引物合成常见问题
Q1.引物是如何合成的？
目前引物合成大体采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机械合成，合成的原理都相同，主要不同在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环历时的多少。
(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，取得游离的5'- OH； (2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反映；
(3) 封锁：耦合反映中极少数5'- OH没有参加反映，用封锁试剂终止其后继续发生反映； (4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳固的核苷磷酸酯。 Q2.引物合成如何处置？
切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常常利用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
纯化：按照所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方式。常常利用的纯化方式有：C1八、OPC、PAGE和HPLC。
定量：按照寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
贮存：分装抽干。
Q3.合成的引物5’端是不是有磷酸化？
合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。若是需要您能够用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或要求咱们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。
Q4.需要什么级别的引物？
按如实验需要，肯定订购引物的纯度级别。
应用 一般PCR扩增 引物长度要求 < 60base >60 base 诊断PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变等 < 40base 20base左右 根据实验要求定 纯度级别要求 HEPD PAGE HEPD, PAGE HEPD HEPD, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 HEPDPAGE 反义核酸 根据实验要求定 HEPDPAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC Q5.需要合成多少OD数？
按如实验目的肯定。一般PCR扩增，2 OD引物，能够做500-1000次50ul标准PCR反映。若是是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
Q6.如何计算引物的浓度？
引物保留在高浓度的状况下比较稳固。一般情形下，咱们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保留浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：
V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量
引物的分子量能够从合成报告单上取得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。
溶解前您需要查对合成报告单和引物标签上的引物OD数是不是一致。若是不一致，请和咱们联系。咱们能够按照生产记录查到实际产量是多少。
Q7.如何计算引物的Tm值？
引物设计软件都能够给出Tm，与引物长度、碱基组成及所利用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = + x Log10[Na+] + (GC%) – 600/size＊ ＊公式中，Size =引物长度。
Q8.引物（含修饰）的分子量是如何肯定的？
非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上能够找到。若是需要估量一个引物的分子量按每一个碱基的平均分子量为，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62.
NA, NG, NC, NT, NI别离为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI别离为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod别离为修饰基团的数量和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（+）/2 = 。Ns为硫代数量，
硫代每一个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base A C G T I U 常规修饰基团分子量
5’-Biotin 5’-(6 FAM) 5’-HEX 5’-TET 5’-Cy5 5’-Cy3 Q9.如何溶解引物？
干燥后的引物质地超级疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末搜集到管底。按照计算出的体积加入去离子无菌水或TE缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液搜集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳固。
Q10.如何保留引物？
引物合成后，通过一系列处置和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。 干 粉：运输时常温运输，-20℃能够保留一年。
贮存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃能够保留半年。 工作液：常规利用，4℃保留，也可-20℃保留，但应避免反复冻融。 修饰荧光引物：需要避光保留，尽快利用为宜。 Q11.引物定量不准是怎么回事儿？
3’-(6 FAM) 3’-Amino Modifier C3 3’-Amino Modifier C7 3’-Thiol Modifier C3 3’-TAMARA 3’-Dabsyl Molecular Weight 咱们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情形的可能性有：
（1）定量错误、分装错误、引物抽干或收样进程中意外丢失。这种可能性有，可是很少，因为作为专业的引物合成公司，咱们的生产人员都是通过严格的专业培训，这种错误是要求谨慎避免乃至杜绝的。一般情形下，引物都有留样备份，接到用户投诉后，咱们都会找出留样从头定量，一般都没有问题，如确实存在问题，则可安排从头预备一份。
（2）系统误差，咱们以为10%左右为允许误差。利用进程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少量误差不影响实验。
（3）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作致使引物干粉部份丢失。 （4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确利用分光光度计，专门是利用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。这种情形比较常见。
例如，验证标2OD引物量是不是准确，简单的做法是： 加入1ml水，完全溶解混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,此光阴吸收的读数为。
Q12.最长能够合成多长的引物？
咱们合成过100base的引物，可是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，依照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处置还有丢失很多，最后的产量很低。
Q13.为何修饰引物的产量要比一般引物低，价钱要高?
主要因为是修饰单体稳固性较差，偶连时刻长，效率低，最后取得的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化进程损失大。修饰引物利用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价钱也高。
Q14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反映需要引物的5’磷酸基团。若是需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物若是还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
Q15.若是测序发觉引物突变，是不是有补偿？该如何处置？
若是出现测序发觉引物位置碱基错误的情形，咱们能够免费重合一次，没有其他任何补偿或补偿，不承担其他连带责任，这是国际行规。原因咱们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。
若是碰到这种情形，第一和咱们联系，咱们会检查合成序列是不是和原始定单一致，若是确认引物合成序列没有输错，咱们建议从头挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。按照咱们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以够了；40个以上的专门是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情
形下，每一个克隆突变的位点都不一样，正确的老是有的，就是如何找到它。您也能够要求咱们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的碰到问题的概率。基因拼接进程中，若是发觉一段区域突变点不多，就多测几个，不然就重合一下引物。
按照全基因合成的数据，咱们的引物能做到2000个碱基的片段，取三个克隆，其中至少有一个是正确的。
Q17.为何引物的OD260/OD280小于？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值太低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成紧密相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions Base Composition 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 Q18.一样的OD用PAGE检测，EB染色为何深浅不一？
通常能够用EB染色的方式来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB能够嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就超级差。所以不要用EB染色的方式来定量，而用紫外分光光度计检测。
Q19.如何检测引物的纯度？
实验室方便的做法是用PAGE方式。利用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一按时刻后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。若是条件许可，也能够用银染方式染色。
Q20.已经溶解的引物，为何原先利用正常，而过一段时刻再利用就不好了？
若是您溶解引物的水pH太低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使历时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议利用10mM Tris 缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳固。还有一种可能性是引物没有问
A260/280 题，而是PCR利用材料专门是模板的质量与先前利用的不完全一致。
Q21.引物是咱们设计的，此刻您扩不出来，咱们要负责吗？
不承担相关责任。咱们为一些实验经验不足的客户，免费设计引物，提供必然的便利。咱们遵循一般的引物设计原则设计好引物以后都会发给您确认，而后再安排合成并保证引物质量。可是设计的引物是不是能够知足您的实验要求，必然扩增出您需要的基因片段，谁也不能100%保证。
扩增无目的片段是引物质量有问题吗？
PCR扩增无目的条带或非特异性扩增，影响因素是多方面的，需要耐心地分析，如模板结构与质量、反映条件、引物设计等等。现今进展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中碰到的扩不出，扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增拷贝数很低的基因片段。通过提高模板质量、优化反映条件等方面找到对策，或有必要时从头设计引物，最好在实验时设置对照来判定原因。若是您怀疑引物的问题，请您第一测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是不是正确。若是量是正常的，请您告知我司您的引物编号，咱们会复查留存样品。如不明原因，咱们免费为您从头合成一次。若是仍然不能扩增，请您查找其它原因。多数情形下咱们复检引物质量都没有问题，因为咱们在引物出售前已经严格把好质量关。
Q23.常常利用荧光染料参数
Excitation染料 （激发波长， nm） 6-FA494 M Fluor495 escein TET JOE HEX CY3 TAM544 RA ROX 576 601 Orange 576 521 520 533 550 536 548 Yellow 559 570 Yellow-orange 520 Yellow-green 518 Emission （发射波长， nm） 颜色 Cy5 650 670 Red Q24.引物的质量是不是跟序列有关？
四种碱基的性质和各自保护基的性质都有不同。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个持续的G的引物。尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明，若是引物中有超过三个持续G的结构，传统方式取得的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方式都无效。
鼎国兴盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d（G）都能取得一样的超级好的结果。
