6-OTs具有较强的催化活性，且比同浓度的核糖核酸酶催化活性要高2.1倍；β-CD-6-OTs能与核糖核酸酶结合形成的非共价修饰物，且在核糖核酸酶变性处理后更容易与之结合，形成的非共价修饰物具有比核糖核酸酶的催化活性

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要高8.8倍，比β-CD-6-OTs单独存在时的催化活性要高4.2倍；酶在经过非共价修饰后就可以改变其催化活性，这对酶的活性的改造提供了一种很简便有效的思路和方法。

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第三章 羟丙基环糊精与酶分子间的相互作用

3.1羟丙基环糊精

3.1.1 羟丙基环糊精的制备方法

制备羟丙基环糊精最常用的方法是在碱性条件下环糊精与环氧丙烷在低温下反应，产物经浓缩、干燥得到。例如制备羟丙基-β-环糊精的常用实验室方法是把NaOH溶液加热到60℃，边搅拌边缓慢加入β-环糊精，继续搅拌直到β-环糊精完全溶解，冷却到室温，然后在冰浴下边搅拌边3小时内均匀滴加环氧丙烷，调整到室温继续搅拌直到油层消失，用HCl中合到pH为7，混合液在45℃下减压蒸馏，得到浆状物用95%乙醇溶解，搅拌使Na2SO4沉淀，过滤，滤液45℃减压蒸馏得浓浆，用水溶解后流水透析3小时后再次45℃减压蒸馏，得到浓浆用丙酮洗涤，干燥得产品。

3.1.2羟丙基环糊精的结构与功能

环糊精与环氧丙烷在强碱性环境下反应易形成6位取代物6-羟丙基环糊精，弱碱性条件下则易形成2-羟丙基环糊精。在强碱性条件下2、3、6位H都被活化，而6位位阻最小，取代基最容易进入，因此取代反应以6位为主；弱碱性条件下，2位H酸性最强，最容易活化，因此取代以2位为主。但由于环糊精上羟基数量众多，例如β-环糊精总共有21个羟基，反应产物是无定形混合物。羟丙基环糊精主要有三种结构形式，一种是所有的取代基平均分配在每个葡萄糖残基上，一种是取代基倾向于结合在同一个葡萄糖残基上，另外就是取代基依次相连形成低聚侧链。第一种被认为是最主要的结构形式，因为每个葡萄糖残基相应羟基的反应活性是相等的，而在同一个葡萄糖残基上连接第二个取代基的机率仅为七分之一，连接第三个的机率更小。但是当反应 中环氧丙烷过量时，会形成更多第三种结构形式的产物。

长久以来，人们一直以为环糊精及其衍生物的结构是刚性的，虽然这种假设与它们能轻易的形成复合物的性质不符合。近来的研究结果更趋向于相信其结构相对柔性，有实验表明环糊精通过非共价键合形成复合物不仅在溶液里，甚至固

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体状态下都是柔性的。环糊精及其衍生物的这种相对柔性结构能更好的理解环糊精复合物的形成和复合反应动力学。

由于环糊精特有的内亲油外亲水的无顶圆锥状空腔结构，易与客体分子形成复合物，从而使相关客体分子的溶解度、光学特性、反应活性、挥发性和亲水性质等得到改善。经过化学修饰后的羟丙基环糊精打开了环糊精的分子内氢键，并且是无定形物质，结晶性降低，在水中的溶解度大大提升，形成复合物的能力也有所上升。有报道说羟丙基基团可能增加了空腔体积，或者与客体分子形成新的氢键增加了复合物的稳定性，使得羟丙基环糊精形成复合物的能力上升。但取代度过高可能会产生空间位阻减少进入空腔的客体分子。合适的取代度和取代基分布是羟丙基环糊精达到最佳复合效果的重要因素。

3.2实验材料

3.2.1试剂与药品

羟丙基-β-环糊精 天津市博迪化工有限公司 对甲苯磺酰氯 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司 吡啶 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司 核糖核酸酶 华美生物公司 胰蛋白酶 华美生物公司 胃蛋白酶 华美生物公司 淀粉酶 华美生物公司

乙腈 上海市国药集团化学试剂有限公司 甲醇 天津市泰兴试剂厂 NaOH 湖北省化工科技开发公司华飞化学试厂 尿素 北京化工厂

盐酸 武汉市洪山中南化工试剂有限公司

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磷酸氢二钾 广州化学试剂厂 β-巯基乙醇 上海化学试剂厂

环己烷 天津市广成化学试剂有限公司 磷酸二氢钾 广州化学试剂厂

3.2.2 仪器

754PC型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司

BS124S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 真空干燥箱 上海亚荣生化仪器厂 RE-52系列旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 85-2恒温磁力搅拌器 金坛市科兴仪器厂 HH-4恒温水浴锅 金坛市科兴仪器厂 KS康氏振荡器 金坛市科兴仪器厂 PH030型培养箱/干燥箱 上海-恒科技有限公司 80-1离心机 金坛市科兴仪器厂 XW-80A旋涡混合器 上海青浦沪西仪器厂

3.3羟丙基环糊精与核糖核酸酶的相互作用

3.3.1实验

3.3.1.1 核糖核酸酶对核糖核酸的水解

称取0.001g核糖核酸用磷酸缓冲液配成100μg/mL溶液，再称取0.0001g核糖核酸酶，配成10μg/mL的酶液，二者混合，立刻以磷酸缓冲液为参比在260nm波长下测其不同时间的紫外吸收值，测定核糖核酸酶的催化活性。 3.3.1.2羟丙基环糊精与核糖核酸的相互作用

称取0.001g核糖核酸用磷酸缓冲液配成100μg/mL溶液，再称取0.0001g羟丙基环糊精配成10μg/mL的溶液，二者混合，然后立刻以磷酸缓冲液为参比

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在260nm波长下测其不同时间的紫外吸收值，检测羟丙基环糊精是否具有催化活性。

3.3.1.3核糖核酸酶和羟丙基环糊精的混合物与核糖核酸的相互作用

称取0.001g核糖核酸用磷酸缓冲液配成100μg/mL溶液，再分别称取0.0001g羟丙基环糊精和0.0001g核糖核酸酶，均配成10μg/mL的溶液，三者混合，然后立刻以磷酸缓冲液为参比在260nm波长下测其不同时间的吸光值，检测其催化活性。

3.3.1.4核糖核酸酶变性然后加羟丙基环糊精复性

称取核糖核酸酶0.001g溶解在10mL磷酸缓冲液中，然后向其加入3mLβ-巯基乙醇和0.961g尿素（8mol/L）静置4 小时，然后向其加入羟丙基环糊精 0.001g振荡8个小时，装入玻璃纸透析去除变性剂，然后将所得透析液定容为100mL。

3.3.1.5变性复性后的产物与核糖核酸的相互作用

将变性复性后的产物配成核糖核酸酶的浓度为10μg/mL，量取10 mL，称取0.001g核糖核酸配成100μg/mL的溶液，二者混合，立刻以磷酸缓冲液为参比在260nm波长下测其不同时间的吸光值，检测其催化活性。

3.3.2结果与讨论

3.3.2.1不同作用方式测得的吸光度变化值

4种不同处理方法测得的紫外吸光度变化值见表3.1。

Table3.1 The data of ΔA by different methods

Time(min)

ΔA of method a

ΔA of method

b

ΔA of method

c

ΔA of method

d

0 0 0 0 0 5 0.004 0.004 0.005 0.005 10 0.007 0.005 0.008 0.007 15 0.010 0.007 0.010 0.012 20 0.014 0.010 0.014 0.015

13

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

25 0.016 0.012 0.018 0.018 30 0.017 0.012 0.020 0.020 35 0.019 0.013 0.022 0.022 40 0.023 0.015 0.025 0.025 45 0.026 0.015 0.030 0.031 50 0.027 0.015 0.033 0.033 55 0.029 0.015 0.035 0.035 60 0.033 0.016 0.042 0.041

3.3.2.2 不同处理方法所得的酶的催化活性比较

从表3.1中可以看出0.016只有0.033的一半，说明羟丙基环糊精虽然具有一定的催化活性，但比核糖核酸酶同浓度下的催化活性要低；0.042大于0.016和0.033，可以得出未变性复性的核糖核酸酶和羟丙基环糊精混合物的催化活性要比同浓度下核糖核酸酶和羟丙基环糊精单独存在时的催化活性要高，但是又没有两者协同催化作用时高。0.042和0.041基本相等，表明核糖核酸酶和羟丙基环糊精混合变性复性后的催化活性和同浓度下核糖核酸酶和羟丙基环糊精单独存在时基本相同。

3.3.3结论

羟丙基环糊精具有一定的催化活性，且比同浓度的核糖核酸酶催化活性要低50%；羟丙基环糊精能与核糖核酸酶结合形成的非共价修饰物，比核糖核酸酶的催化活性要高27%，比羟丙基环糊精单独存在时的催化活性要高2.6倍；核糖核酸酶变性处理后形成的非共价修饰物与羟丙基环糊精和核糖核酸酶结合形成的非共价修饰物催化活性相比差别很小。

3.4 HP-β-CD与淀粉酶的相互作用

3.4.1淀粉酶

淀粉酶(amylase)一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。其分类如下表所示：

14

中南民族大学硕士学位论文

表3.2淀粉酶的分类

E.C.编号

系统名称

常用名 α-淀粉酶、液化酶、淀粉-（1，4）-糊精酶等糖化型淀粉酶、糖化酶、葡萄糖淀粉酶等

作用特性

存在

E.C.3.2.1.1. α－1，4-葡聚糖

-4-葡萄糖水解

酶

E.C.3.2.1.3. α－1，4-葡聚糖

-葡萄糖水解酶

不规则的分解淀粉、唾液、胰脏、麦芽、糖原类物质的α－

1，4键 从非还原性末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉、糖原类的

α－1，4键

霉菌、细菌、酵母等

霉菌、细菌

E.C.3.2.1.2. α－1，4-葡聚糖

-4-麦芽糖水解

酶

β-淀粉酶、淀粉-（1，4）-麦芽糖苷酶、外断型淀粉酶

从非还原性末端以麦芽糖为单位顺次分解淀粉、糖原类的

α－1，4键 分解支链淀粉、糖原中α－1，6键

甘薯、大豆、大麦、麦芽等高等植物以及细菌等微生物

E.C.3.2.1.9.

直链淀粉6-葡萄糖水解酶

异淀粉酶、淀粉-（1，6）-糊精酶、R-酶、茁芽

多糖酶

植物、酵母、细菌

3.4.2 实验

本文采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定淀粉酶的活力； 3.4.2.1葡萄糖标准曲线的制定：

取9支25mm×250mm的试管，分别按下表加入试剂：

表3.3葡萄糖标准曲线制定试剂添加量表

项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8

葡萄糖标准液（ml） 0 0.20.40.60.81.01.2 1.4 1.6相当于葡萄糖量（mg） 0 0.20.40.60.81.01.2 1.4 1.6

蒸馏水（ml） 2.01.81.61.41.21.00.8 0.6 0.43，5-二硝基水杨酸试剂1.51.51.51.51.51.51.5 1.5 1.5

（ml） 将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室

15

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。与520nm波长处测A值。以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 3.4.2.2样品中总糖和还原糖含量的测定：

A.样品中还原糖的提取：准确城称取1g淀粉，放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，再定容至100ml。

B.样品中总糖的水解及提取：准确称取1g淀粉，放在锥形瓶中，加入10ml6mol/l盐酸，15ml水，在沸水浴中加热半小时，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液成微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上述溶液10ml于100ml容量瓶中，定容到刻度，混匀备用。

C.样品中糖含量的测定：取7支25mm×250mm试管分别按下表加入试剂：

表3.4糖含量的测定试剂添加量表

项目 空白 还原糖 总糖

0 1 2 3 4 5 6

样品溶液（ml） 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0蒸馏水（ml） 2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.03，5-二硝基水杨酸

试剂（ml）

测定后，取样品的A平均值在标准曲线上查出相应的糖量。用下式计算出淀粉中还原糖与总糖的百分含量。

还原糖mg数×样品稀释倍数

×100

样品质量

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

还原糖％＝

总糖％＝

样品水解后还原糖mg数×样品稀释倍数

×100

样品质量

16

中南民族大学硕士学位论文

3.4.3结果与讨论

3.4.3.1葡萄糖标准曲线

以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值A为纵坐标，绘制标准曲线。

10.80.60.40.200-0.2

图3.1葡萄糖标准曲线图

y = 0.5663x - 0.0302R2 = 0.99560.511.523.4.3.2 淀粉酶与淀粉充分作用后还原糖的含量测定

淀粉被淀粉酶水解后，用分光光度计测试三次，A1=0.01256, A2=0.01547,A3=0.01368，则A=0.01390。将此值在标准曲线中查出还原糖量=0.0779。

还原糖mg数×样品稀释倍数

×100=7.99%

样品质量

—

还原糖％＝

3.4.3.3 与HP-β-CD作用后的淀粉酶水解淀粉所产生的还原糖含量测定

淀粉酶和HP-β-CD相互作用后，再用次淀粉酶水解淀粉，被淀粉酶水解后溶液中还原糖含量测试三次，A1=0.03668, A2=0.03716,A3=0.03479，则A=0.03621。将此值在标准曲线中查出还原糖量=0.1173。

—

17

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

还原糖％＝

还原糖mg数×样品稀释倍数

×100=11.73%

样品质量

3.4.3.4 讨论

在未加入HP-β-CD的淀粉酶去水解淀粉，其还原糖含量为7.99%，而在HP-β-CD与淀粉酶相互作用后，再用淀粉酶去水解淀粉，其还原糖含量为11.73%，结果表明在有HP-β-CD的做用后，还原糖含量增多较为明显，淀粉酶的水解能力提高46.8%。

3.5 HP-β-CD与胰蛋白酶的相互作用

3.5.1胰蛋白酶活力测定

胰蛋白酶活性的测定有以下四种方法：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物测定法、对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）为底物测定法、苯甲酰-L-精氨酰-β-萘酰胺（BANA）为底物测定法和酪蛋白为底物测定法。

本实验采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物测定法。N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物测定法：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外线光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸（benzoyl-L-arginine，简称BA）的紫外光吸收。在胰蛋白酶催化水解下，BAEE随着酯键的被水解，水解产物B逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之响应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的比活力。

NH2CCH2CH2CH2CH

NH

OCNH胰蛋白酶H2ONH2CCH2CH2CH2CHNHOCNH+CH3CH2OHCOOCH2CH3COOH图3.2 BAEE作为底物，水解反应图

18

中南民族大学硕士学位论文

3.5.2 实验

3.5.2.1测定胰蛋白酶的活性

取2个光程为1cm的带盖石英比色杯，分别加入25℃预热过的2.8mL的1.0mmol/L BAEE底物溶液。向一个比色杯内加入0.2mL10mmol/L HCl，作为空白，在波长253nm下调节仪器零点；向另一个比色杯中加入0.2mL待测酶液（酶的用量一般是5～10μg纯胰蛋白酶，若是粗品相应增加用量），立即盖上盖迅速混匀计时，于253nm处测定其光吸收增加值（A253nm），每半分钟读数一次，反应持续5min。

3.5.2.2 HP-β-CD与胰蛋白酶的相互作用后胰蛋白酶活性的测定

取2个光程为1cm的带盖石英比色杯，分别加入25℃预热过的

2.8mL 1.0mmol/L BAEE底物溶液。向一个比色杯内加入0.2mL10mmol/L HCl，作为空白，在波长253nm下调节仪器零点；向另一个比色杯中加入0.2mLHP-β-CD与胰蛋白酶的相互作用后的混合液，立即盖上盖迅速混匀计时，于253nm处测定其光吸收增加值（A253nm），每半分钟读数一次，反应持续5min。

以时间（t）为横坐标，光吸收值（ A253nm）为纵坐标作图，在直线部分任选一个时间间隔与相应的光吸收值变化（△A253nm），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位。

胰蛋白酶活力单位(BAEE单位/mL)＝

∆A253nm/min

×稀释倍数

0.001×酶液加入体积

胰蛋白酶比活力单位(BAEE单位/mg)＝

酶液活力(BAEE单位/mL)

×稀释倍数

酶液蛋白含量×酶液加入体积

3.5.3结果与讨论

3.5.3.1胰蛋白酶活性测定结果

A：未加HP-β-CD胰蛋白酶活性吸光度-时间曲线图

19

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

图3.3 A：未加HP-β-CD胰蛋白酶活性吸光度-时间曲线图

在直线部分选100～160这个1min时间间隔，其相应的光吸收值变化△A253nm=0.005，按所给公式计算胰蛋白酶的活力单位。

胰蛋白酶活力单位（BAEE单位／mL）=0.005／（0.001×0.2）=25（BAEE单位／mL）

胰蛋白酶比活力（BAEE单位／mg）=25／（5×0.2）=25（BAEE单位／mg） B： HP-β-CD与核糖核酸酶的相互作用后胰蛋白酶吸光度-时间曲线图

图3.4 HP-β-CD与核糖核酸酶的相互作用后T-A曲线图

20

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在直线部分选100～160这个1min时间间隔，其相应的光吸收值变化△A253nm=0.016，按所给公式计算胰蛋白酶的活力单位。

胰蛋白酶活力单位（BAEE单位／mL）=0.016／（0.001×0.2）=80（BAEE单位／mL）

胰蛋白酶比活力（BAEE单位／mg）=80／（5×0.2）=80（BAEE单位／mg） 3.5.3.2讨论

综上可知，未加HP-β-CD胰蛋白酶活性测定结果为25（BAEE单位／mg），而HP-β-CD与核糖核酸酶的相互作用后胰蛋白酶测定结果为80（BAEE单位／mg），结果表明HP-β-CD与胰蛋白酶的混合物是胰蛋白酶的活性的3.2倍；

3.6 HP-β-CD与胃蛋白酶的相互作用

3.6.1胃蛋白酶活力测定

蛋白酶活力单位定义：在40℃，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。

3.6.2实验

3.6.2.1标准曲线的制定

A.按表3.5配制各种不同浓度的酪氨酸溶液

表3.5不同浓度的酪氨酸溶液配置表

试剂 蒸馏水 100μg/m1酪氨酸 酪氨酸最终浓度（μg/m1） B.测定步骤

管号

1 2 3 4 5 6 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100

另取6支试管按表6编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色

21

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

20min，在于波长660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值。

以吸光度为纵座标。酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。 3.6.2.2 HP-β-CD与胃蛋白酶的相互作用后胃蛋白酶活性的测定

准确称取胃蛋白酶2g，用10～20ml蒸馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定倍数(使其测定光密度在0.2～0.4范围内为宜)。

取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管。置入40℃水浴中预热3～5min，在三支平行试验管中分别加入1ml 2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。分别吸取1ml清液，加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40℃水浴中显色20min。

空白管中先加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，再加lml 2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。

见空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。

3.6.3结果与讨论

A：酪氨酸浓度-吸光度标准曲线

以酪氨酸浓度µg/m1为横座标，吸光度A为纵座标，绘制成标准曲线。

1.210.80.60.40.20020406080100120y = 0.0099x + 0.0554R2 = 0.9971

图3.5酪氨酸浓度-吸光度标准曲线

B：分光光度计测得胃蛋白酶吸光度

胃蛋白酶吸光度A=0.2756，符合标准，待用。

22

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C：未加HP-β-CD的胃蛋白酶的吸光度值

三组平行实验结果测定为A1=0.3286, A2=0.3656,A3=0.3866，则A=0.3603。 D：加入HP-β-CD的胃蛋白酶的吸光度值

三组平行实验结果测定为A1=0.2776, A2=0.2926,A3=0.3166，则A=0.2956。 3.6.3.1胃蛋白活性的计算

1. 未加HP-β-CD的胃蛋白酶的活性=A×4×N／10=30.83×4×1／10=12.332µg／ml 2. 加入HP-β-CD的胃蛋白酶的活性=A×4×N／10=24.26×4×1／10=9.704µg 3.6.3.2讨论

从3.3.4的胃蛋白酶活性结果可以看出，未加HP-β-CD的胃蛋白酶的活性能力较强，加入HP-β-CD的胃蛋白酶的活性能力降低21.3%，说明HP-β-CD对胃蛋白酶活性有影响，对胃蛋白酶活性具有抑制作用。这可能有两方面的原因：一是HP-β-CD对胃蛋白酶的包结可能阻隔了酶和底物分子的结合，改变了酶分子的活性中心，造成胃蛋白酶的活性降低；二是HP-β-CD可能比胃蛋白酶更易与底物分子结合，对胃蛋白酶形成了竞争型抑制。

——

23

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

第四章 羟丙基β-环糊精与三聚氰胺的相互作用

4.1三聚氰胺

三聚氰胺（英文名：Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，密度1.573g/cm3 (16℃)。常压熔点354℃（分解）；快速加热升华，升华温度300℃。在水中溶解度随温度升高而增大,在20℃时，约为3.3 g/L，即微溶于冷水，溶于热水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。呈弱碱性（pKb=8），与盐酸、硫酸、、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。分子结构如图：

图4.1三聚氰胺分子结构图

4.2实验材料

4.2.1 实验仪器

100ml和10ml容量瓶各若干

电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司

恒温干燥箱确 上海亚荣生化仪器厂 超声波混合仪 太仓市科教仪器厂 pH测定仪 上海雷磁

紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司

24

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BS124S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 高压液相色谱仪(HPLC UltiMate3000) 戴安公司

分液漏斗

烧瓶、烧杯、试管若干 振荡器、研钵、移液等

4.2.2 实验试剂

三聚氰胺 天津市恒兴试剂有限公司 HP-β-CD 天津市博迪化工有限公司 甲醇 天津市泰兴试剂厂 辛醇 天津市泰兴试剂厂 超纯水 自制 Na2HPO4和KH2PO4配制的缓冲溶液等

4.3羟丙基环糊精与三聚氰胺的相互作用

4.3.1 三聚氰胺和HP-β-CD紫外吸收光谱的测定

a) 准确称取6.30mg三聚氰胺加入到100ml的容量瓶中，用超纯水定容至刻

度（浓度为5×10mol.L）;准确称取154mgHP-β-CD加入到10ml。 的容量瓶中，用超纯水定容至刻度（浓度为10-2mol. L）b) 用适量的Na2HPO4和KH2PO4配制成pH=8.5的缓冲溶液

c) 取所配制完成的三聚氰胺和HP-β-CD这两种溶液各1ml加入到

10ml的容量瓶中，再加2mlpH=8.5的缓冲液，用超纯水定容至刻 d) 超声波混合5min，室温静置10min

e) 以不含三聚氰胺的溶液为参比，即只加入2ml的缓冲液和8ml的超

纯水的溶液为参比，然后测定包合物的紫外吸收光谱。三聚氰胺和HP-β-CD的吸收光谱同条件测定。

25

-4-1

-1

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

4.3.2共沉淀法制备三聚氰胺和HP-β-CD的包合物

a) 共沉淀法制备摩尔比为1：1的三聚氰胺和HP-β-CD的包合物。准确称

取HP-β-CD231.0mg(0.15mol)两份，一份溶解于适量的超纯水中，制成饱和溶液，另一份备用

b) 准确称取三聚氰胺18.90mg(0.15mol)两份，一份溶于适量的甲醇中，

然后将此溶液缓慢滴加到HP-β-CD的饱和溶液中，形成的悬浮液于40℃搅拌30min,室温下继续搅拌72h，另一份备用。

c) 将所得的悬浮液过0.45um的滤膜，收集固形物恒温干燥箱40℃干燥

24h，将干燥好的包合物研碎过80目筛。

d) 将备用的三聚氰胺和HP-β-CD直接于研钵中混合研磨30min,过80

目筛。

4.3.3等摩尔连续递变法测定包合物的化学计量关系——Job法 包合物的化学计量关系用等摩尔连续递变法（Job法）测定。等摩尔系列法

又叫连续递变浓度法,这是一个经典的方法,因而被广泛采用。方法的总体思路是:维持客体(G)与主体(CD)的总浓度不变,连续改变两个组份的比例,测量一系列溶液的吸光度值(A)，以G或CD的摩尔分数(F)对吸光度差作图(以对应同浓度主体溶液为空白)，曲线的转折点处对应的F即为包结物的包结比，有时曲线的转折点不是很明显,应在曲线的两侧分别作切线,两切线的交点代表着包结物的摩尔组成,即包结比。奈普生(naproxen)与β-CD在水溶液中的包结,用此法证明所形成的包结物的包结比。实验操作步骤如下：

a) 准备30只用洗液洗净的带玻璃塞的试管备用。

b) 准确称取1.26mg三聚氰胺加入到100ml的容量瓶中，用超纯水定容至刻

度（浓度为1.0×10-4mol.L-1）;准确称取1.54mgHP-β-CD加入到10ml的容量瓶中，用超纯水定容至刻度（浓度为1.0×10-4mol. L-1）。 c) 分别用移液准确移取各溶液，具体方法如实验结果中表格。 d) 将配制好的包合物、三聚氰胺和HP-β-CD溶液超声波混合15min,

室温放置72h。

e) 以HP-β-CD溶液为参比，分别测定在不同配比下的包合物、三聚氰

26

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胺溶液的吸光度值，测定波长为212nm。最终确定HP-β-CD和三聚氰胺的结合常数。

4.3.4三聚氰胺和羟丙基-ß-环糊精在辛醇—水相的分配系数

a) 分别取合适浓度的三聚氰胺和HP-β-CD，测定在不同浓度下的吸光度

值，制作标准曲线。

b) 三聚氰胺和羟丙基-ß-环糊精在辛醇—水相的分配系数的测定，取各物质

的水溶液5ml，三聚氰胺浓度为0.3×10-4mol.L-1，HP-β-CD的浓度为1.0×10-3 mol.L-1，室温下加入等体积的辛醇，剧烈震荡使之充分分配。 c) 静置24h，用分液漏斗取下层水相，以适当的波长测定A值，然后代入标

准曲线求得水相中物质浓度C水相。分配比R=辛醇中的浓度／水相中的浓度=（C0—C水相）／C水相，C0代表物质的初始浓度。

4.3.5 HPLC法确定包合物的形成：

采用C18柱，控制柱温25度，流动相为甲醇：水=5：95，设定紫外波长为210 nm，分别进样三聚氰胺单体和包合物，测定两者的HPLC色谱图。

4.4 结果与讨论

4.4.1紫外吸收光谱结果

分别测定三聚氰胺、HP-β-CD、包合物的紫外吸收光谱，以波长为横坐标，以所测吸光度的值为纵坐标，所得结果如下：

27

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

图4.2三聚氰胺、HP-β-CD、包合物吸光度-波长曲线图

由图4.2可知，三聚氰胺和包合物的最大吸收波长均为212nm。 HP-β-CD的吸收波长相对较小，其最大吸收波长为198nm。 4.4.2等摩尔连续递变测定结果

分别配制浓度均为10mol.L的三聚氰胺和HP-β-CD溶液，配制方法和所测

结果如表4.1：

表4.1等摩尔连续递变测定试剂添加量表

包合物序列号 1 2345678 9 10

加入三聚氰胺体积(ml) 0.1 0.20.30.40.50.60.70.8 0.9 1.0加入HP-β-CD体积(ml) 0.9 0.80.70.60.50.40.30.2 0.1 0.0加入缓冲液体积（ml） 1.0 加入超纯水体积（ml） 3.0 三聚氰胺序列号

1 23

4

5

6

7

8 9 10

加入三聚氰胺体积(ml) 0.1 0.20.30.40.50.60.70.8 0.9 1.0加入缓冲液体积（ml） 1.0

加入超纯水体积（ml） 3.9 3.83.73.63.53.43.33.2 3.1 3HP-β-CD序列号

1 2

3

4

5

6

7

8 9 10

加入HP-β-CD体积(ml) 0.9 0.80.70.60.50.40.30.2 0.1 0.0加入缓冲液体积（ml） 1.0

加入超纯水体积（ml） 3.1 3.23.33.43.53.63.73.8 3.9 4.0

28

中南民族大学硕士学位论文

按照上述方法配好溶液后，以只含HP-β-CD的溶液为参比，在波长为212nm处测定三聚氰胺和包合物的吸光度，所测结果如下：

表4.2三聚氰胺和包合物吸光度的结果表

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 三聚氰胺 包合物

0.052 0.135 0.161 0.179

0.181

0.329

0.360

0.409 0.463 0.516

0.057 0.142 0.166 0.211

0.224

0.353

0.3

0.411 0.466 0.516

根据表4.2的结果，以两者的A值差为纵坐标、以序列号为横坐标作图，结果如下：

0.050.0450.040.0350.030.0250.020.0150.010.00500246序列号810A差值系列112

图4.3 Job's图

从所测定的结果可知，在序列号5处A差值达到最大，出现波峰，说明最佳包合比为1：1。在序列号1、2、8、9处，基本不发生包合。由此可知包合物的摩尔比组成为1:1。

4.4.3 HPLC法测定三聚氰胺包合物的HPLC色谱图

29

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

图4.4三聚氰胺HPLC色谱图

图4.5三聚氰胺及包合物的HPLC色谱图

通过以上两图对比表明，三聚氰胺在7分14秒时有一个吸收峰，然后在7分53秒出现了另外一个吸收峰，表明三聚氰胺和HP-β-CD形成了包合物。

4.4.4讨论

三聚氰胺和HP-β-CD能形成包合物，且水溶性增强，这为HP-β-CD的实际应用提供了新思路：HP-β-CD可以与生物体内沉积的三聚氰胺包结，改善了三聚氰胺的水溶性，能被生物体较为顺利地排出体外，从而降低了三聚氰胺对生物体危害。

30

中南民族大学硕士学位论文

第五章 羟丙基环糊精与冬凌草甲素相互作用的研究

冬凌草甲素(oridonin,ORD)是唇形科（Labiatae）香茶菜属（Rabdosia）植物中的重要活性二萜成分，其主要植物来源是香茶菜（Rabdosia amethystoides）、显脉叶香茶菜（Rabdosia nervosa）、毛叶香茶菜（Rabdosia rabdosia）、道孚香茶菜（Rabdosiadownsis）和冬凌草（Rabdosia rubescens）、

延命草（Isodon japonicus）等。其结构见图5.1[3]。

OH2011110318513141617H8OH15O67OH19OHOH

图5.1 冬凌草甲素的分子结构

上世纪70年代首次分得冬凌草甲素并发现其具有较强的抗肿瘤活性，对多种移植性肿瘤有效，临床上主要用于肝癌、食管癌、胰腺癌等的治疗，并且冬凌草甲素对肿瘤细胞的细胞毒作用具有选择性及低毒性，因此具有很好的临床应用和开发价值[4]。由于冬凌草二萜类成分的水溶性差，25℃冬凌草甲素在水中的平衡

-1

溶解度仅为0.75g・L，了其在药学中的应用,故需采用一定的制剂技术以改

善其溶解度。

5.1实验材料

5.1.1试剂与药品

羟丙基-β-环糊精 天津市博迪化工有限公司 冬凌草甲素 自制

磷酸二氢钾 分析纯 广州化学试剂厂 磷酸氢二钠 分析纯 广州化学试剂厂

5.1.2实验仪器

754PC型紫外可仪器厂见分光光度计 上海光谱仪器有限公司

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环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

BS124S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 HZ-9211K恒温振荡器 太仓市科教仪器厂 KQ-100E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 pHS-25型pH计 上海雷磁

PH030A型培养箱/干燥箱 上海-恒科学仪器有限公司

5.2羟丙基-β-环糊精和冬凌草甲素包合物的制备与表征

5.2.1包合物溶液的制备

超声波法[5] 精密称取冬凌草甲素粉末1.82mg于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，超声波处理20min使其充分溶解，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤得到冬凌草甲素溶液；再精密称取HP-β-CD154mg于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，分别取上述两种溶液各1ml于10ml容量瓶中，再加入2ml pH=6的磷酸盐缓冲液[4]，用超纯水定容至刻度，超声波处理20min,置于25℃恒温振荡器中振荡(100 r・min - 1) 3d后室温下静置1d，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得到包合物溶液。

5.2.2包合物的表征

以超纯水为参比，测定包合物的紫外吸收光谱。冬凌草甲素和包合物溶液未用超声波处理前的紫外吸收光谱也以此条件测定。

5.2.3包合物摩尔比组成的确定-Job's法

分别精密称取ORD粉末9.1mg、HP-β-CD38.5mg分别置50 mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，则两者的浓度均为5×10-4 mol・L-1；精密配置一系列两者浓度之和为1×10-4 mol・L-1的溶液而ORD与HP-β-CD的摩尔浓度比连续变化（1：9，2：8，3：7等）的溶液，加入1ml pH=6的磷酸盐缓冲液，超声波处理20min,40℃下静置2d,再于室温静置3d，以相同浓度的HP-β-CD溶液做空白，测定系列溶液在242nm处的吸收度(A0)，同时测定相同浓度的ORD溶液的吸收度(A1)。以ORD的摩尔分数x为横坐标，两者吸光度之差△A为纵坐标，绘制Job's图。

32

中南民族大学硕士学位论文

5.2.4 ORD标准曲线的绘制

精密称取ORD 3.mg于100ml容量瓶中，用超纯水定容，超声波处理20min后用0.45μm微孔滤膜过滤得到浓度为1×10-4 mol・L-1的ORD溶液。精密移取该溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0ml置于20ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，得系列标准溶液。以超纯水为参比，在波长242nm处测定吸光度，以ORD的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

5.2.5相溶解度实验

精密称取HP-β-CD 3.08g于20ml容量瓶中，超纯水稀释至刻度，再分别精密移取该溶液0、0.7、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0ml于10ml容量瓶中，加入2ml pH=6的磷酸盐缓冲液，超纯水定容至刻度，向各溶液中加入ORD7mg,摇匀，超声波处理20min,再置于25℃恒温振荡器中振荡(100 r・min - 1) 3d，室温下静置2d，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用超纯水稀释10倍，以相同浓度的HP-β-CD溶液为参比，测定各溶液的紫外吸收光谱，并记录其在242nm处的吸光度。以HP-β-CD的浓度为横坐标，ORD的浓度为纵坐标，绘制相溶解度图，并确定HP-β-CD对ORD的增溶效应。

5.3 结果与讨论

5.3.1 包结物的表征

0.300.250.2031A0.150.100.050.00220230240250λ/nm

260270280290300

图5.2 HP-β-CD、ORD及HP-β-CD-ORD包合物超声波处理前后紫外吸收光谱

33

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

1-HP-β-CD-ORD混合物经超声，振荡处理后 ；2-ORD ；3-HP-β-CD-ORD混合物处理前

由图5.2可以知道，ORD在波长242nm处有强烈的吸收，且在220-300nm范围内，ORD有较强的吸收，HP-β-CD-ORD包合物超声波处理前后的紫外吸收变化较大，包合物处理前的紫外吸收与甲素相似，而经处理后的包合物的紫外吸收强度减弱，这表明HP-β-CD-ORD包合物已经形成。

5.3.2 Job's图

0.0160.0140.0120.0100.0080.0060.0040.002

0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1AX

图5.3 Job's图

图5.3为HP-β-CD-ORD包合物和相同浓度的ORD在波长242nm处的吸光度差ΔA与包合物中ORD的摩尔分数x的分析结果。由图可以知道，包合物与ORD单体的吸光度差最大值为0.017，对应的包合物中ORD的摩尔分数为0.5，且曲线在此出现了唯一的转折点，则包合物的摩尔比组成为1:1。

5.3.3 ORD的标准曲线

0.70.60.50.4A0.30.20.10.00246-5

810121416c/*10/(mol/L)

图5.4 ORD在水中溶解的标准曲线图

34

中南民族大学硕士学位论文

图5.4为ORD在水中溶解的标准曲线图，经回归处理得线性回归方程：y=4428.4x+0.004,r=0.99991,由此可以知道ORD浓度在3.-36.4mg.L-1范围内线性关系良好。

5.3.4相溶解度图

0.00021

0.00020

0.00019

∆A0.00018

0.00017

0.00016

0.00015

01234-3

5678c(HP-β-CD)/*10/mol/L

图5.5相溶解度图

由图5.5可知，当 HP-β-CD的浓度范围在（0～28）mmol.L-1时，ORD在水中的溶解度随着HP-β-CD浓度的增加而增加，这进一步的说明了在此范围内HP-β-CD和ORD形成了1:1的包合物，而当HP-β-CD的浓度大于42mmol.L-1 时,ORD的溶解度逐渐降低，该结果符合相溶解度中的BS类型。

5.3.5一系列包合物的紫外吸收光谱

1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0

20021022023024041Aλ/nm

250260270280290300

图5.6 等量的ORD在不同浓度的HP-β-CD溶液中形成的包合物的紫外吸收光谱

HP-β-CD：1→4：0，0.7×10-4 ，1.4×10-4，2.8×10-4 mol・L-1

35

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

由图可知，在（225-260）nm波长范围内，ORD的吸光度随着HP-β-CD浓度的增加而增强，且在225nm处出现了等吸收点，各包结物的最大吸收峰在242nm处，没有发生位移，但是吸光度发生了改变。

5.3.6 HP-β-CD对ORD的增溶效应

表5.1 25℃不同浓度的HP-β-CD对ORD的增溶效应 HP-β-CD(10-2mol.L-1)

s(10-4mol.L-1)

s/s0

-1

ORD的溶解度随着HP-由表5.1可知,HP-β-CD浓度范围在（7-42）mmol.L时，

0.7 1.4 2.1 2.8 4.2 7.0 1.48 1.7754

2.0380

2.03601.6606 1.73

1.18 1.31 1.46 1.46 1.19 1.20

β-CD浓度的增加而增加,当浓度为2.8×10- 2 mol.L - 1 ,ORD的溶解度为原有的1.46倍,当再增加其浓度，增溶作用变小，说明HP-β-CD用于ORD的包结,在一定浓度范围内可以提高ORD在水中的溶解度。

5.3.7 讨论

紫外分光光度法表明在水溶液中，形成了稳定的HP-β-CD-ORD包合物，等摩尔连续递变法和相溶解得法均表明HP-β-CD与ORD是以摩尔比1:1进行包合的。相溶解度图为BS类型，HP-β-CD的浓度范围在（0～42）mmol.L-1时，ORD在水中的溶解度随着HP-β-CD浓度的增加而增加，表明生成了包合物，因为包合物溶解度增大，ORD的溶解度增加到一定浓度后达到饱和，而再继续增加HP-β-CD的浓度,包合物继续生成，在一段时间内ORD的浓度保持不变，再继续增加HP-β-CD的浓度，则生成了不溶于水的物质，从而曲线下降。一系列包合物的紫外吸收光谱表明HP-β-CD能增加ORD的溶解度，出现拐点进一步表明了包合物的生成。

由表1可知，HP-β-CD在（7-28）mmol.L-1浓度范围内，ORD的溶解度随着HP-β-CD浓度的增大而增大，最大增溶浓度为ORD原有溶解度的1.46倍，当HP-β-CD的浓度继续增加时，对ORD的增溶效果下降，说明HP-β-CD与ORD包合后，在一定的浓度范围内可有效地提高其在水中的溶解度。

5.3.8 HP-β-CD提高ORD的溶解度的机理探讨

由于环糊精特有的内亲油外亲水的无顶圆锥状空腔结构，易与客体分子形成

36

中南民族大学硕士学位论文

复合物，从而使相关客体分子的溶解度、光学特性、反应活性、挥发性和亲水性质等得到改善。经过化学修饰后的羟丙基环糊精打开了环糊精的分子内氢键，并且是无定形物质，结晶性降低，在水中的溶解度大大提升，形成复合物的能力也有所上升。有报道说羟丙基基团可能增加了空腔体积，或者与客体分子形成新的氢键增加了复合物的稳定性，使得羟丙基环糊精形成复合物的能力上升。

5.4 结论

（1）HP-β-CD在水中能与ORD形成稳定的包合物； （2）HP-β-CD与ORD形成包合物的摩尔包合比为1:1；

（3）HP-β-CD在一定范围内与ORD形成包合物，包合物的溶解度是 ORD的溶解度

的1.46倍,为ORD在临床上的应用及剂型改进提供了理论依据。

37

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

第六章 总结与展望

6.1全文总结

（1）利用对甲苯磺酰氯与β-环糊精合成β-CD-6-OTs，以核糖核酸为底物，比较核糖核酸酶、β-CD -6-OTs、核糖核酸酶和β-CD -6-OTs的混合物、变性处理的核糖核酸酶加β-CD -6-OTs复性后的包结物对核糖核酸的水解反应。结果表明：β-CD-6-OTs具有较强的催化活性，且比同浓度的核糖核酸酶催化活性要高2.1倍；β-CD-6-OTs能与核糖核酸酶结合形成的非共价修饰物，且在核糖核酸酶变性处理后更容易与之结合，形成的非共价修饰物具有比核糖核酸酶的催化活性要高8.8倍，比β-CD-6-OTs单独存在时的催化活性要高4.2倍。酶在经过非共价修饰后就可以改变其催化活性，这对酶的活性的改造提供了一种很简便有效的思路和方法。

（2）利用HP-β-CD分别与核糖核酸酶、胃蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶相互作用，结果表明：HP-β-CD与核糖核酸酶形成的非共价修饰物比核糖核酸酶的催化活性要高27%；HP-β-CD与胃蛋白酶形成的非共价修饰物比胃蛋白酶的催化活性要降低21.3%；HP-β-CD与淀粉酶形成的非共价修饰物比淀粉酶的催化活性要高46.8%；HP-β-CD与胰蛋白酶形成的非共价修饰物是胰蛋白酶的催化活性的3.2倍；

（3）利用共沉淀法制备三聚氰胺和HP-β-CD的包合物，经过测定三聚氰胺、HP-β-CD、包合物的紫外吸收光谱、测定包合物等摩尔连续递变以及测定三聚氰胺和HP-β-CD在辛醇—水相的分配系数等方法，结果表明：三聚氰胺和HP-β-CD可以形成稳定的包合物，结合常数为1：1。

（4）利用超声波法制备冬凌草甲素和HP-β-CD的包合物，通过Job's法和相溶解度实验表明：HP-β-CD在水中能与ORD形成稳定的包合物；HP-β-CD与ORD形成包合物的摩尔包合比为1:1；HP-β-CD在一定范围内与ORD形成包合物，包合物的溶解度是 ORD的溶解度的1.46倍。

6.2 展望

（1）环糊精及其衍生物对蛋白质等分子的相互作用的研究有待于进一步深化；

38

中南民族大学硕士学位论文

（2）环糊精及其衍生物对药物分子的相互作用有待于进行进一步的应用研究； （3）环糊精及其衍生物与毒性分子间形成包和物，增加毒性分子的溶解度，有

利于毒性分子从体内排除，其实际应用有待于进行进一步的研究。

39

环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

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中南民族大学硕士学位论文

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环糊精及其衍生物与蛋白质等分子间相互作用的研究

致 谢

本论文是在我的导师宋发军副教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。导师严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到最终的完成，导师都给予我细心的指导和不懈的支持。近三年来，导师不仅在学业上、生活上给我以无微不至的关怀和帮助，而且教会我很多为人处事的道理，在此谨向导师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！

感谢刘学群教授、王春台教授、杨光忠副教授、刘梅芳老师、周杰老师、曾小英老师在研究过程中给予的帮助与指导，在此一并表示最诚挚的谢意！

感谢院领导的培养和关怀！感谢同学们的支持和帮助！ 感谢所有关心和帮助过我的朋友！

最后感谢我的父母和家人。这么多年来，你们一直都在默默地奉献着、支持着我，你们无私的爱和理解是我完成论文的精神支柱！

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中南民族大学硕士学位论文

附录：攻读学位期间所发表的论文目录

（1）刘娜 杨凯 宋发军 梁建军 冬凌草种子油对小鼠代谢功能的影响 中国科技博览.2009.04（109）（通讯作者）

（2）梁建军 邓丽丽 宋发军 超临界流体萃取冬凌草甲素 科技创新导报.2009.21

（3）梁建军 骆衡 宋发军 β-环糊精衍生物与核糖核酸酶的相互作用研究与应用（已投稿）

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化学