滨州医学院学报 JOURNALOFBINZHOUMEDICALCOLLEGE2004年 第27卷 第2期Vol.27 No.2 2004
用改良的盐洗法与酚2氯仿法
提取基因组DNA效果比较
胡敬富,周淑华,韩兆东,魏义花 (滨州医学院附属医院,滨州市 256603)
目的:探索更为安全可靠的基因组DNA提取方法。方法:采用改良盐洗法提取人外周血白细胞【摘要】
结果:通过对15份不同静脉基因组DNA,与传统的酚2氯仿抽提法在提取效果、DNA纯度等方面加以比较。
血标本与酚2氯仿抽提法同步对比研究显示:改良盐洗法提取模板DNA无污染、无害,所提DNA质量好、纯度高,达到酚2氯仿抽提法所获DNA的水平;操作简单、快速,方法稳定可靠,无一例失败。结论:该方法提取的DNA可用于实验以及临床上DNA分型等研究。【关键词】 DNA;提取法;盐洗;酚2氯仿【中图分类号】 R44616 【文献标识码】 A 【文章编号】 100129510(2004)0220083202
ONTHEEFFECTIVENESSOFIMPROVEDSALTINGOUTMETHODANDPHENOL2CHLOROFORMONEFOREXTRACTIONOFGENOMEDNA
HuJingfu,ZhouShuhua,HanZhaodong,etal
(AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalCollege,Binzhou256603)
【ABSTRACT】 Objective:ToexploreamoreeffectiveandsafegenomeDNAextractingmethod.Methods:AnimprovedsaltingoutmethodwasusedtoextracthumanleucocytegenomeDNA.Thismethodwascomparedwithtraditionalphenol2chloroformextractiononein15differentbloodsamples.Results:Theresultsshowedthatthesaltingoutmethodwasasimple,rapidandnontoxicextractionprocedure.DNAqualityobtainedbythistech2niquewascomparabletothatbyphenol2chloroformextraction.Allthe15testsweredonesuccessfully.Conclu2sion:DNAextractedwiththismethodcanbeusedinsuchlaboratoryandclinicalresearchasDNAtyping.
【KEYWORDS】 DNA;extraction;saltingout;phenol2chloroform 随着分子生物学理论与技术的发展,对基因的剂对人体的毒性作用令人担忧。为了探索更为安全研究越来越广泛的应用于多项基础研究及临床检可靠的基因组DNA提取方法,我们参考国外资料,测。多年来研究者多采用传统的酚2氯仿抽提法进行基因组DNA的提取。酚2氯仿抽提法虽然有提取效果可靠、稳定的特点,但在进行大样本操作时,试为硫喷妥钠的5倍,两药混合后可使费用有所降低。110%异丙酚与210%硫喷妥钠按1∶1比例混合后用于麻醉诱导(剂量为异丙酚110mg/kg,硫喷
用改良的饱和盐洗法提取人外周血DNA,并比较其与酚2氯仿抽提法的抽提效果,现报告如下。1 材料与方法
volumemixtureischemicallystable[J].AnesthAnalg,1998,86:4223.CrowtherJ,HrazdilJ,JollyDT,etal.Growthofmicroorganisminpropofol,thiopental,anda1∶1mixtureofpropofolandthiopental[J].AnesthAnalg,1996,82:475
4.RashiqS,GallantB,GraceM,etal.Recoverycharacteristicsfollow2inginductionofanesthesiawithcombinationofthiopentalandpropo2fol[J].CanJAnesth,1994,41:1166
5.盖荣华,王建波,孙风英,等.异丙酚、硫喷妥钠麻醉诱导对血流动
妥钠210mg/kg),可减轻诱导后血压下降的程度,
与芬太尼4μg/kg伍用,可有效控制气管插管引起的心血管反应。【参考文献】
1.PawHG,GarrodM,FilleryTravisAJ,etal.Thiopentalandpropo2fol:acompatiblemixture[J]?EurJAnesth,1998,15:409
2.LazarER,JollyDT,TamTK,etal.Propofolandthiopentalina1∶1
力学的影响[J].滨州医学院学报,1997,20(3):224
6.吴新文,庄永敬,陈勇伟,等.7种常见静脉对血流动力学
影响的比较[J].临床麻醉学杂志,2000,16:283
(收稿日期:2003211224)
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滨州医学院学报 JOURNALOFBINZHOUMEDICALCOLLEGE2004年 第27卷 第2期Vol.27 No.2 2004
111 主要试剂 红细胞裂解液(10mmol/LTris
pH716,5mmol/LMgCl2,10mmol/LNaCl),白细
胞裂解液(10mmol/LTrispH716,10mmol/LED2TA,50mmol/LNaCl),蛋白酶K(Merk公司),10%SDS、6M饱和氯化钠、苯酚氯仿异戊醇(25∶24∶1)。1.2 基因组DNA的制备 抽取静脉血5mL,肝素抗凝(1mL血加肝素100μL),1500r/min离心5min,吸出血浆。①加等体积的红细胞裂解液,上下
洗法和酚2氯仿抽提法提取白细胞基因组DNA,此
两种方法所得的DNA的A值及双链DNA浓度见表1。表1 用改良盐洗法和酚2氯仿抽提法提取的
部分样本A值和双链DNA浓度
样本编号
1234567101112131415
改良盐洗法
μg/mL)A值浓度(
1168115411601172116511741182117811531159116011471173116311
251258319276188310246251255260357323238168156
颠倒充分混匀,2500～3000r/min离心15min,去
上清液。②加红细胞裂解液2～3mL,上下颠倒充分混匀,2500～3000r/min离心15min,去上清液。③重复步骤②2～3次,加白细胞裂解液3mL,上下颠倒混匀,加100μL10%SDS,轻轻摇匀,加10mg/mLRNA酶40μL,37℃水浴中孵育2h,加10mg/mL蛋白酶K60μL,37℃恒温水浴中孵育过夜。④改良的盐洗法:上述孵育过夜样本中加预冷的6M饱和NaCl1mL,手工激烈震荡15s,2500r/min离心10min。酚2氯仿抽提法:加入等量体积的饱和酚,混匀后2500r/min离心10min,取上清液(注意不要吸到有机相和无机相之间的蛋白质),加等量体积的苯酚氯仿异戊醇(25∶24∶1),2500r/min离心10min,取上清液加等量的氯仿异戊醇(24:1)2500r/min离心10min。⑤取上清液,加2
酚2氯仿抽提法
μg/mL)A值浓度(
11652491148262116529611752731162167115930711772551126111422681163224115734611353116726211551631176181
注:表中数据为标本作50倍稀释后所测。
对两组数据作配对t检验,P>0105,表明这两
种方法提取的DNA纯度无明显差异。盐洗法DNA的A值范围为1147～1182,酚2氯仿抽提法DNA的A值范围为1142～1176。3 讨论
倍体积预冷的无水乙醇,轻轻摇动至絮状DNA析
出,将DNA取出移入015mL的eppendof管中,70%乙醇清洗一次,吸去乙醇,自然干燥。或1000
～1500r/min离心5min,使DNA贴壁去乙醇,用70%乙醇清洗一次,1000～1500r/min离心5min,去乙醇;70%乙醇013mL将DNA浮起,移入015mL的eppendof管中,吸去乙醇,自然干燥。⑥将DNA溶解于013～014mL的TE缓冲液中。取2μLDNA样品,用紫外分光光度法检测样品的A(OD)值及DNA浓度,最后DNA均调整至100μg/mL。2 结果2.1 基因组DNA抽提效果的检测 酚2氯仿抽提
保证核酸一级结构的完整性和排除其它分子污
染是分离纯化核酸总的原则[1]。去除蛋白质较经典的方法为酚2氯仿抽提法,但反复的抽提对DNA链的机械剪切机会较多,费时费力且有一定的危险性。Miller等[2]使用饱和氯化钠溶液沉淀细胞内蛋白质的方法抽提基因组DNA,该方法大大简化了操作程序。我们将改良盐洗法与酚2氯仿抽提法对比发现,两种方法所得的DNA浓度和纯度均无差异,均满足PCR等分子生物学试验的需要。但前者既方便省时,又廉价安全,值得推广。【参考文献】
1.卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].北京:北京高等教育出版
法和改良盐洗法提取的基因组DNA,在018%琼脂糖凝胶电泳上均为清晰完整的条带,无降解。不同的标本,DNA的浓度不同。
212 酚2氯仿抽提法和改良的盐洗法所得基因组DNA纯度的比较 对15份标本同时使用改良的盐
社,1993
2.MillerSA,DykesDD,PoleskyHF.AsimplesaltingoutprocedureforextractingDNAfromhumannucleatedcells[J].NucleicAcidsRes,1988,16(3):1215
(收稿日期:2003210221)
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