最全的动物疫病实验室检测方法

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常见疫病实验室检测方法 ......................................... 错误!未定义书签。 目录 ........................................................... 错误!未定义书签。 常见ELISA操作方法 ............................................. 错误!未定义书签。

亚洲 1 型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒 ................. 错误!未定义书签。 猪瘟抗原检测试剂盒 ........................................... 错误!未定义书签。 猪瘟病毒抗体阻断ELISA试验 ................................... 错误!未定义书签。 猪瘟单抗酶联免疫吸附试验 ..................................... 错误!未定义书签。 口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA） ...................... 错误!未定义书签。 口蹄疫抗体液相阻断-酶联免疫吸附试验 .......................... 错误!未定义书签。 PRRS抗体间接酶联免疫吸附试验 ................................ 错误!未定义书签。 犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书 ........................... 错误!未定义书签。 犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书 ........................... 错误!未定义书签。 常见PCR操作方法 ............................................... 错误!未定义书签。 猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒 ................................. 错误!未定义书签。 猪圆环病毒PCR诊断试剂盒 ..................................... 错误!未定义书签。 常见RT-PCR操作方法 ............................................ 错误!未定义书签。 口蹄疫病毒分子检测诊断试剂盒 ................................. 错误!未定义书签。 H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒说明书(20次) ............... 错误!未定义书签。 新城疫病毒RT-PCR 检测试剂盒 ................................. 错误!未定义书签。 猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒 .................................... 错误!未定义书签。 凝集、血凝实验操作方法 ......................................... 错误!未定义书签。 弓形虫间接血凝试验(lHA)试剂使用说明书 ........................ 错误!未定义书签。 伪狂犬病乳胶凝集试验试剂盒 ................................... 错误!未定义书签。 猪细小病毒病乳胶凝集试验〈LAT〉诊断试剂盒使用说明书 .......... 错误!未定义书签。 猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验〈LAT〉操作程序 ................ 错误!未定义书签。 猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书及实验操作程序 ............. 错误!未定义书签。 口蹄疫正向间接血凝试验 ....................................... 错误!未定义书签。 高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验程序 ............. 错误!未定义书签。 琼脂扩散试验 ................................................... 错误!未定义书签。 鸡马立克氏病 ................................................. 错误!未定义书签。 禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验 ................................... 错误!未定义书签。 荧光抗体检测 ................................................... 错误!未定义书签。 猪瘟荧光抗体试验操作程序 ..................................... 错误!未定义书签。 对狂犬病疑似动物脑组织的直接免疫荧光(dFA)检测 ................ 错误!未定义书签。 血清学诊断检测常用试剂配方 ..................................... 错误!未定义书签。 禽流感HA和HI试验用溶液的配制 ............................... 错误!未定义书签。 补充实验 ....................................................... 错误!未定义书签。 猪流感病毒H1亚型Hl试验抗原与阴、阳性血清说明书 ............. 错误!未定义书签。

猪流感病毒RT-PCR检测 ........................................ 错误!未定义书签。 猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp2 1594~1680变异株）RT-PCR检测实验......................................................... 错误!未定义书签。 一、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清 ................. 错误!未定义书签。 二、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验 ............................... 错误!未定义书签。 动物结核病诊断操作规程 ....................................... 错误!未定义书签。

常见ELISA操作方法

亚洲 1 型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒

一 试剂盒内含物

.说明书 亚洲 1 型口蹄疫阳性对照血清( 己稀释浓度为 1:8) .96 孔 ELISA 板 亚洲 1 型口蹄疫阴性对照血清 .液体稀释槽 3% 双氧水

.U 型96孔抗原抗体反应板 25×PBST洗涤液(稀释时准确量取) .封板膜 豚鼠抗血清稀释液

.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 ) 终止液

.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清 包被缓冲液(碳酸盐)胶囊 .亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲液片剂 .兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物 OPD 片剂 二 器材准备 ( 需用户自备 )

1.移液器:5-50µl移液器、—10µl移液器、50—200µl移液器、50—300µl 12道移液器各一把。

2.移液枪尖 (若干)。

3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。

4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。 三、试剂准备(需用户完成) 1.包被缓冲液

将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放,1月内有效。

2. 洗涤液(PBST)

将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至

3.底物溶液

取1片柠檬酸—磷酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml∕瓶 ), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10µL 本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H202) 。务必加双氧水! 四、操作步骤

1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50µl, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。

2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应

根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。

图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图 S1 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:l024 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 1：64 1：128 1：256 1：512 1:1024 1:2048 1:4096 -1:4 1:8 图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。

图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图 S11:32 1:64 1:128 1:256 S2 S3 S4 S14 S5 S15 S6 S16 S7 S17 S8 S9 S18 S19 S10 +1:32 -1:4 1:64 1:128 1:256 1:8 S111:32 S12 S13 1:64 1:128 1:256 S20 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 以图 1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 µl/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 µ l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100µl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。

3.用洗涤液 (1×PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50µl封板,37℃温育1小时。

4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50µl,封板,37℃温育1小时。

5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度

(1:500), 每孔加 50 µl 封板 ,37 ℃温育 1 小时。

6. 同上洗板5次,每孔加50µl底物溶液 (务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再加50µl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。

五 结果判定 1. 试验认可标准

每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50µl/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在±范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。

2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)

抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。

3.结果判定

以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为,则其50%为。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度＞1:128 。

ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。

ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护；效价≤1:16, 不保护；效价在1:22-90之间,50%保护。

猪瘟抗原检测试剂盒

Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit(CSFVAg)

概 述

猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)都是瘟病毒科黄病毒属的成员。

猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引起猪的严重死亡。感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。

猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。

原 理

本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原。采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。形成的单克隆抗体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。通过酶标仪测定其吸光度。可以用450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。

试 剂

本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品(每个样品1孔，每个对照2孔)或46个样品(每个样品2孔，每个对照2孔)；或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品(每个样品2孔)。为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。

试 剂 数 量 1、多克隆羊抗血清包被板条 8孔×12条(96孔) 2、10倍浓缩样品稀释液(10x) 55ml 足以配制550mL直接使用的1x稀释液

3、10倍浓缩洗涤液(10x) 125ml 足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度(1x) 4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂 4ml 5、阳性对照，含有防腐剂 6、阴性对照，含有防腐剂 7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物(100x)，

辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含有防腐剂 200μl 8、酶标抗体稀释液 15ml 9、底物液，TMB/H2O2溶液 12ml 10、终止液，1M HCI(小心，强酸) 12ml 注意事项

1、仔细阅读并遵守操作说明；

2、试剂盒试剂于2～7℃冷藏保存。建议将浓缩的洗涤液(10x)保存在18～25℃室温，以免形成结晶。

3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。

4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于2～7℃冷藏保存。 5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。 6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。处理试剂时要小心。 7、不要用超过保质期的检测试剂盒。

8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。 9、每个样品都用单独的吸头。

10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。 11、配制试剂时只能用超纯水。 12、不要用嘴吸取液体。

13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，避免与皮肤和眼睛接触。

14、终止液为1MHCl，HCI为强酸并且能造成灼伤，小心处理。 15、本试剂盒只能用于体外诊断。兽医专用。 试剂配制

1、包被的反应板、猪瘟病毒特异性单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、底物溶液、终

止液为现用试剂。

2、洗涤液

10倍浓缩洗涤液必须用超纯水或双蒸水进行10倍(1：10)稀释，稀释的洗涤液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；或冰冻保存，至少可以保存一年。例如：配制500ml稀释的洗涤液，将450ml超纯水或双蒸水加到50ml浓缩液中，混匀。注意：如果浓缩液有结晶，在使用前必须溶解。可将瓶子放在温水中30分钟以上。

3、样品稀释液

10倍浓缩样品稀释液必须用超纯水或双蒸水进行10倍(1∶10)稀释，但如果检测全血样品时，将适量的10倍浓缩液与等体积的超纯水混合，制成5倍浓缩液(5X)即可。将制备的稀释液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；或者冰冻保存，可以保存一年以上。

4、辣根过氧化物酶标记物(100x)

100倍(100X)浓缩标记物在使用前必须用标记物稀释液进行1∶100倍稀释。如果只使用部分试剂，只要用稀释液按100倍(1∶100)稀释足够本次使用的标记物浓缩液(旋涡振荡混勾)即可。稀释后的标记物溶液只能保存24小时。例如：10ml的辣根过氧化物酶标记物工作液，只需取100μl浓缩标记物(100X)加到10ml标记物稀释液中，在旋涡振荡器上混匀即可。 自备器材

1、精密移液器，5μ1至1000μ1 2、一次性移液吸头。 3、双蒸水或超纯水。 4、洗瓶或自动洗板机。 5、湿盒或封板胶带。 6、离心机，2000xg。 7、酶标仪。 8、离心管和小试管。 9、微量离心机，10，000xg。 10、旋涡振荡器。 11、剪刀和摄子。 12、溶液，制备白细胞用。 样品制备

注意：制备好的样品或组织可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这

些样品在应用前应该再次以1，500xg离心10分钟或10，000xg离心2～5分钟。 外周血白细胞

a) 取10ml肝素或EDTA抗凝血样品，1，500xg离心15～20分钟。

b) 用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500µl样品稀释液(1X)，在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，其间不时用旋涡器混合。然后直接进行步骤f操作；

c) 假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团(包括红细胞)。将细胞加进10ml的离心管，并加入5ml预冷(2～7℃，下同)的(氯化铵)混匀，静置10分钟。

d) 用冷(2～7℃)超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。 e) 弃去上清，向细胞团中加入500µl样品稀释液(1x)，用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。

f) 1，500xg离心5分钟，取上清液按\"操作步骤\"进行检测。

g) 注意：处理好的样品可以在2～7℃冷藏保存7天，或-20℃冷冻保存6个月，但在使用前必须再次离心。 外周血自细胞(简化方法)

a) 取～2ml肝素或EDTA抗凝血与等体积冷(2-8℃)0.17M NH4CI加入离心管混合。室温放置10分钟。

b) 1，500xg离心10分钟(或10，000xg离心2－3分钟)，弃掉上清。

c) 用冷(2～7℃)超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。 d) 弃去上清，向细胞团中加入500µl样本稀释液(1x)。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。取75µl按照\"操作步骤\"进行检测。 全血(肝素或EDTA抗凝)

a) 取25µl 10倍浓缩样品稀释液(10X)和475µl全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。

b) 室温下温育1小时，期间不时用旋涡器混合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。

或：直接将75µl全血加入酶标板孔中，再加入10µl 5倍浓缩样品稀释液(5X)。晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。再按照“操作步骤”进行检测。 细胞培养物

a) 移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入到离心管中。 b) 2，500xg离心5分钟，弃去上清。

c) 向细胞团中加入500µl样品稀释液(1x)。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间

不时用旋涡器混合。取此样品75µl按照“操作步骤”进行检测。 组织

最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于2～8℃冷藏保存1个月。每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。

a)取1～2g组织用剪刀剪成小碎块(2～5mm大小)。

b) 将组织碎块加入10ml离心管，加入5ml样品稀释液(1x)，旋涡振荡混匀，室温下放置1～2小时，期间不时用旋涡器混合。

c) 1，500xg离心10分钟，取75µl上清液按照“操作步骤”进行检测。 操作步骤

注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温18～25℃；使用前试剂应在室温条件下至少放置1小时。

1、每孔加入25µlCSFV特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器(8～12道)操作。 2、在相应孔中分别加入75µl阳性对照、阴性对照，各加2孔。注意更换吸头。 3、在其余孔中分别加入75µl制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。

4、置湿盒中或用胶条密封后室温(18～25℃)温育过夜。也可以放置室温温育4个小时，但是这可降低检测灵敏度。

5、甩掉孔中液体，用洗涤液(1X)洗涤5次，每次洗涤都要将孔注满。将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗涤液250～300µl用自动洗板机洗涤5次。注意：洗涤酶标板要仔细细心。

6、每孔加入100µl稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温温育1小时。 7、重复操作步骤5；每孔加入100µl底物液，在暗处室温温育10分钟。第1孔加入底物液开始计时。

8、每孔加入100µl终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入底物的顺序一致。 9、在酶标仪上测量样品与对照孔在450m处的吸光值，或测量在450nm和620nm双波长的吸光值(空气调零)。

10、计算每个样品和阳性对照孔的矫正吸光值的平均值(参见“计算方法”)。 计算方法

首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。

矫正OD=样本OD－阴性对照OD

注意：北京爱德士元亨生物科技有限公司奋进行平均值相UN值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统(xChek) 试验有效性判定

阳性对照OD平均值应该大于，阴性对照OD平均值应小于，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行重测。如果阴性对照的吸收值始终很高，将阴性对照液在微量离心机中10，000xg离心3～5分钟，重新检测。 结果判定

被检样品的矫正吸光值大于或等于，则为阳性： 被检样品的矫正吸光值小于，则为阴性； 被检样品的矫正吸光值大于，小于，则为可疑。

建议根据外周血白细胞处理方案或细胞培养物处理方案进行全血样品的处理和检测。

猪瘟病毒抗体阻断ELISA试验

本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断ELISA方法，通过待测抗体和单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合，采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。

1 操作步骤在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18～25℃。使用前应将各组分放置于室温至少1小时。

分别将50uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。

分别将50uL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。

分别将50uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。 轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。

将微量反应板用封条封闭置于湿箱中（18～25℃）孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜。

吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。

分别将100uL的抗CSFV酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30分钟。

洗板（见）后，分别将100uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟。加完第一孔后即可计时。

在每个反应孔中加入100uL终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。 在450nm处测定样本以及对照的吸光值，也可用双波长(450nm和620nm)测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。

计算样本和对照的平均吸光度值。计算方法如下：计算被检样本的平均值OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；

ODNEG- ODTEST 阻断率＝ ——————— × 100%

ODNEG

2 试验有效性阴性对照的平均OD450应大于。阳性对照的阻断率应大于50%。 3 结果判定如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在）。如果被检样本阻断率在30～40％之间，应在数日后再对该动物进行重测。

猪瘟单抗酶联免疫吸附试验

（一）材料及试剂 1．猪瘟单抗纯化抗原 2．兔抗猪IgG酶标抗体 3．猪瘟阳性血清 4．猪瘟阴性血清

1～4均由指定的生物制品所购买。 5．ELISA反应板 6．包被液

碳酸钠 1.50g碳酸氢钠 加至 1 000mlpH值 7．PBS液

氯化钠 8.90g、磷酸二氢钾 0.20g、无水磷酸氢二钠 2.13g、加双馏水 1 000ml 8．PBS－吐温洗涤液、PBS液 1 000ml、犊牛血清 5ml、混合即可 9．底物溶液

⑴ L柠檬酸液、柠檬酸 21g、双蒸馏水加至 1 000ml

⑵ L Na2HPO4液、Na2HPO4·12H2O 71.6g、双蒸馏水 加至 1 000ml ⑶ 磷酸盐－柠檬酸缓冲液 取⑴液 、⑵液 混匀即可 ⑷邻苯二胺液

取⑶液 50ml、双馏水 50ml、磷苯二胺 20mg、30%H2O2 ，待邻苯二胺溶化后再 加H2O2，现用现配。 10．终止液

浓H2SO4(98%) 、H2O （二）操作方法

1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，每孔包被100µl，4℃湿盒过夜。

2．次日取出，甩去孔内液体，3×3′冲洗。

3．将待检血清以PBS液做400倍稀释，每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释，于对照孔中加100μl。37℃温育～2h。

4．重复第二步，取出，甩去孔内液体，3×3′洗涤。

5．将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释，每孔加100μl，37℃温育～2h。 6．重复第4步。

7．每孔加底物溶液100µl，室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时，立即终止反应，并以阴性孔做空白对照。

8．每孔加终止液50µl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。 （三）结果判定

在猪瘟弱毒酶联板上，OD≥，为猪瘟弱毒抗体阳性；OD＜，为猪瘟弱毒抗体阴性。 在猪瘟强毒酶联板上，OD≥，为猪瘟强毒抗体阳性；OD＜，为猪瘟强毒抗体阴性。

口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA）

简介

口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病，传播迅速，可形成世界性大流行，对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。控制和消灭FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的国家，大多数动物血清口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白和病毒感染相关抗原(VIAA，即3D)抗体均为阳性，因此，一些基于结构蛋白和VIAA的诊断方法很难确定口问疫病毒感染与否。只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。日前的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3ABC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋向3ABC抗体。因此检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免疫动物。

口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒(FMD3ABC-I-ELlSA)对感染牛的检出率很高，敏感性在99%以上。对免疫牛的特异性在96%以上。 用途

FMD3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。该试剂盒不受血清型影响，适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物。 原理

FMD3ABC-I-ELISA试剂盒采用间接ELISA模式。用3ABC基因表达蛋白（Ag）包被ELISA板，洗板封闭。检测时，加入待检血清样品，如果血清样品中有3ABC抗体，与ELISA板上3ABC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底物后，就会出现颜色反应。如果待检样品为阴性，就不能形成抗原-抗体复合物，酶标二抗不会结合，因此就不显色。 注意事项

1．冰冻血清样品应充分融化，且应混和均匀。

2．血清稀释液和底物应平衡至室温应用。底物A在4℃为结晶状态，需要在室温或37℃水浴化开后应用。

3．最好在血清稀释板上稀释血清，以减小操作误差。

4．应使用相同的加样器加样，以保证加样量的准确，减小试验误差。 5．多道微量移液器所用的吸头应为同一规格和型号，避免加样误差。 6．应使用自动或手动连续洗板系统洗板。 7．加样先后次序应该一致，保证作用时间一样。

8．底物作用时间到后，如果颜色较浅，可适当延长作用时间。

9．本试剂盒只能检测一种动物的血清样本，应分别订购检测牛、猪或羊血清的试剂盒，以测定不同动物来源的血清。 试剂准备 l.洗涤液(PBST)

将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做l:25倍稀释即可。 操作步骤

1. 待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液1:2l倍稀释(120μL血清稀释液加血清6μL)，每孔加入lOOμL，阴、阳性对照血清平行加两孔，用封口膜封口，37℃结合30分钟。

2. 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。

3. 用血清稀释液按l:lOO比例稀释酶标二抗，每孔加入100μL，用封口膜封口，37℃结合30分钟。

4. 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。

5. 将底物A按1:50比例(体积比)稀释于底物B中(lmL底物B中加入2OμL底物A)，吹打混匀，每孔加入lOOμL，封口膜封口，37℃避光作用10～15分钟。 6. 每孔加入.100μL终止液。

7. 轻轻摇振混匀，测定波长450nm吸光值(OD450nm值)。 8. 阳性对照平均OD值应大于；阴性对照平均OD值应小于。 9. 结果计算:样品效价为:(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)。 结果判定

若效价<，为阴性；效价在～之间为可疑；效价>为阳性。可疑和阳性样品应进行复测，复测为可疑或者阳性时，应判为阳性。

口蹄疫抗体液相阻断-酶联免疫吸附试验

一 试剂盒内含物

.说明书 亚洲 1 型口蹄疫阳性对照血清( 己稀释浓度为 1:8) .96 孔 ELISA 板 亚洲 1 型口蹄疫阴性对照血清 .液体稀释槽 3% 双氧水

.U 型96孔抗原抗体反应板 25×PBST洗涤液(稀释时准确量取) .封板膜 豚鼠抗血清稀释液

.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 ) 终止液

.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清 包被缓冲液(碳酸盐)胶囊

.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲液片剂 .兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物 OPD 片剂 二 器材准备 ( 需用户自备 )

1.移液器:5-50µl移液器、—10µl移液器、50—200µl移液器、50—300µl 12道移液器各一把。

2.移液枪尖 (若干)。

3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。

4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。 三、试剂准备(需用户完成) 1.包被缓冲液

将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放,1月内有效。

2. 洗涤液(PBST)

将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至

3.底物溶液

取1片柠檬酸—磷酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml∕瓶 ), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10µL 本试剂盒配备的 3% 的双氧 水(H202) 。务必加双氧水。

四、操作步骤

1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50µl, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。

2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应

根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。

图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图

S1 SSSSSSSSS1+1:32 -1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:l022 3 4 5 6 7 8 9 0 1：64 1：128 1：256 1：512 1:1024 1:2048 1:4096 1:8 4 图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。

图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图

S11:32 1:64 1:128 1:256 S2 S3 S4 S14 S5 S15 S6 S16 S7 S17 S8 S9 S18 S19 S10 +1:32 -1:4 1:64 1:128 1:256 1:8 S111:32 S12 S13 1:64 1:128 1:256

S20 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 以图 1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 µl/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 µ l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100µl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。

3.用洗涤液 (1×PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50µl封板,37℃温育1小时。

4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50µl,封板,37℃温育1小时。

5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 每孔加 50 µl 封板 ,37 ℃温育 1 小时。

6. 同上洗板5次,每孔加50µl底物溶液 (务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再加50µl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。

五 结果判定 1. 试验认可标准

每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50µl/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在±范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。

2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)

抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。

3.结果判定

以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时 所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为,则其50%为。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度＞1:128 。

ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。

ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护；效价≤1:16, 不保护；效价在1:22-90之间,50%保护。

PRRS抗体间接酶联免疫吸附试验

1、 试剂的准备

所有的试剂在使用前，必须回温到室温。

洗液（10x）：1份清洗液加入到9份灭菌水或去离子水中，7天内用完。清洗液使用前摇匀溶解。

样本稀释液（3x）：1体积的样稀释液中加入2体积的蒸馏水或去离子水，2天内用完。

2、 样本的准备

阳性对照，阴性对照不必稀释，样本用样本稀释液200倍稀释，稀释方法：取5μl的样本加入95μl的样本稀释液，再取稀释了20倍的液体5μl加入到ELISA反应孔中，再加入45μl的样本稀释液。 3、操作步骤

将样本和对照加入到板孔中。阳性对照和阴性对照必须是双份。 1. 加入50μl阳性和阴性对照，及200倍稀释的样品在反应板孔。 2. 盖上膜，在37℃作用60分钟。

3. 去膜，用300μl的洗液洗3遍，并在吸水纸上将平板弄干（颠倒，在纸上轻敲） 4. 在每个空中加入50μl的酶标抗体。 5. 盖上膜在37℃作用60分钟。

6. 去膜，用300μl的洗液洗3遍，弄干。 7. 加入50μl的底物，轻摇板2次。

8. 将平板放在黑暗中在20-25℃作用10分钟。 9. 加入50μl终止液，轻敲平板混匀。

10. 用柔软的东西轻拭平板上的赃物，在450nm下读数并记录结果。 读数

A．实验成立条件

阳性对照的平均值OD450>，而且阳性对照平均值/阴性对照平均值>. B.结果的稀释

结果用IRPC表示，以下是计算公式

(OD450样品- OD450阴性对照平均值) IRPC＝ [ ———————————————— ]× 100 ODNEG

IRPC PRRS抗体说明 小于或者等于 大于 阴性 阳性

犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书

原理：

本试剂盒采用间接ELISA方法检测犬血清中犬细小病毒IgG抗体。在聚苯乙烯微孔酶标板上,包被纯化的犬细小病毒抗原。待检血清中的CPV抗体与包被抗原特异结合,再与HRP标记的兔抗犬IgG 抗体结合,形成抗原－抗体－酶标抗体复合物,加TMB底物作用显色,在酶标仪上测定OD值判定结果。 试剂盒的组成(96头份):

1. CPV抗原反应板 12*8孔 2. 20倍浓缩洗液 30ml*1瓶

3、样品稀释液 15mI*1瓶

4、CPV阴性对照 300μL*1支 5、CPV阳性对照 300μL*1支 6、50倍CPV酶结合物液 300μL*l支 7、酶结合物稀释液 15ml*1瓶 8、底物液A 8ml*1瓶 9.底物液B 8ml*1瓶 10、终止液 8ml*1瓶 11、封板膜 2张 12、自封袋 1个 13、说明书 1张 试剂准备:

1.将20倍浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍后备用(30ml浓缩洗液+570ml蒸馏水)。 2.将50倍CPV酶结合物液用酶结合物稀释液稀释50倍后备用(300u1 50倍CPV酶结合物液+15m1酶结合物稀释液),轻振混匀,当日用完。 操作步骤:

1.待检血清在板孔外用稀释后的洗涤液作l:16倍预稀释(150uL洗涤液+10uL待检血清)备用。

阴、阳性对照不稀释。

2.记下稀释样品的对应编号,每次试验设阳性对照、阴性对照、各2孔。

3.试剂盒平衡至室温,在反应板各孔中加入100uL样品稀释液。再分别在相应孔中加入经预稀释的待检血清1OuL,然后在对照孔中分别加入10uL阴、阳性对照。充分混匀后,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。

4.小心揭掉封板膜,弃去各孔中液体、拍干。每孔加满洗涤液,静置约30秒,如此重复洗涤5次,最后一遍拍干。

5.每孔加入经过稀释的酶结合物液100uL,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。 6.操作同步骤5。

7.每孔加入底物液A 50uL,再加入底物液B 50uL,轻拍混匀,置37℃避光显色10分钟。 8.每孔加入终止液50uL,轻轻振荡,置酶标仪450nm波长处测定OD值。 要求:

1.阳性对照OD值有效范围:≥。

2.阴性对照OD值有效范围:≤(阴性对照若有一孔大于应舍弃,如果两孔OD值都大于,应重复试验)。 结果判定:

1.临界值(Cut Off值)的计算:

Cut Off值=(阳性对照OD平均值一阴性对照OD平均值)×+阴性对照OD平均值 2.待检样本OD值≥临界值(Cut Off值)即判为CPV抗体具有保护效价:小于临界值(Cut Off值)即判为CPV抗体未达到保护效价。 注意事项:

1.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温平衡后再打开密封袋,未用完的微孔反应板条用自封袋加干燥剂保存。

2.各步加液均应使用加液器并经常校对其准确性,以减少实验误差。 3.洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止因洗涤不充分造成非特异性显色。 4.封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。

5.结果判定必须以酶标仪读数为准,且终止反应后应在10分钟以内测定其OD值。 6.所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 7.不同批次试剂不能混用。 8.请严格按说明书操作。

犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书

原理

本试剂盒采用间接ELISA方法检测犬血清中犬瘟热病毒IgG抗体。在聚苯乙烯微孔酶标板上,包被纯化的犬瘟热病毒抗原。待检血清中的CDV抗体与包被抗原特异结合,再与HRP标记的兔抗犬IgG抗体结合,形成抗原－抗体－酶标抗体复合物,加TMB底物作用显色,在酶标仪上测定OD值判定结果。 试剂盒的组成(96头份):

1、CDV抗原反应板 12*8孔 2、20倍浓缩洗液 30ml*1瓶

3、样品稀释液 15mI*1瓶 4、CDV阴性对照 300μL*1支 5、CDVF阳性对照 300μL*1支 6、50倍CDV酶结合物液 300μL*l支 7、酶结合物稀释液 15ml*1瓶 8、底物液A 8ml*1瓶 9.底物液B 8ml*1瓶 10、终止液 8ml*1瓶 11、封板膜 2张 12、自封袋 1个 13、说明书 1张 试剂准备:

1.将20倍浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍后备用(30ml浓缩洗液+570ml蒸馏水)。 2.将50倍CDV酶结合物液用酶结合物稀释液稀释50倍后备用(300u1 50倍CDV酶结合物液+15m1酶结合物稀释液),轻振混匀,当日用完。 操作步骤:

1.待检血清在板孔外用稀释后的洗涤液作l:16倍预稀释(150uL洗涤液+10uL待检血清)备用。

阴、阳性对照不稀释。

2.记下稀释样品的对应编号,每次试验设阳性对照、阴性对照、各2孔。

3.试剂盒平衡至室温,在反应板各孔中加入100uL样品稀释液。再分别在相应孔中加入经预稀释的待检血清1OuL,然后在对照孔中分别加入10uL阴、阳性对照。充分混匀后,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。

4.小心揭掉封板膜,弃去各孔中液体、拍干。每孔加满洗涤液,静置约30秒,如此重复洗涤5次,最后一遍拍干。

5.每孔加入经过稀释的酶结合物液100uL,贴上封板膜,置37℃温育20分钟。 6.操作同步骤5。

7.每孔加入底物液A 50uL,再加入底物液B 50uL,轻拍混匀,置37℃避光显色10分钟。 8.每孔加入终止液50uL,轻轻振荡,置酶标仪450nm波长处测定OD值。 要求:

1.阳性对照OD值有效范围:≥。

2.阴性对照OD值有效范围:≤(阴性对照若有一孔大于应舍弃,如果两孔OD值都大于,应重复试验)。 结果判定:

1.临界值(Cut Off值)的计算:

Cut Off值=(阳性对照OD平均值一阴性对照OD平均值)×+阴性对照OD平均值 2.待检样本OD值≥临界值(Cut Off值)即判为CDV抗体具有保护效价:小于临界值(Cut Off值)即判为CDV抗体未达到保护效价。

注意事项:

1.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温平衡后再打开密封袋,未用完的微孔反应板条用自封袋加干燥剂保存。

2.各步加液均应使用加液器并经常校对其准确性,以减少实验误差。 3.洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止因洗涤不充分造成非特异性显色。 4.封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。

5.结果判定必须以酶标仪读数为准,且终止反应后应在10分钟以内测定其OD值。 6.所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 7.不同批次试剂不能混用。 8.请严格按说明书操作。 保存

2－8℃储存，有效期6个月

常见PCR操作方法

猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒

用途

猪伪狂犬病毒(PRV)聚合酶链反应(PCR)试验用于检测猪血清和组织中的PRV,适用于PRV的检测、诊断和流行病学调查。

原理

提取病料DNA作为模板,高温使模板的一条双链DNA变性后形成两条单链,低温使引物与互补的模板形成双链,中温时,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链。每个循环包括:高温变性、低温退火、适温延伸三个过程。每一次循环使扩增的DNA片段拷贝数放大一倍。经过35次循环,使扩增的DNA片段放大了数百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。 试剂 1.试剂组成 名称 阳性对照 A：消化液 B：蛋白酶K C：酚/氯仿/异戊醇混合液 D：异丙醇 E：75%乙醇 F：灭菌去离子水 J：RT-PCR反应液 K：TaqDNA聚合酶 L:矿物油 M:50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用) N：溴化乙锭溶液 O：上样缓冲液 存。 器材

试剂盒内配有薄壁PCR管15个。 其它需要自备的物品

1.仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。

2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。 使用注意事项

1.所有接触PRV病料的物品均应合理处理,以免PRV污染实验室。

整个试验分PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。

数量 350μL 12ml 110μL 7ml 6ml 12ml 650μL 200μL 25μL 300μL 20ml 100μL 50μL 2.试剂贮藏条件:阳性对照、B、E、J、K液(塑料袋内)于一20℃保存,其它试剂4℃保

4．N液具有致癌性,小心操作。使用A液之前将其室温溶解为澄清透明。

5.注意防止试剂盒组分受污染．使用前将红盖管5000rpm离心15s,使液体全部沉于管底。

6.不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。

7.严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

8.本试剂盒为10头份CSFVRT－PCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。 样品制备

1样品采集:病死或扑杀的动物取有明显病变脏器的病变部与健康部交界处组织:待检活动物,用注射器取血5mL,4℃保存,送实验室检测。 2样品处理:每份样品分别处理。

组织样品处理:称取待检病料置组织研磨器中剪碎并研磨,加入1mLA液继续研磨。取己研磨好的待检病料上清100ul加入灭菌离心管中,再加入500ulA液和10ulB液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

全血样品处理:待血凝后取血清放于离心管中,8000rpm离心5min,取血清100ul,加入500ulA液和lOul B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

阳性对照处理:混匀后取100ul,加入500ul A液和lOul B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

阴性对照处理:取F液100ul,加入500ul A液和10ul B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。 操作步骤

l.病毒模板DNA的提取

从水浴锅中取出己处理的样品,加60Oul C液(用C液之前不要晃动,不要吸到C液上层保护液),用力颠倒10次混匀,1200Orpm离心lOmin。

取500ul上清置于灭菌离心管中,加入500ul D液,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中3Omin。取出样品管,室温融化,1300Orpm离心15min。

弃上清,沿管壁缓缓滴入lmL E液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上lmin,再将离心管50℃烘干或真空抽干15min(以无乙醇味为准)。 取出样品管,用30ul F液溶解沉淀,作为模板备用。 2PCR扩增

每份总体积20uL,取16uLJ 液(用前混匀),2ul K液,2uL模板DNA(见。混匀,作好标记,加入L液20uL覆盖。扩增条件为94℃3min后,95℃30s,65℃30s,72℃30s循环35次,72℃延伸7min。 结果 1．电泳

称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中,加入50倍稀释的M液200mL(取4ml M液用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入20 uL N液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15 uL混合3 uL O液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于

50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。 2 结果判定

PRV阳性对照出现217bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现217bp扩增带为PRV阳性,否则为阴性。

猪圆环病毒PCR诊断试剂盒

用途

猪圆环病毒(PCV)的聚合酶链反应(PCR)试验用于检测猪血清和组织中的PCV,适用于PCV的检测、诊断和流行病学调查。 原理

提取病料DNA作为模板,高温使模板的一条双链DNA变性后形成两条单链,低温使引物与互补的模板形成双链,中温时,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链。每个循环包括:高温变性、低温返火、适温延伸三个过程。每一次循环使扩增的DNA片段拷贝数放大一倍。经过35次循环,使扩增的DNA片段放

大了数百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。 试剂 1.试剂组成 名称 A：消化液 B：蛋白酶K C：酚/氯仿/异戊醇混合液 D：异丙醇 E：75%乙醇 F：灭菌去离子水 J：RT-PCR反应液 K：TaqDNA聚合酶 L:矿物油 M:50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用) N：溴化乙锭溶液 O：上样缓冲液 PCV-1阳性对照 PCV-2阳性对照 器材

试剂盒内配有薄壁PCR管15个。 其它需要自备的物品

1.仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。

2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、经焦碳酸二乙醋(DEPC)水处理的灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。 使用注意事项

1．所有接触PCV病料的物品均应合理处理,以免PCV污染实验室。

整个试验分PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。 4．N液具有致癌性,小心操作。使用A液之前将其室温溶解为澄清透明。

5．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将红盖管500Orpm离心15s,使液体全部沉于管底。

6.不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。

12ml 110μL 7ml 6ml 12ml 650μL 200μL 25μL 300μL 20ml 100μL 50μL 350ul 350ul 数量 2.试剂贮藏条件:阳性对照、B、E、J、K液于一20℃保存,其它试剂4℃保存。

7.严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

8.本试剂盒为10头份PCV PCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。 样品制备

1 样品采集:病死或扑杀的动物取有明显病变脏器的病变部与健康部交界处组织:待检活动物,用注射器取血5mL,4℃保存,送实验室检测。 2 样品处理:每份样品分别处理。

组织样品处理:称取待检病料置组织研磨器中剪碎并研磨,加入lmL A液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100uL加入灭菌离心管中,再加入500uL A液和10uL B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

全血样品处理:待血凝后取血清放于离心管中,800Orpm离心5min,取血清100uL,加入500uL A液和10uL B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

阳性对照处理:混匀后取l00uL,加入500uL A液和10uL B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

阴性对照处理:取F液l00uL,加入500μL A液和10uL B液,混匀后,置55℃水浴中过夜。 操作步骤

1. 病毒模板DNA的提取

从水浴锅中取出己处理的样品,加600uL C液(用C液之前不要晃动,不要吸到C液上层保护液),用力颠倒10次混匀,1200Orpm离心10min。

取500uL上清置于灭菌离心管中,加入50OuL D液,混匀,置液氮中3min或一70℃冰箱中30min。取出样品管,室温融化,13000rpm离心15min。

弃上清,沿管壁缓缓滴入lmL E液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上lmin,再将离心管真空抽干或50℃烘干15min(以无乙醇味为准)。 取出样品管,用3OuL F液溶解沉淀,作为模板备用。 2 PCR扩增

每份总体积20uL,取16uL J液(用前混匀),2uL K液,2uL模板DNA(见。混匀,作好标记,加入L液20uL覆盖。扩增条件为94℃3min后,94℃30s,62℃45s,72℃45s,循环35次,72℃延伸10min。 结果 1．电泳

称2g琼脂糖放于500mL锥形瓶中,加入50倍稀粹的M液200mL(取4mL M液用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入10uL N液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15uL混合3ul O液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。 2 结果判定

PCV－I 阳性对照出现652bp扩增带和PCV-Ⅱ 阳性对照出现1154bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现652bp扩增带为PCV-I阳性,出现1154bp扩增带为PCV-Ⅱ阳性,否则为阴性。

常见RT-PCR操作方法

口蹄疫病毒分子检测诊断试剂盒

简介

口蹄疫病(FMD)是口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种烈性传染病,被国际兽医组织列为消灭和控制的A类疫病的首位。在全世界范围内曾几度广泛流行，严重破坏畜牧业生产和动物及其产品的国际贸易,造成巨大的经济损失和社会政治影响。严重影响着我国畜牧业的发展,因此,快速、准确的诊断对控制和消灭该病有着极其重要的作用。为了提高对FMD亚临床症状、肉品等的检测我们建立了三重RT-PCR诊断方法,适用于动物淋巴结、扁桃体、肉品及OP液等临床样品中FMDV的检测,能同时在同一反应管中扩

增出一条以上的目的DNA片段,该方法具有高度敏感、特异和简便的特点。 用途

本试剂盒采用一步法完成RT－PCR反应。试剂盒中含有提取病毒RNA One Step RT－PCR反应用的全部试剂,可以简便而有效的检测样品。适合多血清型(包括A、O、AsiaⅠ型)FMDV的检测。适用于动物淋巴结、扁桃体、肉品OP液等样品检测。 原理

一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同-PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理与一般PCR相同。 试剂盒组成

溶液A(TRIzoL) 20ml 溶液B(二氯甲炕) 20ml 溶液C(异丙醇) 10mL 溶液D(RNaseFreedH20) 20mL 溶液E(OneStepRNAPCR混合液) 400ml 溶液F(AMVReverseTranscriptaseXL,5u/ul) l0ml 溶液G(RNaseInhibitor 40u/ul) 10ul 溶液H(AMV..optimizedTaq,5u/ul) 10ul 溶液I(阳性对照) 200ul 试剂盒包,装分为A和 B两部分,A部分4℃保存,B部分-20℃保存。 使用方法 1.总RNA萃取

1)取500μL组织样品研磨上清液置 eppendorf管中,加等量(500ul)溶液B,快速振荡数秒,8000r/min,4℃,离心5min。细胞毒、水泡液、阳性样品不经此步处理。 2)取主清液200μL置管中,加入lOOOul溶液A,反复混匀,冰上放置5min。取阳性对照样品(l00-200μL均可),同时提时RNA。

3)加200ul溶液B,小心盖上帽盖,用力摇动eppendorf管15秒,室温放置5min。 4)12000r/min,4℃,离心l5min,可见分为三层,上层水相含RNA

5)转移水相至一新eppendorf管,加入等量溶液C(约500μL),混匀,室温放置5min 6) 12000r/min 4℃,离心lOmin,离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样RNA沉淀。 7)洗RNA:弃上清,加lOOOul 75%乙醇(使用前用溶液D加无水乙醇配置而成,-20℃预冷)漂洗沉淀,漂洗二次,l000r/min,4℃,离心5min

8):室温充分干燥RNA沉淀。加lOul溶液D,即可用于PCR扩增。可以-20℃保存备用 2.一步法RT-PCR

反应总体积25ul向扩增管中加入下列反应物: l)OneStepRNAPCR混合液:

2)AMV Reverse Transcriptase XL(溶液F): 3)RNase Inhibitor (溶液G):

4)AMV-Optimized Taq(溶液H): 5)RNA:5ul

空白对照在:以RNase Free D H2O代替模板,同样条件下扩增。 高速离心10秒后,将反应管放入扩增仪中,指令设定程序开始工作。 反两条件:1)50℃,30min 2)94℃,2min

3)94℃，50S ；58℃ ，50S； 72℃，60S ；35个循环。 4）72℃ 8min 3.结果分析和判定

1） %琼脂糖凝胶板的制备 称取1.5g琼脂糖,加入100ml l×TAE缓冲液中。加热融化后加5μL(lOmg∕ml) 溴乙锭,混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放入电泳槽中,加l×TAE缓冲液淹没胶面。

2） 加样 取6-8uL PCR扩增产物和2μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时上样标准DNA Marker和空白对照。

3） 电泳 电压80V-100V,或电流40mA-50mA。电泳30min－4Omin

4）结果观察和判定 电泳结束后,取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。强阳性样品电泳结果应为三条大小不一的条带,分别为634bp 、483bp和278bp。如某一件检样品扩增产物的DNA布至少有一条与以上条带大小相符,同时空向对照无扩增条带,则该样品判定为阳性。

H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒说明书(20次)

1 适用范围

本试剂适用于检测禽组织、鸡胚尿囊液和分泌物、排泄物棉拭子中H5亚型禽流感病毒核酸。

2 试剂盒组成及保存

RT-PCR体系 ×22管 阳性对照 30ul×1管 上样缓冲液 100ul×1管 -20℃存放,不要反复冻融。有效期3个月。 3 准备工作

提取阳RNA

(根据经验选择商品化试剂或者自行配制)；

RT-PCR体系，用前要先溶化，瞬时离心将液体系甩至管底。 4 操作步骤

取25ulRNA转移到RT-PCR体系管中,加入阳性对照或者无RNA酶水作为阳性和阴性 对照,总体系25ul。

置子PCR仪中,循环参数为45℃逆转录45min，94℃预变性2min,94℃30s、52℃45S、68℃45S,35个循环,最后68℃延伸8min。

取5ul PCR产物,混合l ul上样缓冲液,%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。以DNA分子量Marker为参考。

结果判定,出现372bp大小条带定为H5亚型流感病毒检测阳性,否则判为阴性。如果条带极

弱,建议作一次复核,再次出现372bp带判为阳性,否则定为阴性。 附：

l)病料的处理:现地采集的组织脏器病抖,先进行研磨,再按照每克重量加入1ml PBS,混匀,按10比例稀释后用于RNA的提取。棉拭子病料直接加入1ml PBS,混合后取溶液用于RNA的提取,不要稀释。

2)RNA的提取:根据自己实验室经验选择商品化RNA提取试剂或自行配置。 Trizol LS提取的RNA操作过程：样品 250ul,加750ulTrizol LS裂解液,混合震荡5分钟(尽量保证裂解后的液体透明)加200u1氯仿,12000转,4℃离心15分钟,取上清,加500ul异丙醇,室温沉淀10-15分钟,12000转,4℃离心15分钟,弃上请,缓慢加入75%乙醇洗沉淀一次,倒置滤纸吸干管壁余液,真空抽干或37℃烘干,加入无RNA酶的水20ul,-70℃保存备用。

Promega RNA提取步骤:

1 取1.5mI DEPC处理过的离心管,加入待检样品100ul,加300ul变性液,继续加入30ul2M醋酸钠。反复颠倒离心管4-5次,以混合均匀。

2 加入酚:氯仿:异戊醇混合液 300ul,小心混合离心管3-5次,置于冰上静置15分钟。 3 12000转/分 4℃离心20分钟,小心转移上清与另一个干净的离心管中。

4 加入等体积的异丙醇,于-20℃静置至少5分钟,沉淀阳RNA12000转/分4℃离心10分钟。

5 弃上请,加入75%的冰乙醇,温和地反复颠倒离心管3-5次,12000转/分4℃离心5分钟。

6 弃上清,用滤纸吸干管壁余液,真空抽干或者37℃烘干5-20分钟,注意不要过于干燥,以免RNA不易溶解。

7 加入l0ul DEPC处理水,溶解RNA,-70℃保存。 5 电泳照片示例

-1

新城疫病毒RT-PCR 检测试剂盒

用途

新城疫病毒反转录聚合酶链反应(RT-PCR),用于检测禽血清、组织、呼吸道分泌物中的NDV,适用予NDV的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒不能用于区分强弱毒。 原理

利用异硫氨酸胍法提取RNA,在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。 试剂 1.试剂组成

名称 阳性对照 A：变性液 B：醋酸钠溶液 C：酚/氯仿/异戊醇混合液 D：异丙醇 E：70%乙醇 F：DEPC处理的灭菌去离子水 G：RNA酶抑制剂 H：RT-PCR反应液 I：反转录酶 K：TaqDNA聚合酶 L:矿物油 M:50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用) N:溴化乙锭溶液 O：上样缓冲液 试剂盒规格：10头份∕盒 试剂盒保存期：6个月 器材

试剂盒内配有薄壁PCR管15个。 其它需要自备的物品

1.仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。

2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、经焦碳酸二乙醋(DEPC)水处理的灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。 使用注意事项

1.所有接触病料的物品均应合理处理,以免污染实验室。

整个试验分PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。 4．N液具有致癌性,小心操作。

5.使用前将红盖管（75%乙醇）5000rpm离心15s,使液体全部沉于管底，放于冰盒内，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表层吸取。

6.不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。

数量 350μL 7ml 350μL 12ml 450μL 15μL 250μL 3μL 12μL 300μL 20ml 200μL 50μL 2.试剂贮藏条件:A、B、c、D、F、L、M、N、O液于4℃－8℃保存,其它试剂-20℃保存。

7.在RNA提取过程中,避免RNA酶污染,尽量缩短操作时间。 8.请严格遵守说明书操作，应在3次内用完。 样品制备

1.样品采集:病死或扑杀的猪,取肺、脾、脑等组织；待检活禽,用棉试子取呼吸道分泌物，放于50%甘油生理盐水中；注射器取血（5-10）ml,（2-8）℃保存,送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融病料。) 2.样品处理:每份样品分别处理。

组织样品处理:称取待检病料0.5g置研磨器中剪碎并研磨,加入 的 PBS或生理盐水继续研磨。待匀浆后转至灭菌离心管中。8000rpm离心 2min 取上清100ul 置 灭菌离心管中，300ulA，混匀。

呼吸道分泌物样品处理：将棉试子充分捻动，拧干后弃去。混匀后取100ul，置 灭菌离心管中，加入300ul变性液，混匀

全血样品处理:待血凝后取血清置灭菌离心管中,4℃8000rpm 离心5min 取上清100ul 置 灭菌离心管中，加入300μLA液,混匀。

阳性对照处理:取100μL,置灭菌离心管中,加入300μLA液,;混匀。 阴性对照处理:取F液100μL,置灭菌离心管中,加入300μLA液,混匀。 操作步骤 1.病毒RNA的提取

取己处理的待检样品,每管依次加入B液30μl、C液300μl(用C液之前不要晃动,不要吸到C液上层保护液),颠倒10次,混匀,冰浴15min,4℃10000rpm离心15min.

取300μl上清置于新的经DEPC水处理过(进口离心管己用DEPC水处理过)的15ml灭菌离心管中,加入300μlD液,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。室温融化,台式冷冻高速离心机中4℃15000rpm离心2Omin。

弃上清,沿管壁缓缓滴入lml E液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,真空抽干15min(以无乙醇味为准)。

用9μl F液和1μlG液溶解沉淀。-20℃储存备用。 操作程序

每份总体积25μl。取μl H液(用前混匀)、μLG液、μLI液、1μLK液,2μL样品RNA。混匀并作好标记,加入L液20μl覆盖,在PCR扩增仪上进行以下循环:42℃45min,94℃3min；扩增条件为94℃30s,50℃30s,72℃30s；35个循环后,72℃延伸7min。 3.电泳

称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中,加入50倍稀释的M液200mL(取4MLM液,用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入20μLN液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL O液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。 结果判定

在阳性对照出现362bp扩增带，阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现362bp扩增带为猪瘟病毒阳性,否则为阴性。

猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒

用途

猪瘟病毒(CSFV)反转录聚合酶链反应(RT－PCR),用于检测疑似感染动物的血清或组织中的CSFV,适用于CSFV的检测、诊断和流行病学调查。 原理

利用异硫氨酸胍法提取RNA,在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TapDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。

试剂 1.试剂组成 名称 阳性对照 A：变性液 B：醋酸钠溶液 C：酚/氯仿/异戊醇混合液 D：异丙醇 E：70%乙醇 F：DEPC处理的灭菌去离子水 G：RNA酶抑制剂 H：RT-PCR反应液 I：反转录酶 K：TaqDNA聚合酶 L：矿物油 M：50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用) N：溴化乙锭溶液 O：上样缓冲液 ℃保存。 器材

试剂盒内配有薄壁PCR管15个。 其它需要自备的物品

1.仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。

2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、经焦碳酸二乙醋(DEPC)水处理的灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。 使用注意事项

1.所有接触CSFV病料的物品均应合理处理,以免CSFV污染实验室。

整个试验分PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。 4．N液具有致癌性,小心操作。

5.注意防止试剂盒组分受污染．使用前将红盖管5000rpm离心15s,使液体全部沉于管底。

数量 350μL 7ml 350μL 12ml 450μL 15μL 250μL 3μL 12μL 300μL 20ml 200μL 50μL 2.试剂贮藏条件:A、B、c、D、F、L、M、N、O液于4℃－8℃保存,其它试剂(塑料袋内)-20

6.不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。 7.在RNA提取过程中,避免RNA酶污染,尽量缩短操作时间。

8.严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

9.本试剂盒为10头份CSFV RT－PCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。 样品制备

1.样品采集:病死或扑杀的猪,取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织:待检活猪,用注射器取血5mL,4℃保存,送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融病料。)

2.样品处理:每份样品分别处理。

组织样品处理:称取待检病料0.05g置研磨器中剪碎并研磨,加入600μLA液继续研磨。取己研磨好的待检病料上清300μL和100μLA液,置灭菌离心管中。

全血样品处理:待血凝后取上清100μL,置15mL灭菌离心管中,加入300μL A液,混匀。

阳性对照处理:取100μL,置15mL灭菌离心管中,加入300μLA液,混匀。 阴性对照处理:取F液100μL,置灭菌离心管中,加入300μL A液,混匀。 操作步骤 1.病毒RNA的提取

取己处理的待检样品,每管依次加入B液30μL、C液300μL(用C液之前不要晃动,不要吸到C液上层保护液),颠倒10次,混匀,冰浴15min,4℃10000rpm离心15min.

取300μL上清置于新的经DEPC水处理过(进口离心管己用DEPC水处理过)的灭菌离心管中,加入300μL D液,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。室温融化,台式冷冻高速离心机中4℃15000rpm离心2Omin。

弃上清,沿管壁缓缓滴入lmL E液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,真空抽干15min(以无乙醇味为准)。

用9μL F液和1μL G液溶解沉淀。-20℃储存备用。 操作程序

每份总体积25μL。取μL H液(用前混匀)、μL G液、μL I液、1μL K液,2μL样品RNA。混匀并作好标记,加入L液20μL覆盖,在PCR扩增仪上进行以下循环:42℃45min,94℃3min；扩增条件为94℃30s,50℃30s,72℃30s；35个循环后,72℃延伸7min。 3.电泳

称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中,加入50倍稀释的M液200mL(取4mL M液,用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入20μL N液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL O液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。 结果判定

在阳性对照出现272bp扩增带，阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现272bp扩增带为猪瘟病毒阳性,否则为阴性。

凝集、血凝实验操作方法

弓形虫间接血凝试验(lHA)试剂使用说明书

本制剂是弓形虫间接血凝试验(IHA试验〉的冻干抗原,为暗褐疏松块状,用于检测人和动物血清或滤纸干血滴中的弓形虫抗体,阳性血清效价不低于1:1024。 一、用量

定性检查时,每ml抗原可检测10份样品。定量检查时,每ml抗原可检测5份样品。 二、保存

4℃保存期为18个月,夏季经邮局或民航寄送,1个月内不影响效价。

三、弓形虫lHA抗原检测方法操作细则

按照中华人民共和国农业行业标准NY/T573-2002的规定,在96(12x8)孔110V形有机玻璃板上进行检测,弓形虫IHA诊断制剂按瓶上标示毫升数加入灭菌蒸馏水稀释摇匀,1500r/min一2000r/min离心5-1Omin,弃上清液,加等量稀释液摇匀,置4℃下静置24h后使用。10d内效价不变。

1、待检血清的采取:来被检疫动物或人的血液2一2.5m1,分离血清(应无血球)。 2、加稀释液:用微量加样器在96孔有机玻璃反应板的每孔中加稀释液。如果没有加样器,可把磨钝的12号针头接在盐水接头上,上端装一橡皮乳头组成加样管,将加样管竖立加3滴,每1滴约。

定性检测时,每个样品需加稀释液4孔:定量检测时,每个样品需加稀释液8孔。每块板上不论检测几个样品,均应设阳性血清、阴性血清、空白对照。 3、加待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清:第1孔加相应血清。

4、稀释:定性检测时稀释至第3孔,定量检测时稀释至第7孔,对照血清均稀释至第7孔。定性检测的第4孔、定量检测和对照的第8孔为稀释液对照。

5、加诊断液:将诊断液摇匀,每孔加诊断液,加完后将反应板置微型振荡器上振荡1-2min,取下反应板,盖上一块与反应板大小相近的玻璃置22-37℃作用2-3h后观察结果。

6、判定:在阳性对照血清效价不低于1:1024,阴性对照血清除第1孔允许有前滞现象“＋”外,其余各孔均为\"－\稀释液对照为“－”的前提下,对待检血清进行判定,否则应重作。待检血清效价达到或超过1:64为阳性。“++”为阳性终点。

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伪狂犬病乳胶凝集试验试剂盒

主要成分及含量：

乳胶抗原2ml×1瓶、阳性血清2ml×1瓶、阴性血清2ml×1瓶、稀释液4ml×4瓶 性状：

乳胶抗原为乳白色均匀混悬浮液，阳性血清和阴性血清为橙黄色或淡棕黄色液体，稀释液为透明无色液体。 作用与用途：

乳胶抗原：用于检测伪狂犬病病毒抗体的乳胶凝集试验。

阳性血清：用于伪狂犬病乳胶凝集试验抗原效价测定和乳胶凝集实验对照。 阴性血清：用于伪狂犬病乳胶凝集试验对照。 稀释液：用于待检血清稀释。 用法与判定：

阳性对照：将阳性血清进行2倍系列稀释，取20ul与等量乳胶抗原进行乳胶凝集试验，乳胶抗原与1：64稀释的阳性血清出现“＋＋”凝集反应。

阴性对照：阴性血清加抗原，应不发生凝集反应。 稀释液对照：抗原加稀释液混合后，应不发生凝集反应。

定性试验：取被检样品（血清或全血）、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴分别置于玻片上，各加等量乳胶抗原1滴，混匀，搅拌并摇动1-2分钟，在3-5分钟内观察，判定结果。

定量试验：先将被检样品在微量反应板或EP管内用稀释液作2倍系列稀释，各取1滴依次滴加于玻片上，同时设阴性血清和阳性血清对照，随后各加乳胶抗原1滴，如上搅拌并摇动，判定。达到阳性凝集反应的血清最高稀释倍数，即为血清的抗体效价。 凝集反应强度标准：

“＋＋＋＋”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明。 “＋＋＋” 大部乳胶凝集，颗粒明显，液体稍浑浊。 “＋＋” 约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较浑浊。 “＋” 有少许凝集，液体呈浑浊。 “－” 液滴呈现原有的均匀乳状。 出现“＋＋”以上凝集为阳性。 储藏及有效期：

在2-8℃，有效期为1年。

猪细小病毒病乳胶凝集试验〈LAT〉诊断试剂盒使用说明书

猪细小病毒病是由细小病毒引起的一种以猪的繁殖障碍性疾病。感染后,妊娠母猪表现为流产、死胎、木乃伊、弱仔等,尤其以产木乃伊较为突出。通常母猪本身无明显症状,本病多发生在头胎母猪,在我国各地均有流行,给养猪业造成重大经济损失。 猪细小病毒乳胶凝集试验是用猪细小病毒培养液致敏乳胶抗原来检测猪血清中的抗体的试验。其具有简便、快速、特异、敏感之优点。

1.试剂盒的内容：本品包括致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清和稀释液、玻片、吸头及使用说明书。

2.制品用途：用于猪病免疫学诊断 3.使用方法

定性试验：取检测样品(血清〉、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴,分置于玻璃片上,各加乳胶抗原一滴,用牙签混匀,搅拌并摇动1-2分钟,于3一5分钟内观察结果。 定量试验：先将血清作连续稀释,各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上,另设对照同上,随后再各加乳胶抗原一滴,如上搅拌并摇动,判定。 4.结果判定

对照试验：出现如下结果试验方可成立,否则应重试:阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“-”；抗原加稀释液呈“-” 判定标准：

“++++”全部乳胶凝集,颗粒聚于液滴边缘,液体完全透明；“ +++”大部分乳胶凝集,颗粒明显,液体稍混浊:“++ \"约50%乳胶凝集,但颗粒较细,液体较混浊；\"+”有少许凝集,液体呈混浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状。以出现“++”以上凝集者判为阳性凝集,。

5.贮藏:在2一8℃冷暗处保存,有效期1年。 6.附注：被测样品采集及处理方法。

血清：按常规方法采血及分离血清,要求无腐败。 使用前应轻轻摇匀

猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验〈LAT〉操作程序

猪传染性萎缩性鼻炎(AR)主要是由支气管败血波氏杆菌I相菌引起的猪的一种慢性呼吸道传染病，此病引起急性、慢性鼻炎，幼仔猪感染后可引起鼻甲骨甚至鼻腔周围骨的变形、萎缩或消失，临床上主要表现喷嚏、鼻塞、鼻出血，颜面或鼻部变形等症状。另外，由于病原菌破坏上呼吸道的正常构造和屏障生理功能，毒素被吸收后还可以抑制淋巴免疫系统，降低抵抗力，从而容易诱发和恶化其它呼吸道传染病，特别是猪流行性肺炎(猪喘气病)、巴氏杆菌病和嗜血杆菌病等，造成猪呼吸道综合症，增加猪的淘汰率和死亡率。使猪增重缓慢，降低饲料报酬，造成较大经济损失。

猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验是用支气管败血波氏杆菌，致敏乳胶抗原来检测动物血清中的抗体。具有简便、快速、特异、敏感之优点。

1.试剂盒的内容：本品包括致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清和稀释液、玻片、吸头及使用说明书。

2. 制品用途：用于猪病免疫学诊断 3. 使用方法

定性试验：取检测样品(血清)、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴，分置于玻璃片上，各加乳胶抗原1滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5分钟内观察结果。

定量试验：先将血清作连续稀释，各取l滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原1滴，如上搅拌并摇动，判定。

4. 结果判定

对照试验：出现如下结果试验方可成立，否则应重试；阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“－”；抗原加稀释液呈“-”。

判定标准：

“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“++”约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“+”有少许凝集，液体呈混浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状；以出现“++”以上凝集者判为阳性凝集。

5. 贮藏:在2～8℃冷暗处保存，有效期1年。 6. 附注：被测样品采集及处理方法。

血清：按常规方法采血及分离血清，要求无腐败。 使用前应轻轻摇匀。

猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书及实验操作程序

一、原理

用己知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，亦称间接血凝。抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下形成抗原——抗体复合物。但这种复合物的分子团很小人肉眼看不见。将抗原吸附(致敏)在红细胞表面，制成猪瘟血凝抗原，用于检测免疫动物血清中的猪瘟抗体水平。

这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰的凝集现象。

二、适用范围

主要用于检测猪瘟免疫抗体效价，以便制定正确的免疫程序，保障猪群免遭猪瘟强毒的感染。

三、试验器材，

1、96孔110V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板。 2、1微量移液器(50微升、25微升)取液塑料咀。 3、微量振荡器。 4、猪瘟血凝抗原 5、猪瘟阴性对照、血清。 6、猪瘟阳性对照血清。 7、稀释液。

8、待检血清（每头约血清即可）。 四、试验方法 1、加稀释液

在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔第6孔；第8排的1～12孔各加稀释液50微升。

2、稀释待检血清

取1号待检血清50微升加入第1排第l孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指指轻压弹簧1～2次混匀(避免产生过多的气泡)，从该孔取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排1～4孔待检血清的稀释度(稀释倍数)依次为:1:2（1）、1:4(2)、1:8(3)、1:16(4)、1:32(5)、1:646)、1:128(7)、1:256(8)、1:512(9)。

取2号待检血清加入第2排:取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意!每取1份血清时，必须更换塑咀一个。 3、稀释阴性对照血清

在血疑板上的第7排第1孔加阴性血清50微升，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6孔为稀释液对照。

4、稀释阳性对照、血清

在血凝板上的第8排第1孔加阳性血清50微升，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取

。

出50微升丢弃。此时阳性血清稀释倍数依次为1:2～1:4096。 5、加血凝抗原

被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血请各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原(充分摇匀，瓶底应无血球沉淀)25微升。 6、振荡混匀

将血凝板置于微量振荡器上振荡1～2分钟，如无振荡器；用手轻轻摇匀亦可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37℃下静置～2小时判定结果，也可延至翌日判定。 7、判定标准

移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集(血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)，或仅出现凝集(血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮)。

阳性血清对照、1:2～1:256各孔应出现“++～++++”凝集为合格，(少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内)。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++～++++”凝集，6～7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的猪瘟抗体效价为1:128。 接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:16(即第4孔)呈现“++”凝集为免疫合格。 五、检测试剂性能要求 1、性状

(l)液体血凝抗原：摇匀呈棕红色(或咖啡色)，静置后，血球逐渐沉入瓶底。 (2)阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。 (3)阳性对照血清：微红或淡黄色稍混浊带粘性的液体。

(4)稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。 2、包装

(１)液体血凝抗原：摇匀后即可使用，5ml/瓶，每瓶检测3040头份血清。 (2)阴性血清：2ml/瓶，直接稀释使用。 (3)稀释液：100ml/瓶，直接使用4℃保存。 3、保存条件及保存期

(l)液体血凝抗原：4℃保存(切勿冻结)，保存期4个月。

(2)阴性对照血清：-15～-20℃保存，有效期2年，4℃保存有效期半年。 (3)阳性对照血清:-15～-20℃保存，有效期2年，4℃保存有效期半年。 六、注意事项

1、为使您的检测获得正确结果，请您在检测前仔细阅读本说明书。 2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 3、勿用90和130血凝板，以免误判结果。

4、本法可单独检测猪瘟抗体水平，也可同步检测口蹄疫免疫抗体水平。

5、用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37℃恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。

6、每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。、 “-”表示完全不凝集或0～10%血球凝集；

“+”表示10-25%血球凝集； “+++”表示75%血球凝集； \"++\"表示50%血球凝集； “++++”表示90～100%血球凝集。

。

。

口蹄疫正向间接血凝试验

1.试剂

兰州兽医研究所：纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化鞣酸化绵阳红细胞、标准阳性血清、阴性血清、稀释液。

2.试验材料

96孔V型微量反应板（110度底角），微量移液器，枪头，加样槽 3.操作方法

在微量反应板的1-7孔均加入稀释液，换枪头；

吸取待检血清、阴性血清和阳性血清，加入第1孔，充分混匀后吸取于第2孔，依次倍比稀释至第7孔，从第7孔吸取弃去；

在各孔中加入的口蹄疫诊断液，诊断液用前充分摇匀；

加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡1分钟，取下放在白纸上，观察血球均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡；

静置：混匀后，在血凝板上盖上玻璃板或别的东西，防止水分蒸发，室温下静置～2个小时，或次日判定结果。

4.结果判定

先观察对照孔：阴性血清和稀释液对照孔应无凝集现象，呈小圆点状，阳性血清对照孔应有50%以上的血球产生凝集，即++；

观察第1～7孔，以红血球呈“++”凝集的待检血清的最大稀释度为其抗体效价。 口蹄疫效价以1：32为免疫合格。 5.相关记录

《正向血凝试验原始记录表》 《血清学试验结果登记表》

高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验程序

1 试验准备工作 %RBC制备

1.1.1 用吸有少量抗凝剂的针管采集3只鸡静脉血各2ml混合；

1.1.2 加生理盐水，置离心机以1000r/min离心10min，弃上清液，加本试验要求的PBS液，用大拇指垫纸缓慢颠倒3～4次，以混匀沉淀的RBC，以同样的方法离心洗涤3次弃上清夜，

留沉淀的RBC泥备用；

1.1.3 用微量吸管吸取泥，加入到10ml本试验要求的PBS液，制成1%的RBC液； 工作抗原制备做HA试验，对倍稀释浓缩抗原2、4、8……1024共12孔，用制备好的%RBC液测定浓缩抗原的凝集价，测得的凝集价除以4所得的值，即为工作抗原的稀释倍数，按此比例配制工作抗原；

2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术 材料准备

96孔V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。 2.1.2 阿氏(Alsevers)液、 2.1.3 p L PBS。

2.1.4 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。 操作方法

2.2.1 血凝(HA)试验(微量法)

2.2.1.1 在微量反应板的1孔~12孔均加入，换滴头。

2.2.1.2 吸取病毒悬液(如感染性鸡胚尿囊液)加入第1孔，混匀。

2.2.1.3 从第1孔吸取病毒液加入第2孔，混匀后吸取加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取弃之，换滴头。

2.2.1.4 每孔再加入。

2.2.1.5 每孔均加入体积分数为1%鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)见附录B。

2.2.1.6 振荡混匀，在室温(20℃~25℃)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4℃环境下)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

2.2.1.7 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU〉。

2.2.2 血凝抑制(HI)试验(微量法)

2.2.2.1 根据试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64(256除以4)。

2.2.2.2 在微量反应板的1孔~11孔加入，第12孔加入 。

2.2.2.3 吸取血清加到微量板第1孔内，充分混匀后吸取于第2孔，依次对倍稀释至第10

孔，从第10孔吸取弃去。

2.2.4.1 1孔~10孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液，室温(约20℃)下静置至少30min。 2.2.2.5 每孔加入体积分数为1%的鸡红细胞悬液，轻轻混匀，静置40min(室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行)，对照红细胞将呈现纽扣状沉于孔底。

结果判定

以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3log2判定HI试验为阴性；HI价等于4log2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于5log2为阳性。

琼脂扩散试验

鸡马立克氏病

1.试验准备：

（1）标准抗原：标准抗原用马立克氏病京-1株强毒感染的鸭胚成纤维细胞培养物制备〈哈尔滨兽医研究所生产〉，也可用病鸡的羽囊制备，其方法是将病鸡皮肤有红肿感染处的羽毛从贴近皮肤处剪掉，剪下带有羽囊的皮肤称重，加入二倍量的磷酸盐缓冲液研磨。在-20℃冻结后，再经37℃融化，如此反复冻融4次，经2500转/分离心沉淀后，置低温冰箱中保存

备用。

（2）标准阳性血清：由哈尔滨兽医研究所生产。也可用已知的标准马立克氏病抗原与病鸡群中的慢性病鸡或康复鸡，采取的血清作琼脂扩散试验，如出现清晰的沉淀线，则为马立克氏病阳性血清。采血分离的血清加%硫柳汞防腐，冻结备用。

（3）器械、药品：塑料采血管、打孔器、滴管、平皿、烧杯、镊子、酒精灯、带盖瓷盘、试管、琼脂、含8%氯化钠的～磷酸盐缓冲液。

（4）琼脂板的制备：用含有8%氯化钠的磷酸盐缓冲液配制的1%琼脂溶液，置水浴中加温，使其充分溶化后，经脱脂棉滤过，稍凉后，加入到灭菌培养皿内。每个直径9厘米平板，大约加15毫升。平放在室温下凝固，而后倒置放入冰箱中保存3～5天备用。

2.操作方法：用打孔器在琼脂平板上打7个孔，其中中央1个孔，孔径为4毫米，外周6个孔，孔径均为3毫米，孔距为3毫米。

用已知标准抗原测定未知抗体（被检鸡血清）：

用滴管将被检血清按顺序逐个地滴加于周边1、3、5孔内，每孔加满不溢出为度。每加一份血清前，必须把滴管洗净、拭干。用另一滴管向中心孔内滴加标准抗原，每孔加满不溢出为度。再用另一支滴管向空下的周边孔，即2、4、6孔内加入标准阳性血清。

将加完样的琼脂平板加盖后，在室温静置片刻，待被检样品稍微扩散而液面下陷后，平放于带盖的湿盒内，置37℃温箱中，于24小时内观察并记录结果。

用已知的标准阳性血清，测定未知的病毒抗原〈被检鸡的羽髓浸液〉：

选择被检鸡含羽髓丰满的翅羽或身体其它部位的大羽数根，将含有羽髓的羽根部分按排号分别剪下，收集于试管内。再于每管内滴入2～3滴蒸馏水〈羽髓丰满时也可不加〉。用玻棒将羽根挤压于管底，并用适当的压力转动玻棒，倾斜试管，并用玻棒导流，使羽髓浸液流至管口，另一人用滴管将其吸出，滴加到周边1、3、5孔内。

洗涤玻棒并擦干，用同样操作方法浸提另一样品。用另一支滴管向中心孔滴加标准阳性血清，再用一支滴管向2、4、6的周边孔滴加标准抗原。以上均以加满不溢出为宜。加样完毕后，将琼脂平板加盖后，在室温静置片刻，待被检样品稍微扩散而液面下陷后，平放于带盖的湿盒内，置37℃温箱中，于24小时内观察结果。

3.结果判定：被检材料孔与标准抗原孔之间形成清晰的沉淀线。并与周边已知抗原和阳性血清孔的沉淀线相互融合者，判为阳性。不出现沉淀线的则判为阴性。

标准阳性血清孔和抗原孔产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧时，被检样品判为弱阳性。

有的被检材料可能产生一条以上沉淀线，其中一线与已知抗原，阳性血清的沉淀线融合者，则属于阳性反应。

（4）结果分析

①第一孔与第二孔沉淀线完全吻合，故第二孔为强阳性反应。

②第三孔与第四孔沉淀线出现交叉，说明第四孔的被检血清与第三孔不一样，可能是另一型抗体。

③第五孔与第四孔毗邻的沉淀线向外侧弯曲，说明第四孔为阴性反应。 ④第五孔与第六孔毗邻的沉淀线向内侧偏弯，说明第六孔为弱阳性反应。 4.注意事项：

（1）加样完毕后，应将血清、羽髓等待检材料， 应将被检样品放入冰箱中，待结果判断无误后，再行废弃。

（2）在琼脂孔打完后，注意将琼脂板底面放在酒精灯上稍微加热封底。

（3）标准抗原和阳性血清用后如有剩余，则应冻结保存。阴性血清应避免多次重复冻融，以防抗体效价降低而影响反应结果。

（4）被检鸡的编号和采样试管号，必须相互一致，以免造成人为的错误。

禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验

材料准备

4.1.1 硫柳汞溶液：、L PBS溶液，配制方法见附录C。 4.1.2 琼脂板：制备方法见附录D。

4.1.3 禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清。 操作方法

4.2.1 打孔：在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径

约5mm，孔距2mm～5mm，将孔中的琼脂用8号针头斜面向下从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。

4.2.2 封底：用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要溶化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。 4.2.3 加样：用微量移液器，吸取抗原悬液滴如中间孔图1的⑦号)，标准阳性血清分别加入外周的①和④空中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔（图1的②，③，⑤，⑥号孔）。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。

4.2.4 作用：加样完毕后，静止5min~10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。

结果判定 4.3.1 判定方法

将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清(图1的①和④号孔)与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。

4.3.2 判定标准

4.3.2.1 若被检血清(如图1中的②号)孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。

4.3.2.2 被检血清(如图1中的③号)与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清(如图1中④)的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性(凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性)。

4.3.2.3 若被检血清(如图1中的⑤号孔)孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。

4.3.2.4 被检血清孔(图1中的⑤号孔)与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。

荧光抗体检测

猪瘟荧光抗体试验操作程序

1．制片 切片

1.1.1 打开切片机电源开关，待切片室和刀片温度冷却至-20℃；

1.1.2 横向剪1×1×0.5cm大小的组织块粘贴于切片机贴板上，等待冻凝； 1.1.3 切去不平整的表面，快速切一小块厚度～0.7mm的薄组织片，贴于干净的载玻片上，并让其自然干燥；

压印片:选择脏器（肾脏、扁桃体或脾脏）的新鲜切面，粘去表面多余的液体，均匀的压印在干净的载玻片上，并让其自然干燥；

2．染色

将切片或压印片浸没于丙酮，置4℃冰箱中固定15min； 取出后浸入PBS冲洗3次，每次浸泡3min； 取出后自然干燥，滴加猪瘟荧光抗体； 置37℃温箱湿盒染色30min； 取出后用PBS同法洗3次； 3．镜检

凉干后置荧光显微镜10×40镜下，加甘油PBS∶PBS=9∶1的混合物封镜； 先打开光源灯找到切片组织所在位置，然后关灯镜检。 注：

1．快速镜检，以防荧光减弱，造成误判；

2．每次开镜时间不少于10分钟，不超过1小时。尽量将镜检片集中起来，集中镜检，以减少开镜次数。

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对狂犬病疑似动物脑组织的直接免疫荧光(dFA)检测

1 待测样品

DFA主要应用于对动物脑组织涂片、压片或冰冻切片内狂犬病病毒的检测,也可用于易感细胞上狂犬病病毒感染的检测。 2 主要试剂与器材

抗狂犬病病毒核蛋白荧光抗体、丙酮、伊文思蓝、磷酸盐缓冲液,PBS)、碳酸盐缓冲液、甘油；剖检器械、硬质塑料吸管(内径3-10mm,选用)、荧光显微镜、玻片、木质压舌板、染片缸、洗片托盘、水浴温箱等。

3 动物脑组织样品dFA 检测的操作流程

(1)脑组织样品的采取:以剖检器械开颅取脑,分别采取脑干、小脑及海马回三处的少量脑组织,或以硬质塑料吸管于暴露的枕骨大孔向眼窝方向刺入,抽回时采取吸管内容物,亦应含有上述三部分脑组织。

(2)脑组织压片的制备:以镊子夹取约米粒大小上述部位的脑细织,置于木质压舌板一端,用玻片盖压其上并以拇食二指用力紧压,使脑组织形成薄层；如有块状脑组织残留,可以镊子去

除。制备好的脑组织压片,以铅笔在玻片磨砂面编号标记,室温干燥20-30min。

(3)固定与洗涤:干燥好的组织压片,放染片缸中,以预冷至一20℃的80%丙酮水溶液固定30min,以PBS浸洗3次,每次3min,室温下自然干燥。

(4)染色与洗涤:先按荧光抗体的工作浓度,以PBS配制含%伊文思蓝的荧光抗体工作液；将固定、洗涤并干燥后的组织片水平摆放在托盘中,在组织层上滴加荧光抗体工作液至完全覆盖,置37℃水浴温箱内温育60-9Omin,弃染色液,以PBS洗涤3次,每次3min,自然干燥。

(5)封片镜检:于染色干燥后的玻片上滴加以碳酸盐缓冲液配制的80%甘油溶液1滴,以盖玻片覆盖后,荧光显微镜下观察并记录。 4 质量控制

每批次检测皆应设置相同动物种属脑组织的阳性和阴性对照,以评估该批次检测的敏感性和特异性。 5 结果的判定

荧光强度的判定 明亮的染色,可以降低主观判断的难度,从而提高检测的敏感度。一般按荧光的明亮程度,将荧光强度分为4级:4级为明亮的黄绿色荧光,与视野的暗背景反差极大:3级为略暗但仍较显著的黄绿色荧光:2级更为暗淡,较大荧光灶尚清晰,但沙粒样的细小荧光灶须仔细分辨方可确认:l级仅可见少数与暗背景反差不大的较大荧光灶。2级及2级以下的荧光染色强度不能进行样品的阴性结果判定。

样品荧光数量的判定与分级 主要用于对待测样品感染强度的划分,根据荧光灶数目的多少分为5个级别:

++++ 几乎每个视野均可见大量的形状、大小不等的特异性荧光灶；

+++ 绝大多数视野内可见形状、大小不等的特异性荧光灶,数目不均,荧光灶数目较多； ++ 10～50%的视野内可见形状、大小不等的特异性荧光灶,且荧光灶数量较少； + 检测有效:阴性对照样品判定为+或-.,同时阳性对照样品的判定结果为++++或+++；

检测无效:阴性对照样品判定达到++或以上水平,或阳性对照样品的判定为++或以下水平； 以下情形之一,判定为未感染:①三个部位的检测皆判定为-；②有至少一个部位判定为-,阳性判定为+水平,且阴性对照判定也为+水平。

以下情形之一,判定为感染:①至少-个部位的检测判定达到++或以上水平:②至少一个部位的判定为+,但阴性对照判定结果为-。

血清学诊断检测常用试剂配方

禽流感HA和HI试验用溶液的配制

1、鸡红细胞保存液(阿氏〈AIsevers〉液)配制 葡萄糖 柠檬酸钠 柠橡酸 氯化钠

加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。 2、1%鸡红细胞悬液制备

采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用、LPBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

3、、L PBS的配制

a) 配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）和0.79g磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）加蒸馏水至100mL。

b) 配制1×PBS：量取40ml25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL。 c) 用氢氧化钠或盐酸调pH至。 d) 灭菌或过滤。

e) PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。 禽流感AGID试验用溶液的配制

4、1%硫柳汞溶液的配制

硫柳汞 加蒸馏水至 100rnL 溶解后，置100mL瓶中盖塞存放备用。 5、、L PBS的配制 的配制

（1）甲液：Na2HPO4 12H2O 3.58克，加蒸馏水至1000ml； （2）乙液：KaH2PO4 1.36克，加蒸馏水至1000ml；

（3）待甲乙二液充分溶解后，分别保存，用时取甲液24ml、乙液76ml混合即可。 （4）用氢氧化钠或盐酸调pH至。 （5）灭菌或过滤。

（6）PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。 6、琼脂板的制备

（1）实际操作：称量琼脂糖0.8g，加人100ml的 L PBS液中在水浴中煮沸充分融化，加入8g氯化钠。冷至45℃~50℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18mL~20mL，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水份蒸发，放普通冰箱中保存备用(时间不超过2周)。

（2）国标：称量琼脂糖1.0g，加人100ml的 L PBS液中在水浴中煮沸充分融化，加入8g氯化钠，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml。冷至45℃~50℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18mL~20mL，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水份蒸发，放普通冰箱中保存备用(时间不超过2周)。

7、其它病制备琼脂板所用PBS浓度为L，PH值介于~之间即可。可参考禽流感HA及HI试验用PBS的配制。无磷酸二氢钠时，可用磷酸二氢钾代替。

禽流感病毒保存液配制

8、的等渗磷酸盐缓冲液L，，PBS) NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4·12H2O 2.9g KCl 0.2g

将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1000ml，调pH至，高压消毒灭菌112KPa2Omin，冷却后，保存于4℃冰箱中备用。

9、棉拭子用抗生素PBS（病毒保存液）的配制

取上述PBS液，按要求加入下列抗生素:喉气管拭子用PBS液中加入青霉素(2000IU/ml)、链霉素（2mg/ml）、丁胺卡那霉素(1000IU/ml)、制霉菌素(1000IU/ml)。粪便和泄殖腔拭子所用的PBS中抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后应调pH至。在采样前分装小塑料离心管，每管中加这种PBS ～。采粪便时，在西林瓶中加PBS1ml～，采样前冷冻保存。 口蹄疫病毒保存液配制

10、LPBS的配制

氯化钠(NaCl) 氯化钾(KCl) 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 磷酸二氢钾(KH2PO4) 蒸馏水(dH20) 11、L PBS～

L PBS 400ml 蒸馏水(dH2O) 600ml 103kpa高压蒸汽灭菌30min。室温或4℃冰箱保存。 12、50%甘油-PBS

L PBS与纯甘油.)等量混和，调正pH至。分装成小瓶。103KPa高压蒸汽灭菌30min。室温或4℃冰箱保存。

猪瘟（CSF）荧光抗体试验洗涤用PBS的配制

13、0.015M PBS的配制

A液：0.2M磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液：0.2M磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O） 31.32克，加蒸馏水至1000ml；

分别保存，取A液72毫升，B液28毫升混合后，加蒸馏水1400毫升，再加氯化钠（NaCl）10克，溶解，即为 磷酸盐缓冲液。

补充实验

猪流感病毒H1亚型Hl试验抗原与阴、阳性血清说明书

【兽药名称】猪流感病毒Hl型HI试验抗原与阴、阳性血清

【主要成分与含量】抗原中含灭活的HI型猪流感病毒。其血凝(HA)效价≥l28；阳性血清中含抗Hl亚型猪流感病毒的抗体,其血凝抑制(HI)效价≥l:l28,阴性血清中不含任何亚型猪流感病毒的抗休。

【性状】抗原为白色或淡黄色疏松团块,阳性血清和阴性血清为淡黄色或淡红色疏松团块,易与瓶壁分离,加稀释液后迅速溶解。

【作用与用途】用于猪流感病毒血凝抑制(Hl)实验，检测猪流感病毒HI亚型抗体。 【用法与判定】

1猪流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 材料与试剂

96孔V型（90度)微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。

pH值 L PBS：NaCl 8g，KCl 0.2g,Na2HP04 l.42g,KH2P04 0.27g,加蒸馏水至lOOOmL；调pH值约为；l2l℃高压灭菌l5分钟或过滤除菌。

1.1.3 胰酶溶液；200mg的胰酶（P-250）溶于25ml PBS中，过滤除菌，分装保存于-20℃或-70℃，每六个月重新配制胰酶。

L KIO4溶液：230mg KIO4溶于PBS中，至终体积100mL，过滤除菌。KIO4需新鲜配制，在1周内使用。

1%丙三醇盐水:lmL丙三醇加入99ml PBS中,过滤除菌。

1.1.6 阿氏(Alsevers)液称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g,加蒸馏水至l00ml,加热溶解后调pH约为,l21℃高比灭菌l5分钟,2～8℃保存备用。

1%鸡红细胞悬液 采集2～3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等休积阿氏液混合,用PBS液洗涤3次,以3000转/分钟离心5分钟，洗涤后用PBS配成l%(V/V)红细胞悬液,2～8℃保存备用。

抗原和血清溶解冻干的抗原和血清用lml灭菌生理盐水溶解。 操作术式 血凝(HA)试验

在微量反应板的l～l2孔均加入0.025m1 PBS,换吸头。 吸取抗原,加入第l孔,反复抽打3～5次混匀。

从第l孔吸取病毒抗原加入第2孔,混匀后吸取0.025m1加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔,从第11孔吸取弃之,换吸头。 每孔再加入。

每孔均加入 1%（V/V）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。

振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置20min后观察结果（如果环境温度过高，可置4℃环境下）。对照孔红细胞显著呈纽扣状时判定结果。

结果判定 将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的病毒最高

稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。 1.2.2 血凝抑制试验（HI）

1.2.1 血清样品的处理 待检血清样品须经“胰酶-加热-高碘酸盐方法”处理，以去除血清之中非特异性凝集抑制因子。其步骤为：先加胰酶于血清中，在56℃灭活30min后冷却至室温；加高碘酸钾混合，室温孵育15min，加丙三醇盐溶液混合，室温附育15min；加生理盐水并混匀，置4℃保存备用。

根据HA试验结果配制4HAU的抗原。HA效价除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。例如,HA效价256,则4HAU抗原的稀释倍数同是64(256除以4)。 在微量反应板的2～ll孔加入 PBS,第12孔加入 PBS。

吸取血清加入第1孔内,从中吸取加到第2孔,充分混匀后吸于第3孔,依次对倍稀释至第11孔,从第11孔吸取弃去。

l.2.5 l～ll孔均加入含4HAU混匀的抗原液,室温（20～25℃）下静置至少20min。 1.2.6 每孔加入%(V/V)的鸡红细胞悬液,轻轻混匀,室温（如果环境温度过高，可置4℃环境下）静置约20min，对照孔红细胞显著呈纽扣状时判定结果。

结果判定 以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。因为待检猪血情经过高碘酸盐处理后已作10倍稀释,如果血凝抑制有一个孔发生抑制,此时血清的放价即为1:l0,判为阳性。 注意事项

（1）HA和HI试验影响因素甚多,应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头,严格控制作用温度和时间。

（2）准确配制4HAU抗原,使用前需进行滴定, 滴定好的抗原也在2小时内用完。 （3）冻干试剂应低温保存,使用时用规定体积的稀释液溶解,溶解后2～8℃保存不超过l个月。或可分装成小包装,冷冻保存,随用随取。切忌反复冻融。

（5）准确配制红细胞悬液,使用时应随时振摇。

（6）猪的血清必须进行非特异性凝集抑制因子的去除处理。

猪流感病毒RT-PCR检测

（

一、RNA提取试剂及操作步骤

室温保存组分：吸附柱(50)；裂解液(25ml)；洗涤液(12ml)；Water(6ml)。 自备无水乙醇，异丙醇。

第一次使用前，在洗涤液中加入48ml无水乙醇。(非常重要)

操作步骤：(如果没有特别指示，离心条件为：室温，速度12000转/分钟。)

1.样品处理 以待检病料置研磨器中，按W/V(1∶1)加入PBS研磨：将棉拭子置1ml样品采集液管中，充分挤压后弃去拭子。4℃8000转/分钟离心5分钟，取上清用于RNA提取。 2.在离心管中加入250µl处理好的样品，如果不到该体积，用DEPC水调整，再加入500µl裂解液，盖上盖子，高速振荡2分钟后，置于室温静置5分钟。(样品量一定不要超过许可的范围，

否则样品不可能被完全裂解，从而导致RNA的降解及RNA提取量的下降。)

3.加入750μl异丙醇，颠倒离心管以混匀。(混匀后，4℃静置10分钟，再移入吸附柱，可以提高RNA提取量。)

4.移取750μl裂解物至吸附柱中，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中。同样操作至所有裂解物全部过柱。空柱再离心30秒。(倒空收集管中的液体后，空柱离心不可省略。)

5.加入500μl洗涤液，静置1分钟后，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中。

6.加入500μl洗涤液，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中。 7.空离1分钟，此步骤绝不可省略。

8.将吸附柱移λ一个干净的离心管中。在吸附膜中央加入30μ1纯水，室温静置1分钟后，离心1分钟。将离心管(RNA)贮存于-70℃，用过第一次的洗脱液再洗脱一次，可以提高RNA提取量，(如果室温低于20℃，静置5分钟，或者37℃水浴1分钟，以确保RNA提取量;不得使用低于20μl进行洗脱。)

二、RT-PCR反应体系及操作步骤

-20℃保存组分：缓冲液(250μl)，镁离子(200μl)，DNA聚合酶(25μ1)，反转录酶(25μ1)， dNTP(25μl)，DEPC水(lml〉，M684U引物(50μ1)，M684L引物(50μ1)，阳性质粒(125μl)。 操作步骤：(整个过程在冰上操作)

1.在冰上孵育RNA，引物，dNTP，缓冲液，DEPC水。 2.反应体系：

缓冲液 5μl dNTP μl M684U引物 μl M684L引物 μl 反转录酶 μl DNA聚合酶 μl 镁离子 μl RNA μl DEPC水 μl 总体积 25μ1

3.按以下程序进行反应：第一步48℃，45分钟：第二步94℃，2分钟；第三步94℃，30秒；第四步50℃，1分钟；第五步68℃，2分钟；第六步68℃，7分钟；第七步4℃保存，从第三步到第五步共40个循环。

4.取5μl PCR产物与1μl加样缓冲液混合，12%琼脂糖凝胶电泳，分析RT-PCR产物。以DNA分子量Marker为参考。 5.结果判定

使用引物M684U/M684L检测，出现大小为684bp扩增片段，判定为猪流感病毒核酸阳性，否则判定为阴性。电泳照片图例见下图。 一 一 一· 、

注意事项

a）确保每使用完一种试剂后，立即盖紧该试剂瓶的瓶(管)盖。 b）请严格按照操作步骤中要求的用量使用试剂。

c）RNA提取试剂如果出现盐析(沉淀)，37℃混浴溶解并YH匀后方可使用。 d）阳性质粒应使用引物h4684U/M684L进行反应，扩增片断为684bp。

猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp2 1594~1680

变异株）RT-PCR检测实验

用途

采用RT-PCR方法检测猪肺，脑等脏器组织和血清中的繁殖与呼吸总合征病毒(PRRSV)（Nsp21594-1680变异株）的RNA。适用于PRRSV（Nsp21594-1680变异株）的诊断、检测和流行病学调查。 原理

利用离心柱内硅基质提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TapDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可以见到DNA片段的扩赠带。 试剂

1.试剂组成 名称 列解液 洗液 洗脱液 吸附柱和收集管 灭菌去离子水 矿物油 50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用) 数量 6ml 12ml 1ml 10套 450μL 300μL 20 ml 染色液 上样缓冲液 阳性对照 反转录反应液 PCR反应液 RNA酶抑制剂 反转录酶 Taq DNA聚合酶 （ul） 20μL 50μL 350μL 200μL 200μL 12μL 12μL 25μL 2.试剂贮藏条件:裂解液、洗液、洗脱液、灭菌去离子水、矿物油、50倍TAE电泳缓冲液、染色液、上样缓冲液室温保存,其它试剂(塑料袋内)-20℃保存。 器材

试剂盒内配有薄壁PCR管25个。 其它需要自备的物品

1.仪器:分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器。

2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、经焦碳酸二乙醋(DEPC)水处理的灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。

使用注意事项

1.所有接触PRRSV病料的物品均应合理处理,以免PRRSV污染实验室。

整个试验分PCR反应液配制区－配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。 4．染色液低毒，应于室温条件避光保存，操作时戴上手套。

5.注意防止试剂盒组分受污染．使用前将红盖管8000rpm离心15s,使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面吸取。

6.不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。 7.在RNA提取过程中,避免RNA酶污染,尽量缩短操作时间。

8.严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。 9.本试剂盒为10头份CSFV RT－PCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。 样品制备

1.样品采集:病死或扑杀的猪,取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织:待检活猪,用注射器取血5mL,4℃保存,送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融病料。) 2.样品处理:每份样品分别处理。

组织样品处理:称取待检病料0.05g置研磨器中剪碎并研磨,加入600μLA液继续研磨。取己研磨好的待检病料上清300μL和100μLA液,置灭菌离心管中。 全血样品处理:待血凝后取上清100μL,置15mL灭菌离心管中。 阳性对照处理:取100μL,置15mL灭菌离心管中。 阴性对照处理:取F液100μL,置灭菌离心管中。 操作步骤

1.病毒RNA的提取

取已处理好的样品，加入裂解液600ul，充分颠倒混匀，室温静置3~5min

将全部液体吸入吸附柱中，吸附柱要套上收集管，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，

套上收集管。

向吸附柱中加入600ul洗液，13000rpm离心30s弃去收集管中液体，套上收集管。

重复步骤，再13000rpm离心2min。将吸附柱移入新的离心管中，在膜中央加入洗脱液25ul。室温静置1min130000rpm离心30s，获得总RNA。

操作程序

每份总体积20μL。取16ul反转录液（用前混匀）、1ulRNA酶抑制剂、1ul反转录酶、 中溶解好的病毒RNA。混匀并做好标记，在PCR扩增仪上进行以下循环：42℃ 60min 98℃ 5min. 3PCR操作

每份总体积20ul。取16ulPCR反应液（用前混匀） 2µlTaq DNA聚合酶、2ul 反转录操作中的产物，混匀，做好标记并加入20ul矿物油覆盖，放于PCR扩增仪上，扩增条件为90℃ 30s,55 ℃30s 72 ℃30s35个循环后，72℃延伸5min

3.电泳

称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中,加入50倍稀释的M液200mL(取4mL M液,用双蒸水稀释至200mL),于微波炉中熔解,再加入20μL N液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL O液,点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm电压于50倍稀释的M液中电泳,紫外灯下观察结果。 结果判定

在阳性对照出现400bp扩增带，阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为PRRS（Nsp2 1594~1680变异株）阳性,否则为阴性。

一、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清

【主要成分与含量】

抗原为加热灭活的布鲁氏菌，经离心后悬浮%苯酚生理盐水中制成。阴性血清系用健康家兔血液分离血清制成，阳性血清系用灭活的布鲁氏菌菌液免疫家兔，采血、分离血清制成。

【性状】

抗原为乳白色悬浮液。久置后，上部澄清，底部有少量乳白色菌体沉淀。阴、阳性血清冻干制品为黄白色疏松团块，加稀释液后迅速溶解；液体制品为黄色或无色透明液体。

【作用与用途】

用于动物布鲁氏菌病的试管凝集试验。

【用法与判定】

1 抗原使用时作1:20稀释被检血清分别作1:、1:25、1:50、1:100、1:200稀释，同时设阴、阳性血清对照。

2 抗原和血清各加于试管中，置36~37℃作用24小时，观察凝集试验结果。 3 结果判定：牛、马、鹿、骆驼血清1:100\"++\"为阳性；1:50\"++\"为可疑。猪、羊、犬1:50\"++\"为阳性；1:25\"++\"为可疑。对试验结果为\"可疑\"的动物，应于3~4周后重新采血检验，仍为可疑时，判为阳性。

【注意事项】

1 抗原和血清均用05%苯酚生理盐水稀释。

2 使用时需充分摇匀；稀释后的抗原或血清限当日用完。 3 如出现污染或有摇不散的凝块时不得使用。 4 失效或废弃的试剂及包装物应无害化处理。

【规格】5ml/瓶

【包装】10瓶/盒；30盒/箱。

【贮藏与有效期】2~8℃避光保存，有效期18个月。

二、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验

1、 材料准备

抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块， 无溶血和无腐败气味。 洁净的玻璃板， 其上划分成4cm2的方格。 吸管或分装器， 适于滴加 ml。 牙签或火柴杆， 供搅拌用。 观察结果照明用光源 2、 操作方法

将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清。 在受检血清旁滴加抗原。

用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。 每次试验应设阴、 阳性血清对照。 3、 判定

在阴、 阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。

受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+）， 无凝集现象，粉红色者判为阴性（-）。

呈均匀

动物结核病诊断操作规程

一、结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

1 目的

建立一个结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验操作规程。 2 范围

本实验室结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。 3 器材

游标卡尺、剪刀、注射器、针头、消毒盘、酒精棉等。 4 试剂

牛型结核分枝杆菌、禽型结核分枝杆菌 5 操作步骤

牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

5.1.1 牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验（出生后20d的牛即可用本试验进行检疫）。

5.1.1.1 操作方法

a）注射部位及术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛（或提前一天剃毛），三个月以内的犊牛，也可在肩胛部进行，直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，

作好记录。注意术部应无明显的病变。

b）注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射（含2000IU）。即将牛型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2万IU后，皮内注射。冻干PPD稀释后当天用完。

ｃ）注射方法：先以75％酒精消毒术部，然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPD，注射后局部应出现小疱，如对注射有疑问时，应另选15cm以外的部位或对侧重作。

d）注射次数和观察反应：皮内注射后经72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射，再经72h观察反应结果

对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96h和120h再分别观察一次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应

5.1.1.2 结果判定

a）阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm。 b）疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm小于4.0mm。 c）阴性反应：无炎性反应。皮厚差在2.0mm以下。

凡判定为疑似反应的牛只，于第一次检疫60d后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经60d再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。

5.1.2 其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 参照牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行。 禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最广泛使用于家禽的试验。牛及其他哺乳动物也可用牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行，以区分特异性和非特异性变态反应。

5.2.1 禽的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 2.1.1 操作方法

用10mm×0.5mm针头肉垂皮内注射（.025万IU）禽型结核分枝杆菌PPD，48h后观察结果。

5.2.1.2 结果判定

阳性反应为接种部位肿胀，从5.0mm直径的小硬结到扩展至其他肉垂与颈部的广泛性水肿。火鸡肉垂的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验，没有家禽的试验那样可靠。其他禽类也可用翼蹼作试验，但结果一般不理想。水禽可接种脚蹼，但试验不敏感并经常与接种部位

的感染相混淆。

5.2.2 牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 5.2.2.1 操作方法

与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同，只是禽型结核分枝杆菌PPD的剂量为每头（含万IU）。即将禽型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含万IU后，皮 内注射。

5.2.2.2 结果判定

a)对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性（局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm），并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应，二者皮差在2.0mm以上判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。

对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm 以下，甚至对牛型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应（反应差小于或等于2.0mm），只要对牛型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上，也应判定为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。

b）对禽结核分枝杆菌PPD的反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应，两者的皮差在2.0mm以下，判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。

对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下，甚至对禽型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应（不超过2.0mm），只要对禽型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上，也应判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。

7 标准依据

GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术