菘蓝叶片的离体培养及植株再生

菘蓝叶片的离体培养及植株再生

农学院 姓名： 学号 指导教师：

摘要：为研究不同激素组合对菘蓝离体叶片的不定芽诱导及生根影响，以菘蓝叶片为外植体在不同激素组合的MS培养基上培养菘蓝离体叶片，并观察菘蓝的生长情况和统计菘蓝的丛生芽、愈伤组织诱导率、存活率和生根率等。结果表明，2，4-D和KT的激素组合不能诱导出不定芽，而NAA和6-BA的激素组合可诱导出不定芽，且以6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L的激素配比为最适。2，4-D虽有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用,而适当比例的NAA和6-BA促进芽的分化。IBA和NAA对菘蓝的生根均有一定的促进作用。

关键词：菘蓝 离体培养 激素组合 丛生芽 生根

菘蓝（Isatis indigotica Fortune）是十字花科菘蓝属有重要开发前景的药用植物［1］。根（板蓝根）、叶（大青叶）均供药用，有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛的功效；叶还可提取蓝色染料；种子榨油供工业用

［2］

。菘蓝是2年生草本，主根深长，肉质肥厚。茎直

立，上部多分枝。复总状花序，花黄色，角果长圆形，扁平［3-4］。菘蓝主要分布于安徽、河北、江苏、河南、陕西、四川、山西、山东等地，主产于河北安国，江苏南通，安徽太和、怀远、界首、毫州、涡阳等地［5］。根据程春松等人［6］的综述可知菘蓝在育种方面取得了较大的进展，包括单倍体育种、多倍体育种、转基因育种等。菘蓝的药用价值被广泛开发与利用，是常用的大宗中药材之一，市场需求量巨大。菘蓝不仅以根为主要原料制成饮片人市，其茎叶也是很好的药用蔬菜，其营养丰富，吃法多样，可炒，可腌，可煮汤。菘蓝一年四季均可栽培、生长，茎叶产量高，合理利用并不影响根的产量，并且还有防病、治病、保健功能，也符合人们回归自然的生活理念，其市场价较高，对其进行综合开发与利用前景十分广阔［7］。本实验主要研究不同激素组合对菘蓝叶片离体培养及植株再生的影响，以寻求对菘蓝叶片离体培养及植株再生的最佳激素组合，以期为菘蓝叶片的离体培养及植株再生提供参考。 1. 材料与方法 1.1 供试材料

1

菘蓝幼叶（由四川农业大学农学院植物生理系提供） 1.2 试验方法 1.2.1 培养基设计

选用MS培养基（见表1）作为基本培养基，再按目的加入一定浓度的不同激素或其他成分，充分混匀后加入蒸馏水溶化的15g蔗糖和已溶化的琼脂2.5g，最后用蒸馏水定容至500ml，调节PH至5.8。PH调好后将培养基及时分装于培养容器中，分装时要尽量避免培养基污染瓶口。分装后，塞上棉塞或用无菌培养容器封口膜外加一层牛皮纸封口。培养基采用高温高压湿热灭菌，在高压锅内于0.1MPa（121℃）压力下灭菌20min。灭菌后将其烘干放于接种室备用。丛生芽诱导培养基见表2，继代增殖适用丛生芽诱导2号培养基，生根培养基见表3。

表1 配制500mlMS培养基各母液的吸取量

母液类型 吸取量

表2菘蓝丛生芽诱导培养基

培养基序号

1 2 3 4 5 6

表3生根培养基

培养基序号

1 2

IBA(mg·L)

0.1 0

-1

大量元素 50ml

微量元素Ⅰ 微量元素Ⅱ

5ml

0.5ml

铁盐 5ml

有机物 0.5ml

甘氨酸 1ml

肌醇 50mg

6-BA(mg·L) NAA(mg·L) 2,4-D(mg·L)

2.0 2.0 2.0 0 0 0

0.1 0.5 1.0 0 0 0

0 0 0 1.0 2.0 4.0

-1-1-1

KT (mg·L)

0 0 0 0.5 0.5 0.5

-1

NAA(mg·L)

0 0.1

-1

活性炭（g/L）

2 2

1.2.2 材料处理

剪取板蓝根幼叶3-5片，包于纱布内，置烧杯中自来水冲洗30-60分钟。将冲洗后的

2

材料放入超净工作台内的无菌瓶中，打开紫外灯灭菌30min。之后用75%的酒精消毒10S，无菌水清洗3次，0.1%HgCl处理10min，再用无菌水清洗4次，备用。 1.2.3 接种

将菘蓝的外植体切成1cm2的小块，接入灭菌后的培养基中（注明日期），放入培养室内培养观察。 1.2.4 培养条件

温度23±2℃，光照时间14h/d，光照强度1500-2000Lx（注：第一周进行暗培养）。 1.2.5 数据统计

叶片接种14 d后统计菘蓝的存活数目，计算存活率，观察叶片形态变化。生根培养14d后统计生根率及不定根的数目。

存活率(％)=存活的外植体数/总外植体数×100 生根率(％)=生根的外植体数/接种外植体数×100 2. 结果与分析

2.1 不同激素组合对菘蓝诱导培养的影响

菘蓝离体叶片经过两周培养后，在添加不同的激素组合的培养上，产生了不同的效果。从表4可以看出，菘蓝叶片在添加了NAA和6-BA的培养基上（1、2、3号）都能分化出不定芽，但在添加了2，4-D和KT的培养基上（4、5、6号）都没有不定芽产生。这主要是因为2，4-D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用［8］。

其中以3、6号培养基存活率最高，较1、2、4、5号培养基分别高出5.00%，5.00%，9.37%和16.67%，5号培养基存活率最低。2号培养基污染最为严重，但出芽最多，明显优于其它培养基，说明6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L的激素组合是诱导菘蓝叶片产生丛生芽的最适培养基。

表4暗培养14天后不同培养基组合启动效果

污染数（支）

接种数

序号

（个） 真菌 1 2 3

污染率% 真菌 0 4.7 0

细菌

存活

存活

数

叶片形态变化

率%

(个) 40 40 35

3

细菌 0 1 0

42 42 35

0 2 0

0 2.3 0

95.23 95.23 100.00

卷曲，膨大，变厚，出芽少 卷曲，膨大，变厚，出芽多 卷曲，膨大，变厚，出芽少

4 5 6

35 42 14

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

32 36 14

91.43 85.71 100.00

卷曲，膨大，变厚，边缘变黄 卷曲，膨大，变厚，边缘变黄

略卷曲变厚

2.2 菘蓝的继代增殖

由表5可知，菘蓝的继代增殖培养存活率较低为72.92%，其中干枯率较大为16.67%，污染率为10.42%。由于继代增殖之前，2号培养基长势甚好，而继代增殖之后，死亡率上升，说明是操作不当而引起的。

表5 菘蓝继代增殖培养结果 死亡数（瓶）

接种数（瓶）

污染

48

5

干枯 8

72.92 存活率%

2.3 不同激素组合对菘蓝生根诱导的影响

由表6可知，添加了IBA的培养基存活率(达100%)及生根率（80%）都较高；添加了NAA的培养基存活率极低为17%，且并未诱导出生根，导致无法确定NAA对菘蓝生根诱导的影响。说明操作存在严重错误。

表6不同浓度的激素配比对诱导菘蓝幼叶生根的影响

培养基序号

1 2

接种数/瓶

5 6

存活数/瓶

5 1

存活率 100% 17%

生根数/瓶

4 0

生根率（%）

80% 0%

3.1 结论

由该实验可知，在添加了2，4-D和KT的培养基上不能诱导出不定芽，而在添加了NAA和6-BA的培养基上可诱导出不定芽，且以6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L的激素组合为最适。说明2，4-D和KT的激素组合不能诱导出不定芽，而NAA和6-BA的激素组合可诱导出不定芽。添加了IBA的培养基虽然生根率较高，但由于添加了NAA的培养基多数死亡，无法比较IBA与NAA对菘蓝生根诱导的影响。 3.2讨论

2，4-D和KT的激素组合不能诱导出不定芽，而NAA和6-BA的激素组合可诱导出不定芽，

4

这与彭丽萍和胡冬南等人的研究基本一致［9-10］。这主要是因为2，4-D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用,而适当比例的NAA和6-BA促进芽的分化。虽然本次试验未能探讨出IBA与NAA对菘蓝生根诱导的影响，但通过多数前人（胡冬南、戴云新［11］、张晓旭［12］等）的研究可以发出现：IBA和NAA均为生长素类物质，对菘蓝的生根均有一定的促进作用，IBA对植物发根有很好的效应，NAA诱导形成不定根，但高浓度抑制生根，且IBA对菘蓝生根的促进作用不如NAA，影响生根的因素主要取决于生长素的种类、浓度及其组合。 参考文献：

［1］ 崔树玉.薛原.杨建莉.板蓝根研究进展[J].中草药,2001,32(7):670—671. ［2］ 周太炎.中国植物志第三十三卷［M］.科学出版社.1987.10：65. ［3］ 宋延杰.药用植物实用种植技术［M］.金盾出版社.2003.1：271. ［4］ 郭巧生.药用植物栽培学［M］.高等教育出版社.2004.8:284.

［5］ 吕晔，陈宝儿.丹参 太子参 半夏 北沙参 板蓝根 贝母 元胡 白芷 玄参 麦冬 薏苡［M］.江苏科学技术出版社.2001.10：122.

［6］ 程春松，彭代银，黄和平等.菘蓝育种研究现状及现代生物技术的应用[J].安徽中医学院学报,2012.31(4).

［7］ 太光聪，李友，朱继富.菘蓝的药用价值及开发利用[J].现代农业科技,2011(9):134-136. ［8］ 陈秋芳，黄群策，秦广雍.菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立［J］.河南农业科学.2007.（12）:98-100.

［9］ 彭丽萍，张远兵，汪露润.安徽科技学院学报，2007，21（4）：14-17. ［10］ 胡冬南，柯国庆，王恒芬等.安徽农业科学，2009，37（17）：7868—7869.）

［11］ 戴云新，张健，李敏等．NAA和IBA对非洲菊组培苗生根的影响［J］．安徽农业科学．2009，37（19）：8845-8847.

［12］ 张晓旭 激素对菘蓝器官分化及愈伤组织诱导的影响[J].现代中药研究与实践. 2012,128(5): 13-15.

5