小球藻优良藻种的选育与特性研究

现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３　小球藻优良藻种的选育与特性研究　吴晓娟，刘海燕，顾继锐，罗国强　（成都通威水产科救公司，四川成都６１００８１）　摘要：本文研究了在相同培养条件下，ｌ１株小球藻的生长、光能利用率、色素以及蛋白质含量。实验结果显示，分离自成都本　地的小球藻ｃ５生长速度上具有很强的优势，达到０．０３１　ｇ／Ｏ，・ｄ），可溶性蛋白含量为４４．７３％，叶绿素含量达到２９．０５　ｍｇ／ｇ，类胡萝卜　素的含量达到１５．３５　ｍｇ／ｇ。因此，实际生产过程中可以选用小球藻ｃ５作为生产藻种。　关键词：小球藻；生长速率；光能利用率；蛋白含量；叶绿素ａ；类胡萝卜素　文章篇号：１６７３．９０７８（２０１３）３．５７６．５７８　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　Ｓｔｒａｉｎｓ　、ⅧＸｉａｏ－ｊｕａｎ，ＬＩＵ　Ｈａｉ－ｙａｎ，ＧＵＪｉ－ｒｕｉ，ＬＵＯ　Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ　（Ｃｈｅｎｇｄｕ　ＴｏｎｇｗｅｉＡｑｕａｔｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００８１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｒｏｗｔｈ　ｐａｔｔｅｒｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆｅｌｅｖｅｎ　ｓｗａｉｎｓ　ｏｆＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｉｎ　ｔｅｒｍｓ　ｏｆｇｒｏｗｔｈ，ｌｉｇｈｔ　ｕｓｅ　ｅｆｆｉｃｉｎｃｙ，ｐｉｇｍｅｎｔ　ａｅｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｏｆ　ｅｌｅｖｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ｔｈｅ　Ｃ５　ｓｌｌ＇ａｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｉｈｅｒｇｒｇｏｗｔｈ　ｒａｔｅ，ａｂｏｕｔ　０．０３１　ｇ／ｆｔ・ｄ）．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ　４．７３％．Ｔｈｅｐｉｍｅｎｔｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ａ　ｎｄ　ａｃａｒｏｔｎｏｉｅｄ　Ｗａｓ２９．０５ｍｇ／ｇａｎｄ１５．３５ｍｇ／ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄ：ｃｈｌｏｒｅｌｌａ；ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ；ｌｉｈｔｇ　ｕｓｅ　ｅｆｆｉｃｉｎｃｙ；ｓｅｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ａ；ｃａｒｏｔｎｏｉｅｄ　近年来，小球藻作为营养功效食品，已经被人们　培养基为改良的ＳＥ（添加３．３６　ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３，其　它营养盐同ＳＥ），　１－３培养方法　培养温度为２５℃，光强为６０００　ｌｘ，光暗周期ｌ２：１２　ＬＤ。每天摇动培养瓶４次。初始ｐＨ调整到６．５￣７．０，　初始藻浓度为２ｘ１０　＋／ｍＬ，静置培养。以藻细胞的　生长速度、光能利用率、色素以及蛋白质含量确定出　最优小球藻藻种。　１．４细胞浓度以及生物量的测定　取１００　ｍＬ的藻液过滤到已知干重的滤膜上，用　广泛认识Ｌ１　Ｊ。小球藻是一种生长迅速的单细胞绿藻，　光合效率高，能够高效的固定二氧化碳，同时积累丰　富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和色素　等［　Ｊ。其中，含有的小球藻生长因子能够有效的改善　机体免疫功能，对微生物具有益生作用【４￣５Ｊ。　小球藻资源的调查及筛选工作将为微藻的研究开　发提供优良的种源，对小球藻的研发和产业化进程具　有积极的推动作用。不同的藻种在相同的培养条件下，　在生长速度和营养物质的积累上都会有差异　。因　此，在小球藻工业化生产中，筛选性能优良的小球藻　藻种是搞高产量和改善产品质量的基础。　本研究考察了不同来源的ｌ１株小球藻藻种在生　长速度、光能利用率、色素以及蛋白质含量的差异，　确定了最佳培养小球藻藻种。　１材料与方法　１．１藻种　小球藻：所用小球藻藻种为Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、　蒸馏水冲洗掉藻体上附着的盐分，放入烘箱中经８０℃　烘干２４ｈ，放在干燥皿中冷却至少２０ｒａｉｎ后称重，即　得到藻细胞的生物量【８】。以新鲜培养基为空白，将藻　液混匀后测定其６８０　ｎｎｌ波长下的吸光度，即得到藻　细胞的浓度。　１．５光能利用率　根据能量守恒定律确定藻细胞的能量转换关系确　定光能利用率、王，的计算［９】。　ｕ？＝ｐｂ　Ｈｂｉ０珂ａｓｊＦｖｏｌ　注：Ｐｂ：单位体积增加干重；Ｐｂ：单位体积增加干重；　Ｈ　：藻细胞燃烧热值；Ｆｖｏｌ：单位体积接收的光能（球状ＰＡＲ　辐射测量仪测定光量子后计算）。　Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃｌｌ，保藏于成都通威　水产科技公司的藻种库。　１．２培养基　收稿日期：２Ｏ１２－０９－１２　１．６藻细胞可溶性蛋白质含量的测定　采用考马斯亮蓝法　ｏＪ。取一定量的藻液离　￣（５５００　作者简介：吴晓娟（１　９８３一），女，工程师，研究方向：微藻利用和开发　５７６　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３　ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）后进行冷冻干燥（－５２＋２℃，４８ｈ）。精　确称取一定量的小球藻冷冻干燥粉，加２０　ｍＬ水用进　行破碎（４００　Ｗ，３０　ｍｉｎ）后冻融，反复三次后，离心　（５５００　ｒ／ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ），取上清夜。上清夜即为待分析　藻细胞可溶性蛋白。取样品提取液０．１　ｍＬ放入具塞试　管中，加入０．９　ｍＬ蒸馏水稀释ｌ０倍，再加入５　ｍＬ　考马斯亮蓝Ｇ－２５０试剂，充分混和，放置５　ｍｉｎ后用　１　ｃｍ光径比色杯在５９５ｎｌＴｌ下比色，记录ＯＤ５９５ｍｎ值，　并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含　量。　１．７藻细胞色素含量的测定　取一定量的藻液过滤，加入纯甲醇溶液置于４℃　的低温条件下过夜，离心　Ｏ０ｏ　ｇ、１０　ｍｉｎ），取上清液，　用分光光度计测定特定波长的吸光度值，根据吸光度　值计算细胞色素含量，然后再换算为含量。ｃｈｌ　ａ含量　计算公式为：ｃｈｌ　ａ（ｇｇ／ｍＬ＝１　６．２９ｘＯＤ６６５—８．５４ｘＯＤ６５２，　类胡萝卜素含量计算公式为：　Ｊ　一＼盖　事　Ｑ　Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ（ｒｔｇ／ｍＬ）＝７．６ｘ（ＯＤ４８ｏ一１．４９ｘＯＤ５１ｏ）　“　２结果与讨论　２．１　ｌ１株小球藻生长特性的比较　１｜５　１．ｏ　。　Ｏ・５　ｏ．ｏ　’Ｉ。ｉｍｅ／ｄ　图１　１１株小球藻藻种的生长曲线　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ　ｏｆ　１１　Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｗａｉｎｓ　ｌ１株小球藻均经过２　ｄ的延滞期后进入快速生长　期，在培养的１３　ｄ内，各藻种在第３～１０　ｄ内快速增　长，１０　ｄ后趋于稳定，ＯＤ６８０从初始０．ｏ０１左右上升到　１．５左右（图１）。１ｌ株小球藻的比生长速率　在第２　天达到最高值后，随着时间的推移，呈下降的趋势，　１０ｄ后趋于稳定（图２）。小球藻藻种Ｃ３的增长速率　最大，达到０．０３７　ｇ／０－・ｄ），其次为Ｃ７　０．０３６　ｇ／（Ｉ．・ｄ），而　Ｃ５为０．０３１　・ｄ）（图３），各组间差异显著（Ｏｎｅ．ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ，ｐ＜Ｏ．０１）。从生长曲线和比生长速率Ｌｔ看，　小球藻在培养１０　ｄ时，各藻种都持续稳定生长，因此，　培养小球藻时，可以选用１０　ｄ为一周期。从生长特性　看，小球藻藻种Ｃ３、Ｃ７、Ｃ５在ＩＩ株小球藻种，具　有生长优势，可以作为潜在的候选藻种。　Ｔｉｍｅ｜ｄ　图２　１１株小球藻藻种的比生长速率　图３　１１株小球藻藻种的干重　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　１１　Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｏ．６　０．５　０．４　、０．３　｝　０．２　０．１　Ｏ．Ｏ　Ｃ１　Ｃ２　Ｃ３　Ｃ４　Ｃ５　Ｃ６　Ｃ７　Ｃ８　Ｃ９　Ｃ１Ｏ　Ｃｌ１　图４　１１株小球藻的光能利用率　Ｆｉｇ．４Ｔｈｅｌｉｇｈｔｕｓｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ１１　Ｃｈｌｏｒｅｌｉａ　ｓｔｒａｉｎｓ　２．２　ｌ１株小球藻光能利用的比较　光能利用率是衡量微藻生长能力的重要指标，本　文测定了１１株小球藻的光能利用率。小球藻Ｃ１、Ｃ２、　Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１的平均　的光能利用率分别为０．３５７％、０．３６２％、０．５３６％、　０．３　１６％、０．４４８％、０．３４７％、０．５２９％、０．４３６％、０．２２７％、　０．４０８％、０．４７７％（图４）。其中小球藻Ｃ３的光能利　用率最高，与其他小球藻种具有显著差异（Ｔ－ｔｅｓｔ，　ｐ＜０．０５）。，这一点说明Ｃ３小球藻有望作为工业化生产　过程中的初始藻种，提高工业化生产过程中的能量利　用率，降低成本。　２－３　１ｌ株小球藻可溶性蛋白质含量的比较　５７７　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３　Ｃ１　Ｃ２　Ｃ３　Ｃ４　Ｃ５　Ｃ６　Ｃ７　Ｃ８　Ｃ９　Ｃ１０　Ｃｌ１　图５　１　１株小球藻藻种的可溶性蛋白含量　Ｆｉｇ・５　Ｔｈｅ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　１１　Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｔｒａｉｎｓ　培养１３　ｄ后，小球藻Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、　Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１　１的的可溶性蛋白含量分　别为１８１．７、２６６．９、２５３．１、２７５．８、４４７．３、３７３．１、３０２．７、　３６５．４、２７６．２、４１６．２、３２４．８　ｍｇ／ｇ（图５），其中小球　藻Ｃ５的含量最高，达到了４４７．３　ｍｇ／ｇ，与其他小球藻　藻种在可溶性蛋白含量上具有显著性差异（Ｔ．ｔｅｓｔ，　ｐ＜０．０５）。蛋白质是小球藻细胞中有价值的化合物中的　非常重要的一种，因此具有高蛋白质含量的小球藻是　工业化生产的基础，而小球藻藻种Ｃ５在１１株小球藻　种的含量最高，可以作为候选对象。　２．４　１ｌ株小球藻色素含量的比较　∞　目　一　＼　砖　皇　ｌＯ　Ｏ　Ｃ１　Ｃ２　Ｃ３　Ｃ４　Ｃ５　Ｃ６　Ｃ７　Ｃ８　Ｃ９　ＣｌＯ　Ｃ１ｌ　图６　１１株小球藻的叶绿素ａ含量　Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ａ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＩＩ　Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｔｒａｉｎｓ　小球藻细胞中的色素能作为食品，药物和化妆品　的等的色素添加剂。小球藻细胞中的叶绿素的含量高　于现在商业上应用的脱水紫苜蓿的叶绿素含量【ｌ　。类　胡萝卜素在生物体内起了十分重要的作用。因此，小　球藻细胞中的色素积累是衡量小球藻藻种性能的优良　指标。本此实验在培养１３ｄ后，小球藻Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、　Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１的叶绿素ａ　（ｃｈｌ　ａ）含量分别为３Ｏ．３９、３１．２７、２２．２２、３７．６７、２９．０５、　３８．６８、ｌ９．０８、２９．０８、３８．９３、３６．００、２８．９９　ｍｇ／ｇ（图６），　类胡萝卜素（Ｃａｒ）含量分别为ｌ５．３８、１６．２ｌ、１２．３Ｏ、　】８．９５、１５．３５、】９．６９、１１＿３７、１４．８５、１１．４５、１５．１２、　５７８　１１．８９　ｍｇ／ｇ（图７）。其中叶绿素ａ（ｃｈｌ　ａ）含量最高　的为小球藻Ｃ９，达到了３８．９３　ｍｇ／ｇ，最低的为Ｃ７，　仅为１９．０８　ｍｇ／ｇ；小球藻藻种Ｃ６的类胡萝卜素含量最　高，为ｌ９．６９　ｍｇ／ｇ。小球藻藻种Ｃ７的含量最低，为　１１．３７　ｍｇ／ｇ。而小球藻种Ｃ５在这１１株小球藻藻种中，　叶绿素ａ，类胡萝波素的含量均处于中间位置。　盖　邑　＼　１５　柚醛　Ｌ　辐　１Ｏ　器　５　Ｏ　Ｃ１　Ｃ２　Ｃ３　ｃ４　ｃ５　ｃ６　ｃ７　ｃ８　Ｃ９　Ｃ１Ｏ　Ｃｌｌ　图７　１１株小球藻类胡萝ｌ、素的含量　Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　１１　Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｔｒａｉｎｓ　３结论　３．１小球藻Ｃ３，具有生长速度快，体现在其ＯＤ６８０　吸光度值、干重的增长、比生长速率、光能利用率的　值均最高的特点。但作为营养功效食品，其蛋白和叶　绿素，类胡萝卜素都是较低，不适合作为工业化培养　的藻种。　３－２从生长速度、可溶性蛋白、类胡萝卜素含量综合　考虑，小球藻Ｃ５在ｌ１株小球藻中均排在前列，可以　作为工业化培养的藻种。　参考文献　［１］　张强－，Ｊ、球藻活性成分的研究及食品方面的开发进展［Ｊ］．山　东青年，２０１０，８：５９．６０　［２］　孙维宝，李龙囡，张继，等＿，Ｊ、球藻的营养保健功能及其在食　品工业中的应用［Ｊ】．食品科学，２０１０，９：３２３－３２８　【３］Ｄｈｙａｎａ　Ｂ，Ｂｅｖｅｒｌｙ　Ａ．Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ：ｔｈｅ　ｅｍｅｒａｌｄ　ｆｏｏｄ［Ｍ］．　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ：ＣＡ，１９８４　［４］　郝宗娣，刘洋洋，续晓光，等．，Ｊ、球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）活性成分的　研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１０，３１（１２）：３６９．３７２　［５］　杨艳婧，王冰芳，廖晓霞，等．木薯淀粉水解液对小球藻生物　量和油脂含量的影响［Ｊ］．现代食品科技，２００９，２５（１１）：１２７５－　１２７８　［６　６］桂林，史贤明，李琳，等．蛋白和小球藻不同培养方式的比较　［Ｊ】．河南工业大学学报，２００５，２６（５）：５２．５５　［７】　赵华，董晓宇，夏嫒嫒，等．氮源对小球藻光合作用和色素积　累的影响【Ｊ】．现代食品科技，２０１２，２８（４３）：３６７．３７３　（下转第５６７页）　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３　（上接第５７８页）　［８】　黄美玲，何庆，黄建，等小球藻生物量的快速测定方法［Ｊ］．河　北渔业，２０１０，４：１－３　［１０］王孝平，邢树礼．考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究［Ｊ】．天　津化工，２００９，２３（３）：４０－４１　［１１］ＰｏｒｒａＲ　Ｊ．Ｔｈｅ　ｃｈｅｑｕｅｒｅｄｈｉｓｔｏｒｙｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄｕｓｅ　ｏｆ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｅｑｕａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　［９】Ｈａｌｌ　Ｄ　Ｏ，Ｃｉ６ｎ　Ｆｅｒｎ￣ｄｅｚ　Ｆ　Ｇ　ａｌ￣Ｚａ／＇ｅｓ　Ｇｕｅｒｒｅｍ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．　Ｏｕｔｄｏｏｒ　ｈｅｌｉｃａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｆｌｌｄ－ｕｄｙｒｍｍｉｃｓ　ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓ　ａ　ａｎｄ　ｂ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｒｅｓ．２００２，７３：４９－１５６　ａｎｄ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ，　［１２】陈峰，姜悦．微藻生物技术［Ｍ】＿中国轻工业出版，１９９９　２００３，８２（１）：６２－７３　５６７