NLRP3抑制剂在制备抗DLBCL药物中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112190711 A(43)申请公布日 2021.01.08

(21)申请号 202011196043.3(22)申请日 2020.10.30

(71)申请人 山东大学齐鲁医院

地址 250014 山东省济南市历下区文化西

路107号(72)发明人 纪春岩　卢菲　马道新　赵亚楠　(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限

公司 37221

代理人 李筝(51)Int.Cl.

A61K 45/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01)G01N 33/574(2006.01)G01N 33/68(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图7页

CN 112190711 A(54)发明名称

NLRP3抑制剂在制备抗DLBCL药物中的应用(57)摘要

本发明具体涉及NLRP3抑制剂在制备抗DLBCL药物中的应用，弥漫性大B细胞淋巴瘤临床治疗仍然存在一部分患者治疗效果不理想、预后情况较差，并且复发和难治病例无法通过常规疗法缓解。本发明通过分析DLBCL患者与健康人群外周血T细胞表型，证实了DLBCL患者体内免疫抑制性细胞水平升高，T细胞抗肿瘤免疫功能受损。本发明研究还证实了，PD‑1和TIM‑3表达与DLBCL不良的预后相关，并且，DLBCL患者体内存在NLRP3炎症小体活化，其效应细胞因子与PD‑L1表达呈正相关，通过阻断NLRP3炎症小体能显著下调共抑制配体PD‑L1的表达，降低淋巴瘤小鼠免疫抑制性细胞群体的水平。

CN 112190711 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.IFN-γ和/或TNF-α激动剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。

2.如权利要求1所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的

应用，其特征在于，所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂为IFN-γ激动剂、TNF-α激动剂或IFN-γ激动剂、TNF-α激动剂的混合物，或同时激动IFN-γ和TNF-α的物质。

3.如权利要求1所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的

应用，其特征在于，所述作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用方式包括但不限于将所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂应用于制备抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物，或保健品；

优选的，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物由所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂及药学上所必须的辅料组成；

优选的，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中包括所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂及药学上所必须的辅料，还包括其他具有抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性的成分。

4.PD-1和/或TIM-3抑制剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用；优选的，所述PD-1和/或TIM-3抑制剂为PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂或PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂的组合物，或同时抑制PD-1和TIM-3的物质。

5.PD-1和/或PD-L1作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤诊断标志物的应用；优选的，所述PD-1作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤诊断标志物的应用方式包括但不限于将PD-1和/或PD-L1含量检测试剂在制备弥漫大B细胞淋巴瘤诊断试剂盒中的应用。

6.NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用。

7.如权利要求6所述NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用方式包括NLRP3炎症小体抑制剂用于制备抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物。

8.如权利要求7所述NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体抑制剂为MCC950；

或所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为CD3+、CD4+和CD8+T细胞激动剂；

或所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为TNF-α激动剂。9.如权利要求7所述NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用，其特征在于，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为PD-L1抑制剂；

或所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为免疫抑制性细胞群体抑制剂。

10.IL-18抑制剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。

2

CN 112190711 A

说　明　书

NLRP3抑制剂在制备抗DLBCL药物中的应用

1/6页

技术领域

[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NLRP3抑制剂在制备弥漫大B细胞淋巴瘤药物中的应用。

背景技术

[0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003]弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)占所有非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)的30-35％。尽管利妥昔单抗为基础的化疗作为一线治疗显著提高了疗效，但仍有三分之一的患者复发或难治，临床预后很差。90％的复发或难治病例不能通过常规挽救免疫化疗和自体干细胞移植得到缓解，因此，迫切需要进一步阐明DLBCL发病机制，评估高危因素，寻找新的治疗靶点。

[0004]恶性肿瘤可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答，逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是表达于免疫细胞和肿瘤细胞的调节免疫稳态的分子，可通过抑制T细胞和NK细胞等抗肿瘤免疫细胞的功能实现肿瘤的免疫逃逸。在多种实体瘤中存在免疫检查点分子程序性细胞死亡配体1(PD-L1)上调，并与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)相互作用以传递抑制性信号，从而抑制T细胞增殖和细胞因子产生。此外，肿瘤中存在多种免疫负调性细胞群体，包括髓系来源的抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和调节性T细胞(Tregs)等，它们会削弱机体的抗肿瘤免疫应答，从而促进肿瘤的进展、复发和转移。在DLBCL中，除了典型遗传学事件的发生，同样存在免疫逃逸。本研究发现DLBCL外周血中存在MDSCs和Tregs扩增，T细胞表达PD-1和TIM-3显著升高，DLBCL肿瘤组织PD-L1的表达明显上调，同时证实了PD-1和TIM-3的表达与多种预后不良因素相关，突出了免疫抑制在DLBCL发病中的作用。然而，免疫抑制在DLBCL中存在的确切机制尚不明确，对于DLBCL中潜在免疫抑制机制的认识有助于识别肿瘤微环境中的生物标志物，逆转免疫抑制状态，并改善免疫治疗反应。

[0005]炎症在肿瘤发生中起着关键作用，炎性微环境是肿瘤的重要组成部分。炎症小体是导致炎性细胞因子释放进而产生炎症级联反应的重要因素。NLRP3是研究最广泛的炎症小体，外来病原体入侵或者体内细胞的损伤和死亡，可招募、组装并激活NLRP3炎症小体，活化Caspase-1，切割IL-1β和IL-18前体，产生有活性的IL-1β和IL-18。一方面，NLRP3炎症小体在机体限制病原体侵袭和清除内源性损伤方面发挥重要作用；另一方面，其活化产生的成分累积效应可形成适合肿瘤生长的环境，从而促进肿瘤的生长与转移。发明人前期研究发现，NLRP3炎症小体在淋巴瘤细胞株中被活化，表明其作为治疗靶标的潜力。然而，炎症小体在调节肿瘤微环境、肿瘤发生和肿瘤免疫中的机制尚不清楚。近期研究表明，NLRP3炎性小体及其效应细胞因子IL-1β和IL-18参与肿瘤的免疫逃逸。IL-1β和IL-18可通过募集和激活MDSCs或诱导免疫检查点表达等抑制机体的抗肿瘤免疫应答。因此，免疫抑制可能是

3

CN 112190711 A

说　明　书

2/6页

NLRP3炎症小体诱导肿瘤发生的机制之一。目前，DLBCL中是否存在NLRP3的活化及其与肿瘤免疫抑制的关系尚未见报道。

发明内容

[0006]基于上述背景技术记载的内容，本发明目的在于明确NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用机制，为进一步提高弥漫大B细胞淋巴瘤治疗提供新的治疗思路和药物。

[0007]针对上述技术目的，本发明提供以下技术方案：[0008]本发明第一方面，提供IFN-γ和/或TNF-α激动剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。

[0009]Ⅱ型干扰素IFN-γ广泛参与了免疫及炎症应答反应，TNF-α(肿瘤坏死因子，tumor necrosis factor)具有直接杀伤肿瘤细胞的能力。本发明研究结果表明，DLBCL患者外周血T细胞产生IFN-γ和TNF-α较健康对照者明显减少，T细胞表面PD-1和TIM-3的表达显著上

调，该结果说明DLBCL患者T细胞抗肿瘤免疫功能受损。根据本领域的一般研究思路，通过促进肿瘤患者体内IFN-γ、TNF-α的表达，或抑制PD-1和/或TIM-3的表达，有望实现对弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗作用。[0010]本发明第二方面，提供PD-1和/或TIM-3抑制剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。

[0011]本发明第三方面，提供PD-1和/或PD-L1作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤诊断标志物的应用。

[0012]本领域公知，乳酸脱氢酶(LDH)是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，临床用于诊断心肌梗死、肝病和部分恶性肿瘤。Ki-67是一种反应肿瘤增殖的标记物。LDH和Ki-67的水平与DLBCL预后密切相关。[0013]依据本发明研究结果，DLBCL患者外周血中PD-1+ T细胞比例与血清乳酸脱氢酶(LDH)水平呈正相关，并且，DLBCL患者肿瘤组织表达PD-L1的含量与肿瘤组织Ki-67的表达呈正相关。依据该研究结论，本领域技术人员基于一般研究思路可以联想到PD-1和/或PD-L1有望作为一种DLBCL的诊断标志物。[0014]本发明第三方面，提供NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用。[0015]为了验证NLRP3炎症小体作为治疗靶点的可行性，本发明针对淋巴瘤疾病模型施用NLRP3炎症小体抑制剂，结果显示小鼠淋巴瘤生长受到抑制；进一步的，本发明研究还证实了体内阻断NLRP3炎症小体后，淋巴瘤小鼠体内CD3+、CD4+和CD8+T细胞比例升高，TNF-α的水平增加，还能显著降低淋巴瘤小鼠T细胞PD-1和TIM-3的表达，降低淋巴瘤小鼠免疫抑制性细胞群体的水平，全面改善弥漫大B细胞淋巴瘤小鼠患病水平。启示NLRP3炎症小体可作为治疗靶点，通过抑制NLRP3炎症小体的表达实现对弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗作用。[0016]本发明第四方面，提供IL-18抑制剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。[0017]本领域相关研究表明，炎性小体能够调节胱冬肽酶-1(caspase-1)的活化进而在天然免疫防御的过程中促进细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌。本发明为了明确NLRP3炎症小体在弥漫大B细胞淋巴瘤中是否具有表达，针对其活化产生的效应细胞因子IL-1β和IL-18的水平进行检测，检测结果表明，IL-18在DLBCL肿瘤组织中的表达相比

4

CN 112190711 A

说　明　书

3/6页

对照组具有显著的升高，并且其表达含量与PD-L1呈正相关，启示抑制IL-18的表达有望实现对弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗作用。

[0018]以上一个或多个技术方案的有益效果是：

[0019]本发明研究结果进一步明确了NLRP3炎症小体在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用方式，依据本发明研究结果，抑制NLRP3炎症小体能够通过免疫抑制全面的实现对弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗作用，抑制肿瘤的生长。本发明研究结果进一步明确NLRP3炎症小体作用机制，有利于弥漫大B细胞淋巴瘤临床治疗药物开发，具有重要的临床意义。附图说明

[0020]构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。[0021]图1为实施例1中所述DLBCL患者外周血T细胞功能；[0022]其中，图1A为DLBCL患者外周血中IFN-γ含量；[0023]图1B为DLBCL患者外周血中TNF-α含量。

[0024]图2为实施例1中所述DLBCL患者外周血T细胞共抑制受体的表达；[0025]其中，图2A为对照组与患者外周血中PD-1表型T细胞含量；[0026]图2B为对照组对照组与患者外周血中Tim-3表型T细胞含量；[0027]图2C为对照组对照组与患者外周血中BTLA表型T细胞含量；[0028]图2D为对照组对照组与患者外周血中TIGIT表型T细胞含量；[0029]图2E为对照组对照组与患者外周血中CD160表型T细胞含量；[0030]图2F为对照组对照组与患者外周血中LAG-3表型T细胞含量。

[0031]图3为实施例1中所述PD-1和TIM-3表达与血清LDH水平的相关性；[0032]图4为实施例1中所述PD-1和TIM-3表达与Ann Arbor分期的关系；[0033]图5为实施例1中所述PD-1和TIM-3表达与IPI评分的关系；

[0034]图6为实施例1中所述PD-L1在DLBCL肿瘤组织和正常组织的表达水平；[0035]图7为实施例1中所述DLBCL肿瘤组织中PD-L1表达与Ki-67的关系；[0036]图8为实施例1中所述MDSCs和Tregs在DLBCL外周血中的比例；[0037]图9为实施例1中所述DLBCL肿瘤组织中IL-1β和IL-18的表达水平；[0038]图10为实施例1中所述DLBCL肿瘤组织IL-1β和IL-18的表达与CD10和MUM1表达分析；

[0039]图11为实施例1中所述DLBCL肿瘤组织IL-1β和IL-18的表达与PD-L1表达相关性分析；

[0040]图12为实施例1中所述荷瘤小鼠肿瘤大小及生长曲线；

[0041]图13为实施例1中所述MCC950处理小鼠肿瘤和脾脏NLRP3相关蛋白及PD-L1的表达检测；

[0042]图14为实施例1中所述MCC950处理组小鼠脾脏T细胞的比例及分泌TNF-α的水平；

[0043]图15为实施例1中所述对照组和MCC950组小鼠脾脏和淋巴结T细胞表面PD-1和TIM-3表达；

[0044]图16为实施例1中所述小鼠外周血、脾脏和肿瘤中MDSC、TAM和Treg的表达检测。

5

CN 112190711 A

说　明　书

4/6页

具体实施方式

[0045]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0046]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。[0047]正如背景技术所介绍的，针对现有技术中弥漫性大B淋巴细胞瘤难治及预后差的现象，为了解决如上的技术问题，本发明目的在于进一步明确弥漫性大B淋巴细胞瘤发病机制，为其治疗提供新的治疗靶点。[0048]本发明第一方面，提供IFN-γ和/或TNF-α激动剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。

[0049]优选的，所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂为IFN-γ激动剂、TNF-α激动剂或IFN-γ激动剂、TNF-α激动剂的混合物，或同时激动IFN-γ和TNF-α的物质。[0050]优选的，所述作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用方式包括但不限于将所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂应用于制备抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物，或保健品。

[0051]上述优选技术方案的一些实施方式中，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物由所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂及药学上所必须的辅料组成。

[0052]上述优选技术方案的另一些实施方式中，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中包括所述IFN-γ和/或TNF-α激动剂及药学上所必须的辅料，还包括其他具有抗弥漫大B细胞淋

巴瘤活性的成分。

[0053]本发明第二方面，提供PD-1和/或TIM-3抑制剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。

[0054]优选的，所述PD-1和/或TIM-3抑制剂为PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂或PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂的组合物，或同时抑制PD-1和TIM-3的物质。[0055]本发明第三方面，提供PD-1和/或PD-L1作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤诊断标志物的应用。

[0056]优选的，所述PD-1和/或PD-L1作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤诊断标志物的应用方式包括但不限于将PD-1和/或PD-L1含量检测试剂在制备弥漫大B细胞淋巴瘤诊断试剂盒中的应用。

[0057]本发明第三方面，提供NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用。[0058]优选的，所述NLRP3炎症小体作为弥漫大B细胞淋巴瘤治疗靶点的应用方式包括NLRP3炎症小体抑制剂用于制备抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物。[0059]进一步优选的，所述NLRP3炎症小体抑制剂为MCC950。[0060]进一步优选的，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为CD3+、CD4+和CD8+T细胞激动剂。[0061]进一步优选的，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为TNF-α激动剂。

6

CN 112190711 A[0062]

说　明　书

5/6页

进一步优选的，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作

为PD-1和TIM-3抑制剂。[0063]进一步优选的，所述抗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中，所述NLRP3炎症小体抑制剂作为免疫抑制性细胞群体抑制剂。[0064]本发明第四方面，提供IL-18抑制剂作为抗弥漫大B细胞淋巴瘤活性成分的应用。[0065]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。[0066]实施例1

[0067]1.DLBCL患者抗肿瘤免疫应答的特征

[0068]1.1DLBCL患者PD-1和TIM-3的表达及其与临床特征的关系[0069]为明确DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答是否受损，本实施例中收集了59例初诊DLBCL患者和59例健康对照者，利用流式细胞术检测了外周血T细胞的表型和功能。结果显示：DLBCL患者外周血T细胞产生IFN-γ(P＝0.0153)(图1A)和TNF-α(P＝0.0183)(图1B)较健康对照者明显减少。检测T细胞表面免疫检查点分子的表达，结果显示：与对照组相比较，T细胞表面PD-1(P＝0.0003)和TIM-3(P<0.0001)的表达显著上调，其他共抑制受体BTLA、TIGIT、CD160和LAG-3与对照相比无明显差异(P>0.05)(图2)。因此，DLBCL患者T细胞抗肿瘤免疫功能受损。

[0070]1.2PD-1和TIM-3表达与临床特征和预后的关系[0071]结果显示，初诊DLBCL患者外周血中PD-1+ T细胞比例与血清乳酸脱氢酶(LDH)水平呈正相关(r＝0.4999；P<0.0001)，而TIM-3与LDH水平无明显相关性(r＝0.1462；P＝0.2693)(图3)。T细胞表达PD-1和TIM-3与淋巴瘤分期和国际预后指数(IPI)密切相关：Ann Arbor III/IV期的初诊DLBCL患者较Ann Arbor I/II期的患者T细胞表达PD-1(P＝0.0027)和TIM-3(P＝0.0051)明显升高(图4)。此外，IPI评分3-5分的患者较IPI评分0-2分的患者T细胞表达PD-1(P＝0.0025)和TIM-3明显升高(P＝0.0185)(图5)。可见，PD-1和TIM-3表达与DLBCL不良预后相关。

[0072]1.3DLBCL肿瘤组织共抑制配体PD-L1表达

[0073]本实施例收集了35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织制备微阵列组织芯片。进行免疫组化染色，根据染色强度和阳性细胞比例评分。结果显示：DLBCL肿瘤组织PD-L1表达较正常淋巴组织明显上调(P<0.0001)(图6)。进一步研究发现，PD-L1表达与DLBCL患者肿瘤组织Ki-67的表达呈正相关(r＝0.4880；P＝0.0029)，以Ki-67表达60％为界将DLBCL患者分成Ki-67low和Ki-67high两组，发现Ki-67high组的PD-L1表达明显升高(P＝0.0079)(图7)。

[0074]1.4DLBCL患者体内免疫抑制性细胞的水平

[0075]进一步分析DLBCL患者体内的骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和Tregs的数量和分布，结果显示，与健康对照者相比，DLBCL初诊患者外周血中MDSCs(P<0.0001)和Tregs比例显著升高(P＝0.0068)(图8)。[0076]综上，DLBCL患者肿瘤部位共抑制配体表达明显上调，体内免疫抑制性细胞群体水平显著升高。[0077]2、DLBCL患者体内NLRP3炎症小体检测

7

CN 112190711 A[0078]

说　明　书

6/6页

为明确NLRP3炎症小体在DLBCL中的表达，本实施例检测了其活化产生的效应细胞

因子IL-1β和IL-18的水平。利用组织芯片对IL-1β和IL-18进行免疫组化染色，结果显示，DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平较对照显著升高(P＝0.0440)，而IL-1β表达在肿瘤组织和对照组之间差异不明显(P>0.05)(图9)。进一步研究发现，与GCB型DLBCL患者相比，IL-18在non-GCB型DLBCL中的表达水平更高(P＝0.0261)(图9)。另外，IL-18和IL-1β在CD10(+)患者中表达水平明显低于CD10(-)患者(P＝0.0381)，而IL-18和IL-1β在MUM1(+)患者中表达水平明显高于MUM1(-)患者(P＝0.0267)(图10)。分析IL-18和IL-1β与PD-L1表达的相关性，发现DLBCL肿瘤组织中IL-18水平与PD-L1表达呈正相关(r＝0.4750；P<0.0001)，IL-1β与PD-L1表达无明显相关性(r＝0.1484；P＝0.2348)(图11)。综上，DLBCL患者体内存在NLRP3炎症小体活化，其效应细胞因子与PD-L1表达呈正相关。

[0079]3.NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠模型发病的影响[0080]利用BALB/c小鼠同系淋巴瘤细胞株A20构建荷瘤小鼠模型，绘制肿瘤生长曲线，比较对照组(PBS处理组)和NLRP3抑制组(MCC950处理组)小鼠淋巴瘤生长情况，显示NLRP3抑制组小鼠淋巴瘤大小较对照组显著减小(P＝0.0308)，小鼠的淋巴瘤生长受到抑制，肿瘤进展较对照组延缓(图12)。同时Western Blot验证MCC950对荷瘤小鼠体内NLRP3炎症小体的阻断作用，显示MCC950显著下调了肿瘤组织和脾脏中NLRP3相关蛋白(NLRP3，Caspase-1，Cleaved caspase-1，Pro-IL-1β，Cleaved IL-1β和IL-18)的表达，其活化的标志Cleaved IL-1β和IL-18在肿瘤中的蛋白水平明显降低(图13)。同时，小鼠肿瘤组织的Western Blot检测发现，MCC950阻断NLRP3炎症小体能显著下调共抑制配体PD-L1的表达(图13)。[0081]4.NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠模型抗肿瘤免疫应答的影响[0082]4.1体内阻断NLRP3炎症小体对T细胞比例和功能的影响[0083]流式检测结果显示：与对照组相比，NLRP3抑制组荷瘤小鼠脾脏CD3+(P＝0.0089)、CD4+(P＝0.0050)和CD8+(P＝0.0177)T细胞的比例明显升高；CD3+(P＝0.0033)和CD4+(P＝0.0052)T细胞分泌TNF-α的水平明显增加(图14)。

[0084]4.2体内阻断NLRP3炎症小体对T细胞表面PD-1和TIM-3表达的影响[0085]流式检测结果显示：脾脏CD3+(P＝0.0094)和CD4+(P＝0.0045)T细胞表达PD-1的比例显著降低，淋巴结CD3+(P＝0.0318)和CD4+(P＝0.0241)T细胞的百分比显著降低；脾脏CD3+

(P＝0.0009)、CD4+(P＝0.0001)和CD8+(P＝0.0136)T细胞表达TIM-3显著降低；淋巴结CD3+(P＝0.0476)和CD4+(P＝0.0278)T细胞表达TIM-3的比例显著降低(图15)。综上，MCC950阻断NLRP3炎症小体能显著降低淋巴瘤小鼠T细胞PD-1和TIM-3的表达。[0086]4.3体内阻断NLRP3炎症小体对MDSCs、TAMs和Tregs水平的影响[0087]流式检测结果显示：肿瘤浸润的MDSCs(Gr-1+CD11b+)(P＝0.0514)、TAMs(CD11b+F4/80+)(P<0.0001)和Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)(P＝0.0003)显著降低；脾脏MDSCs(P＝0.0061)、TAMs(P＝0.0046)和Tregs(P＝0.0018)显著降低；外周血中MDSCs(P＝0.0096)和TAMs(P＝0.0077)显著降低(图16)。综上，MCC950阻断NLRP3炎症小体能显著降低淋巴瘤小鼠免疫抑制性细胞群体的水平。

[0088]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

8

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

1/7页

图1

图2

9

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

2/7页

图3

图4

图5

10

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

3/7页

图6

图7

图8

11

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

4/7页

图9

12

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

5/7页

图10

图11

图12

13

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

6/7页

图13

图14

14

CN 112190711 A

说　明　书　附　图

7/7页

图15

图16

15