饲用酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究

酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究

一、 概述

本项目2004年获得河南省科技攻关项目的立项支持，项目编号：0424240040。

酶是生物细胞原生质合成且具有高度催化活性的蛋白质。人类早在认识酶之前就知道利用酶为生产和生活服务，例如酿造、鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史。17年Büchner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳。二十世纪初，有更多的酶被发现和分离提纯，注意到了某些酶的作用需要有低分子物质（辅酶）的参加，并陆续认识了很多酶所催化的反应。1926年Sumner第一次从刀豆中分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶。30年代，J.Northrop又连续分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500种酶得到结晶，2000多种酶得到鉴定，200种左右商品酶已经开发，但工业上应用的酶仅有50多种。二次世界大战后抗生素工业的通风搅拌发酵技术的利用，使微生物酶制剂工业得到迅速发展。20世纪40年代末，生产α-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。20世纪50年代后期遗传工程、蛋白质工程等现代生物技术的研究成果，促使世界酶制剂工业持续地高速发展，成为生物工程四大主导产业中最早产业化的高技术产业。由于酶制剂是一种绿色高效生物催化剂，具有高效、节能、安全和环保等特点，对酶制剂应用产业开发新产品、提高质量、节能

降耗、保护环境重要意义；因此，这一产业的发展受到各国的高度重视，有着广阔的发展前景。

国际酶制剂市场目前保持着9％的增长速度，2010年世界酶制剂年销售额达160亿美元，目前已有一大批可用于工业发酵生产的各种胞外酶的微生物，如芽孢杆菌、大肠杆菌、放线菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品种数量主要有糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、延胡索酸酶、青霉素酰化酶、溶菌酶、链激酶、漆酶、植酸酶、复合酶等等。应用范围覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多领域，创造工业附加值数千亿多元。我国自1965年建立起第一个专业酶制剂工厂，由于不断引进技术、资金和设备，酶制剂工业得到迅猛发展，产量由1965年的10吨增长到2010年的219万吨，平均每年以20％以上的速度增长，产值达6亿多元，应用范围愈来愈广泛。我国酶制剂工业与发达国家相比，存在的差距主要有：（1）技术研究与开发滞后，基础理论研究与技术开发研究严重脱节，科研资金力度不够且分散，科研技术转化能力不强。（2）行业规模小而分散，市场能力弱，我国现有100多家酶制剂生产企业，企业数量占世界三分之一还多，但销售额仅占世界酶制剂销售额5％，企业规模小、产品的市场覆盖率低，导致企业对市场的能力普遍较弱，企业间无序的

价格竞争使整个行业经济效益下滑，使企业在技术创新、新品种开发、设备更新等方面力量不足，严重制约了酶制剂产业的可持续发展。（3）产品结构不合理，技术落后。我国酶制剂产品主要是以糖化酶、淀粉酶、蛋白酶为主，三者加起来占据全国酶制剂产量的97％，全国一半以上企业生产品种单一，抗市场风险非常弱。（4）酶制剂的应用开发力度不够，制约了酶制剂企业的市场开拓能力。

酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000—40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。

国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉（Aspergillus niger）、大孢子黑曲霉突变株（A. niger var. macrosporus）、斋藤曲霉（A. saitoi）、宇佐美曲霉（A. usamii）、泡盛酒曲霉（A. awamori）、微紫青霉（Pen. janthinellum）、常规青霉（Pen. frequentens）、杜邦青霉（Pen. dupoti）、宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）、小孢米曲霉突变株（A. oryzacvar.

microsporus）、根霉（Rhizopus sp.）、微小毛霉（M. pusillus）、粘红酵母（Rhdotorula glutinis）、粟疫霉（Endothia parasitica）、血红色陀螺孔菌（Trametes sanguinca）、芽枝霉（Cladosporium sp.）等。1903年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。19年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。

微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3．350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3．350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌

种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等（1994年）用60Coγ射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等（1995年）以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50℃，90℃下恒温4h的酶活比出发菌株高.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等（1999年），对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等（2006年）对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等（2007）采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云（2008年）通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。

国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流（沸腾）干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、

稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。 二、酸性蛋白酶制剂的作用机理和酶学特性

1、酸性蛋白酶的作用机理

酸性蛋白酶是一种天冬氨基蛋白酶，分子质量为30~40KD, 在其活性中心有两个天冬氨基残基，其代表性特征是能够在酸性或中性环境条件下水解动植物蛋白质，将两个疏水氨基酸打断，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。微生物酸性蛋白酶对肽键两端的苯环和大的氨基酸基团有较高的专一性，酸性蛋白酶的催化机理是酸碱催化作用，由活性位点的两个天冬氨酸在酸性或碱性条件下交替发挥作用，其中一个天冬氨酸失去质子，另一个天冬氨酸则被质子化。

由于饲用酶进行催化反应在畜禽消化道内进行，故其作用条件必须与动物消化道生理条件相适应，而通常猪和家禽消化道内温度为40℃ 左右，而胃pH1.5—3.5，小肠pH5—7，与酸性蛋白酶作用的一些基本参数相吻合。畜禽尤其是幼龄动物的消化道内蛋白酶分泌体系发育不健全而在生长的中后期，自身虽有内源酶，但尚显不足，当采用高蛋白饲料饲养时，因其对饲料蛋白质消化能力较差而易引起腹泻等疾病。尤其是断奶仔猪，消化道发育不成熟，消化酶分泌系统不健全，特别是胃酸分泌不足，免疫功能低下，加上断奶时的生理、营养和环境应激反应，对饲料的营养成分不易消化和吸收，对病原微生物的抵抗力较弱，易造成正常肠道菌群平衡紊乱，经常出现较高的腹泻率，导致早期生长受阻。若在饲料中添加酸性蛋白酶，则能补充内源酶的不足，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽、胨及各种氨基酸，

而易被畜禽消化吸收，从而降低饲料对断奶仔猪消化道的刺激，降低应激反应，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进生长。 2、酸性蛋白酶的酶学特性

酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物，不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的性质，但在底物pH值、特异性、抑制剂、激活剂等方面均存在着一定的差异。

(1)pH对酶活及酶稳定性的影响

酸性蛋白酶在pH2.0～6.0之间较为稳定，但不同的微生物所产酶的最适作用有所不同。曲霉属酸性蛋白酶最适作用pH值为2．5～4．0，稳定pH值为1.5～6.0。斋藤曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2．0～3．0，稳定pH值为1.5～6.0。米曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为3．0～4．0，稳定pH值为3.0～6.0。宇佐美曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2.5，稳定pH值为2.0～3.5。青霉属所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2．0～3．0，稳定pH值为1.5～6.5。酸性蛋白酶对pH值的要求，与酶活性中心的羧基有关。 （2）温度对酶活性及稳定性影响

酸性蛋白酶一般在50℃以下较为稳定，但也随产酶微生物的不同而有所差异。如根霉属所产酸性蛋白酶在30℃下只能保持30分钟，而曲霉属的斋藤曲霉所产酸性蛋白酶在50℃稳定，55℃处理10分钟才会失活。黑曲霉Vs、V315 菌株所产酸性蛋白酶在80℃保温2小时 后仍有90%的酶活力存在。青酶属产的门冬氨酸蛋白酶，最适pH值条件下，50℃时达到最大酶活。酵母菌所产酸性蛋白酶经60℃处理后

还剩少许酶活力，经70℃处理后酶活完全丧失。 （3）金属离子对酶活力的影响

Ag＋ 对酸性蛋白酶有轻度抑制作用，当其浓度为5mol/L时，酶活下降15% ;Cu2＋、Mn2＋对其有激活作用，当Cu2＋的浓度为0.02mol/L时，对酶有明显的激活作用；Cu2＋、Mn2＋ 和Al3＋同时添加时，对酶有协同作用，使酶活提高1倍；Ca2＋本身并不抑制酸性蛋白酶的活性，但它可作为其它物质的辅助因子而对某些酸性蛋白酶产生抑制作用。液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较多。

（4）抑制剂对酶活力的影响

通常酸性蛋白酶的活性中心肽段是基本相似的，抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌来源的酸性蛋白酶通常并不受胃蛋白酶抑制剂—对-溴苯的抑制，但却对N-溴代琥珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。此外，并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂(S-PI) 抑制,这可能与酶的活性部位含酪氨酸以及色氨酸有关。

三、酸性蛋白酶高产菌株（Aspergillus niger—Y06）的选育研究

1、材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 出发菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）中国工业微生物菌种保藏中心提供，CICC编号：3.4309

1. 1. 2 培养基

1. 1. 2. 1 分离及斜面培养基

斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基, 分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白。PDA培养基：取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，加葡萄糖 20克，琼脂 15-20克，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，自然PH，分装试管，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。察氏培养基：钠3g 、磷酸氢二钾1g 、硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g 、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g 、蒸馏水1000mL ，加热溶解，自然PH，分装后121℃灭菌20min。 。

1. 1. 2. 2 固体发酵基础培养基

麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2，每1 kg 培养基中添加硫酸铵 1.5%, 水750 ml, 调pH6.5。

1. 1. 2. 3 液体发酵培养基

豆饼粉3.65% , 玉米粉0.625% , 鱼粉0.625%, 硫酸铵1.0% , CaCl2 0.5% , Na2HPO4 0.2%, 豆饼水解液6%, pH5.5。

2、实验方法

2. 1 菌种的分离和纯化 采用常规稀释分离法。 2. 2 菌株的诱变处理 2. 2. 1 紫外线诱变处理

用接种环取新鲜PDA斜面上的黑曲霉孢子少许, 加入无菌水中进行稀释,用血球计数板进行计数, 使每毫升溶液中孢子量约为5000 个, 取0.1 ml涂布初筛平板, 30℃培养4 h, 让孢子萌发, 紫外灯预热30min后，将平皿放置距离紫外灯30cm处分别照射4 min、6 min、8min、1 0min、12min，随后用5mL无菌生理盐水将平皿上的菌洗脱，适当稀释后，涂布于分离平皿，以黑布包裹30℃培养3-4天，从长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种。

2. 2. 2 亚硝基胍诱变处理

用接种环取新鲜PDA 斜面上的黑曲霉孢子少许, 加入无菌水中进行稀释, 用血球计数板进行计数, 使每毫升溶液中孢子量约为5 000个, 取3ml孢子悬液, 加入等体积的亚硝基胍溶液, 充分混合, 于31℃振荡处理1h, 取出稀释涂平板, 31℃培养5d, 挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验。

2. 3 固体培养方法

挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500 ml三角瓶中, 培养温度为31℃, 培养时间5d, 测定酶活。

2. 4 液体培养方法

挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50ml 液体培养基的500ml三角瓶中, 培养温度为31℃, 培养时间3d, 测定酶活。

2. 5 固体培养方法

挑取一环生长在PDA 斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500ml三角瓶中, 培养温度为31℃, 培养时间5d, 测定酶活。

2. 6 液体培养方法

挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中,培养温度为31℃,培养时间3d,测定酶活。

2. 7 酶活测定方法

酸性蛋白酶酶活力的测定采用河南省瑞特利生物技术有限公司产品企业标准（Q／HRS 018-2011）相关方法。

3、菌株选育结果 3.1 紫外线诱变

为了提高菌体的发酵水平或改良生产菌，过去经典的理化诱变育种技术仍然广泛的被采用，本实验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿。紫外照射孢子成活率结果如表1所示。

表1 紫外照射孢子成活结果

照射时间（min） 活菌数（个∕ml） 成活率（%） 0 5000 100 4 3250 65 6 2100 42 8 1350 27 10 500 10 12 100 2 为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株, 经紫外线诱变处理后, 得到10O余株突变株。这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定,获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示。其中5株产酶较高, 分别为z-10株9284 U / g （干基）、z-09 株8887 U / g （干基）、z-12 株85 U/ g （干基）、z-17 株8199U / g （干基）、z-08株8018 U / g （干基）。

表2 菌株产酸性蛋白酶活力

菌株编号 z-03 z-05 z-08 z-09 z-10 z-12 z-15 z-17 z-18 z-20 酶活力（u∕mg） 7985 7725 8020 8775 9235 87 7503 8147 7133 7980 酶活力（u∕mg） 7996 7746 8015 98 9332 8523 75 8250 7256 8005 平均值（u∕mg） 7991 7736 8018 8887 9284 85 7546 8199 7195 7993 3.2 亚硝基胍诱变

选择经紫外线诱变产酶最高的z-10菌株用亚硝基胍进行进一步诱变处理, 由酪蛋白平板初筛得到菌株36 株, 经摇瓶复筛得到菌株10株, 此10株再经三角瓶固体发酵复筛。酶活超过2.5万U/g （干基）的菌株有4株, 基中二株产酶最高, 分别为Y06株36134 U/ g （干基）、Y05株34324U/g（干基）。选择酶活最高的菌株Y06株进行酸性蛋白酶生产性试验。亚硝基胍诱变的结果如表3所示。

表3 亚硝基胍诱变的菌株产酶情况

菌株编号 Y02 Y05 34100 34548 34324 Y06 35940 36328 36134 Y08 31080 31056 31068 酶活力（u∕mg） 26832 酶活力（u∕mg） 263 平均值（u∕mg） 26863

四、影响酸性蛋白酶菌株（Aspergillus niger—Y06）产酶因子的研究

1 材料与方法 1.1 材料

菌种，黑曲霉Y06，本项目选育保藏于河南省瑞特利生物技术有限公司。

1．2 培养基和培养方法 (1)基础培养基、查氏培养基。

(2)培养方法．按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1 000 mL三角瓶中，在0．1 Mpa压力条件下灭菌30 min

后，冷却接种，接种量为3%，于不同条件下发酵84h，干燥后，进行酶活的测定。

2、固体培养基组分对酸性蛋白酶菌株产酶的影响 (1)不同比例碳源对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

按不同比例将玉米粉添加到基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2）中，以补充碳源，于3O℃、初始pH值为6．5和含水量为38%条件下发酵，观察补充玉米粉对酸性蛋白酶活性的影响，结果见图1。由图1可以得出，酸性蛋白酶菌株产酶最大时玉米粉添加量为2.0 ，此后随着玉米淀粉添加量的增加，基质易结团而影响氧的传递，酸性蛋白酶急剧下降。

37500酸性蛋白酶活力/（U.g）-135000325003000027500250000.511.52玉米粉添加量/%2.53图1 玉米粉添加量对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

(2)不同比例氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

为了使菌株生长更好，并对菌株产酶进行诱导，在培养基中添加豆粕粉作为补充氮源，于33℃ 、初始pH值为6．5和含水量为38%条件下发酵，考察其对酶活产生的影响，结果见图2。从图2可以看出，在培养基中添加不同比例的豆粕粉，对酶活的产生都有促进作用，随着

豆粕粉含量的增加，产品的酶活力有上升的趋势，在9％时酶活力达最高值。

37500酸性蛋白酶活力/（U.g-1）35000325003000027500250000369豆粕添加量/%1215图2 豆粕添加量对酸性蛋白酶菌株产酶的影响(3)水分含量对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

对于固态发酵来说，控制培养基的水分是固态发酵过程中的重要环节之一。适宜的含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖。过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使基质膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长。含水量过高过低都对黑曲霉生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活性。本研究将黑曲霉分别接种到初始pH 值为6．5，含水量分别为3O、34、38、42、46和5O的固态发酵培养基上，在33℃下进行发酵培养试验，结果如图4。结果表明含水量38%时酸性蛋白酶菌株产酶达最高值。

37500蛋白酶活力/（U.g-1）350003250030000275002500030343842培养基含水量/%4650图3 培养基含水量对酸性蛋白酶菌株产酶的影响(4)pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

为了研究发酵培养基的pH值对酸性蛋白酶菌株产酶活性的影响，根据固体培养基难以调节pH 特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整。实验在培养基初始含水量为38%，温度为33℃条件下发酵84 h，观察发酵培养基pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5。结果见图4。

37500酸性蛋白酶活力/(U.g)-1350003250030000275002500055.56pH值6.577.5图4 pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

(5)温度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行．为寻求合适的发酵温度，本项研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为38% 、pH值为6．5的条件下培养84h，对27℃ 、30℃ 、33℃ 、37℃和40℃不同温度分别进行发酵培养，测定酶活力，证明酸性蛋白酶菌株产酶发酵最适温度为33℃，结果见图5。

37500酸性蛋白酶活力/(U.g-1)3500032500300002750025000273033温度/36C39。图5 温度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

（6）不同铵盐不同浓度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响 铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，发酵结果如图6。由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势。氯化铵的浓度对产酶基本没影响。

碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用。

40000酸性蛋白酶活力（U/mL）350003000025000200001500010000500000246铵盐浓度/%图6 不同铵盐对酸性蛋白酶产酶的影响硫酸铵氧化铵碳酸氢铵81012

（7）不同磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要。在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果。本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验。，通过改变无机磷的种类和含量，于33℃ 、初始pH值为6.5和含水量为38％条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7。添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加0．2% 的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大。

40000磷酸氢二钾磷酸氢二铵蛋白酶活力/（U.g-1）37500350003250030000275002500000.10.20.30.40.5磷酸盐的浓度图7 磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响

3、酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线

固体发酵采用基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2）、含水量38%、初始pH值为6.5、添加0．2%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33℃进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8。由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，0～24 h发酵产酶速度较缓；24～60 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72h后，进程曲线趋于平缓，84 h酶活力最高，其酸性蛋白酶活力（干基）达到36500 U／g，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72h。

37500350003250030000275002500022500200001750015000125001000075005000250000122438发酵时间/h607284酸性蛋白酶活力/（U.g）-1图8 酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线

五、酸性蛋白酶酶活力稳定性研究

黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH 较低, 与畜禽体内消化系统基本一致, 用于饲料添加剂添加饲料中, 可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足, 提高蛋白质消化率, 降低畜禽代谢性腹泻的发生。近年来, 随着饲料工业的快速发展, 酸性蛋白酶作为一种生物饲料添加剂表现出的潜能越来越被人们所关注。但酸性蛋白酶作

为饲料添加剂, 它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响, 而且还受饲料中部分金属离子的影响,而这些过程中酶活极易受损, 从而影响其作为饲料添加剂的效果。本项研究对黑曲霉菌株（Aspergillus niger ）所产酸性蛋白酶的稳定性进行了研究。

1、pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响

酸性蛋白酶在一定pH 范围内酶活力比较稳定（如图9）。当反应环境pH为3.5, 酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%, 在pH为4.0 时, 相对酶活力最高达90%, 可以确定pH为4.0时是酸性蛋白酶最适反应pH值。pH值过高或过低明显影响酶活力,在pH 为5.0时, 相对酶活力只有65%, 在pH为2.5时, 相对酶活力也只有70%。

100酸性蛋白酶相对酶活力（%）80604022.533.5pH44.55图9 不同pH对酸性蛋白酶稳定性的影响

2、温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响

酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）。一方面是当温度升高时, 酸性蛋白酶反应速率加快, 另一方面由于随着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性, 引起酶反应速率

下降。酸性蛋白酶适宜的反应温度为35～40℃, 在40℃相对酶活力表现出最高, 在低于30℃或者高于45℃时, 相对酶活力明显下降。因此认为40℃的反应温度是酸性蛋白酶最适宜的温度。

酸性蛋白酶相对酶活力（%）10090807060504020253035温度/（。C）404550图10 不同温度对酸性蛋白酶酶活力的影响

酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质, 一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活,随着温度的升高变性的时间越快, 酶失活也就越迅速。如图11所示，酸性蛋白酶在70℃时, 随着时间的延长酶活力开始下降。固体酶在烘箱中70℃保温至5min 保留有90%的相对酶活力,当时间延长至10min时, 剩余酶活有80%，30min时，剩余酶活仍有19.8%，这提示固体酸性蛋白酶有着较好的抗高温性能。

100806040200051015时间（min）202530酸性蛋白酶相对酶活力（%）图11 70。C下酸性蛋白酶的存活曲线

3、不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响

金属离子对酸性蛋白酶活力影响较大，金属离子对酸性蛋白酶的调节作用是相对的, 一种金属离子对其具有激活作用, 而另一种则可能呈现抑制作用。离子浓度对酶活性也有着不同的影响, 往往是低浓度起激活作用, 而高浓度起抑制作用。图12表明, 在5.0 mmol/L 的浓度下, Mn2+和Cu2+对本黑曲霉所产酸性蛋白酶有强烈的激活作用, 分别达到对照酶活力的150%和120%, Fe3+对该酶表现出明显的抑制作用, 处理后的酶活力为对照的58%,而Fe2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+和Mg2+对酸性蛋白酶有一定的抑制作用。

200酸性蛋白酶相对酶活力（%）16012080400Fe3+Fe2+Ag+Zn2+Mn2+CKCu2+Ca2+K+Mg2+不同金属离子图12 不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响

六、酸性蛋白酶生产工艺研究

在酸性蛋白酶的生产过程中，除了选择生产性能优良的酸性蛋白

酶高产菌株外，还必须控制好各种工艺的生产条件，并且在发酵生产过程中根据情况对各项工艺条件进行优化，以最大限度地满足菌株生长、繁殖和产酶的需要。黑曲霉（Aspergillus niger ）生产酸性蛋

白酶的工艺流程为：

原始菌株→分离纯化→紫外线诱变→选育菌株分离

纯化→亚硝基胍诱变→选育菌株分离纯化→选育菌株生产工艺优化→传代试验→选育菌株→斜面菌种→三角瓶菌种→浅盘菌种 ↓

主原料→混料（水、无机氮、无机盐）→蒸料→冷却→接种→发酵→稳定化处理→干燥→粉碎→包装→检测→成品

↓

粗酶→抽提→过滤→盐析→沉淀→干燥粉碎→包装→检测→成品

图13 酸性蛋白酶的工艺流程

七、酸性蛋白酶的质量指标

本项目研究利用黑曲霉（Aspergillus niger ）生产的酸性蛋白酶用于饲料添加剂，由于目前该类饲料添加剂没有国家标准和行业标准，根据《中华人民共和国标准化法》、《饲料和饲料添加剂管理条例》和GB 108《饲料标签》的要求，制定了酸性蛋白酶河南省瑞特利生物技术有限公司产品企业标准（Q／HRS 018-2011），其质量指标为：

表4 酸性蛋白酶的质量指标

项 目 感官 成品粒度 酸性蛋白酶活力 u/g 水分 % 砷（以总As计） mg/kg 铅（以Pb计） mg/kg 沙门氏菌数 黄曲霉毒素B1 μg /kg 大肠菌群数 个/100g 指 标 淡黄色至浅褐色粉末, 无变质、无结块、无异味、无异嗅。 全部通过2.00mm分析筛 ≥8000 ≤10.0 ≤3.0 ≤10.0 不得检出 ≤10 ≤3000

八、项目产品的创新点

1、技术创新

采用紫外线和亚硝基胍育种技术，筛选出酸性蛋白酶高产菌株--黑曲霉（Aspergillus niger ），菌株产酶的生产性能得到显著提高。

2、工艺创新

通过对黑曲霉产酸性蛋白酶生产工艺生产条件的试验研究，确定了酸性蛋白酶发酵生产的技术工艺，并对有关的技术参数进行了优化，制定了产品生产的操作规程，建立了一套国内领先的以黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶的生产技术体系。

3.应用创新

酸性蛋白酶产品通过多批次的试验研究，在饲料和畜牧养殖行业应用效果显著（详见附件一至附件七）。本产品具有降低饲料成本，防止腹泻，增强机体免疫力，促进畜禽生长，改善畜禽产品品质，促进动物对微量元素的吸收，减少养殖过程氨气排粪，减轻环境污染等功效。本产品的使用效果达到甚至超过国内外同类产品的水平。

本项目产品长期生产和应用，无污染物残留，符合绿色饲料添加剂的要求和国家大力发展生态农业和绿色食品的产业化，顺应了以非药物添加剂替代抗生素作为畜禽防病、促进生长的发展趋势，具有重大的推广应用价值，经济效益、社会效益、环保效益十分显著。 九、产品的应用研究

酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸条件下，通过内切和外切作用将动植物蛋白质水解为短肽和氨基酸，广泛用于食品、医药、

制革工业、毛皮软化和脱毛处理。近年来，由于酸性蛋白酶具有能快速有效地协助动物分解饲料中的蛋白质，以补充动物体内同源酶的不足，促进动物特别是幼龄动物对多种营养物质的吸收，促进其生长，增强机体抗病能力。随着集约化畜禽生产的发展，加剧了环境污染。其中，氮是污染环境的主要物质，因而提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低其排放就显得尤为重要。此外，由于我国蛋白质饲料资源严重缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低。因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视。

本项目在研究过程中，对畜禽的等动物养殖过程中使用酸性蛋白酶的作用和效果进行了系统研究，其主要试验结果为：

1、酸性蛋白酶对生长肥育猪生长性能的影响研究（附件一） 本项目试验结果表明，在生长猪日粮中添加微生态制剂、酸性蛋白酶、微生态制剂与酸性蛋白酶合用分别提高了生长肥育猪日增重6.5％、7.5％、14.0％，日采食量提高4.8％、5.3％、10％，料肉比分别下降1.6％、2.2％、3.68%，提高经济效益0.82％、0.6％、1.35％。

酸性蛋白酶和微生态制剂合用，具有无污染、无毒副作用等特点，能显著提高猪的日采食量、日增重、提高抗病能力、增加经济效益。其组分来源于天然，应用效果显著，具有抗生素所不具有的优点，符合绿色环保饲料的要求。

2、酸性蛋白酶对仔猪的影响研究（附件二）

酸性蛋白酶具有快速有效地协助动物分解饲料中的蛋白质，补充动物体内同源酶的不足，促进动物特别是幼龄动物对多种营养物质的吸收，促进其生长，增强机体抗病能力。本研究结果表明酸性蛋白酶在促进仔猪生长和提高仔猪饲料利用率以及预防疾病方面具有重要作用。

本试验中，开始诱食前，试验组仔猪腹泻率比对照组有高出的趋势，但自7日龄开始，含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的腹泻率有低于对照组的趋势。断奶后，酸性蛋白酶增强仔猪抗应激能力的优势更加明显，添加含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的抗病能力明显增强，腹泻发生率极显著地低于对照组（P＜0.01）。研究表明酸性蛋白酶能够改善仔猪肠道环境，减少断奶后饲料对仔猪的应激，促进仔猪的健康，提高其抗病性能，降低仔猪腹泻率。

3、酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响研究（附件三） 本项试验结果表明在蛋鸡饲料中添加0.02%的酸性蛋白酶可极显著提高蛋鸡的日产蛋率和日产蛋总量和料蛋比，该组日产蛋率比对照组高6.83%，组日产蛋重比对照组高6.8%，组日均料蛋比比对照组下降6.45%。结果表明：在日粮中添加0.02%酸性蛋白酶不能使每枚鸡蛋的平均蛋重提高，但可以使组日产蛋量的提高和组日均料蛋比的下降。

试验结果表明，在日粮中添加0.02%的酸性蛋白酶，该组的蛋黄占整个蛋的百分比，比对照组提高了3.27%，提高幅度显著；该组的

蛋壳厚度比对照组下降4.65%，且下降幅度显著；该组蛋的哈氏单位比对照组提高了2.24%，但差异不显著。

本试验结果表明，在饲料中添加0.02%的酸性蛋白酶，比对照的饲养毛利提高10.98%，显著地提高了商品蛋鸡的饲养效益，增加了养殖户的收入。在饲料中添加0.02%的低聚木糖后，虽然该组蛋鸡的产蛋率显著提高，但每日的采食量并未增加，因此酸性蛋白酶能提高蛋鸡对饲料的消化吸收率。

4、酸性蛋白酶与微生态制剂及抗生素对肉鸡肠道菌群和生产性能的影响研究（附件四）

本项目研究表明，酸性蛋白酶可有效提高畜禽生产性能。与抗生素对照组比较，在肉鸡日粮中添加酸性蛋白酶均显著提高了肉鸡空肠乳酸菌数量，而且酸性蛋白酶与抗生素及微生态制剂联用均有效的促进了空肠乳酸菌的增殖，以添加0.02%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂效果最佳，可以认为酸性蛋白酶和微生态制剂对乳酸菌的增殖有协同作用。

5、酸性蛋白酶对犊牛腹泻的影响研究（附件五）

本试验添加10g/(d.头）组在减少腹泻方面的效果不及添加5g/(d.头）组。可能是由于过量添加造成的负面影响，具体原因有待进一步研究。

6、酸性蛋白酶和微生态制剂配伍在肉兔饲料中的应用研究（附件六）

酸性蛋白酶与微生态制剂混合物进入肠道后可产生一定的协同作用。微生态制剂与酸性蛋白酶的配伍使用既可发挥益生菌的生理性细菌活性，促进肉兔饲料中蛋白质的吸收，又可选择性的增殖有益菌，从而使益生菌作用更持久。

肉兔饲料中同时添加0.02%的酸性蛋白酶和0.2%的微生态制剂，可使肉兔的生长速度、成活率、饲料报酬和经济效益得到较大提高，对肉

兔无任何毒副作用，是理想的肉兔绿色饲料添加剂。

7、酸性蛋白酶对草鱼生长性能的影响研究（附件七） 添加0.04%酸性蛋白酶组增质量比对照组显著提高。添加0.06%低聚木糖的试验鱼增质量、体长和全长增加却低于对照组（P﹥0.05）。 十、经济效益、社会效益

1、经济效益分析

（1）降低成本：酸性蛋白酶替代促生长抗生素添加在饲料中，可以直接降低添加抗生素所需要的成本；酸性蛋白酶的使用，降低料肉比、料蛋比，节省饲料或者提高出肉率、降低养殖成本；使用酸性蛋白酶，可改善了肉、蛋的品质，提高肉、蛋的附加值，直接增加养殖户的收入。

（2）改善养殖环境：饲料中添加酸性蛋白酶后，养殖动物的粪便中减少了氨、氮的排放量，同时避免了因氨、氮排放量过大导致的动物多种疾病，减少动物发病率。

（3）料肉比（料蛋比）降低：酸性蛋白酶具有能快速有效地协助动物分解饲料中的蛋白质，以补充动物体内同源酶的不足，促进动

物特别是幼龄动物对多种营养物质的吸收，促进其生长，提高饲料转化率和吸收率，可有效地降低料肉比（料蛋比）。

（4）延长蛋鸡产量高峰期：添加酸性蛋白酶饲养蛋鸡，可延长蛋鸡产蛋高峰，一般情况下可延长1—3个月左右，从而给养殖户带来了巨大的经济效益。

（5）由于我国蛋白质饲料资源严重缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低。因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视。

2、社会效益分析

酸性蛋白酶替代促生长抗生素在饲料中应用，可以改善抗生素等物质在肉蛋中的残留，真正实现了无药物残留、无致癌物残留、无污染残留的绿色肉制品、蛋制品的生产，为人类健康做出了巨大贡献。

3、应用前景

酸性蛋白酶是一种性能优越的功能性饲料添加剂，饲料中添加酸性蛋白酶能促进动物的生长，特别是对幼龄动物的作用非常明显。2010年，我国饲料总产量已达1.4亿吨以上，已成为世界第二大饲料生产国。国外饲料工业和畜牧养殖业对我国饲料工业和畜牧业的发展提出了新的要求和挑战，我国已把无公害及无药物残留的绿色饲料添加剂取代当前大量使用的促生长类抗生素和激素类饲料添加剂作为饲料工业发展的必由之路。

酸性蛋白酶产品长期生产和应用，无污染、无残留，符合绿色饲

料添加剂的要求和国家大力发展生态农业和绿色食品的产业化，顺应了以非药物添加剂替代抗生素作为畜禽防病、促生长的发展趋势，具有重大的推广应用价值，经济效益、社会效益、环保效益十分显著，必将促进我国饲料工业和畜牧养殖业健康快速的发展。 十一、存在的问题及建议

饲料中添加酸性蛋白酶能促进动物的生长，特别是对幼龄动物的作用非常明显，作为一种新型的绿色饲料添加剂，酸性蛋白酶有着广阔的应用前景。但目前酸性蛋白酶的使用上还存在很多问题，产品的作用机理尚未完全研究清楚，各研究报道的结果存在较大差异，产品的稳定性和使用效果尚待继续研究。因此我们建议酸性蛋白酶在未来动物营养学研究发展方向应是：

1、目前作为饲料添加剂使用的酸性蛋白酶一般是添加于粉料中而不能添加于颗粒料中，这主要是由于其耐热性能不好而影响了其应用范围，下一步应深入研究酸性蛋白酶产品的包埋技术，提高产品本身耐热稳定性。

2、目前使用的酸性蛋白酶生产菌株产酶水平都普遍较低，产品的生产成本过高影响产品的竞争力。利用分子生学技术来构建高水平表达耐高温酸性蛋白酶的基因工程菌，可能为上述问题的解决提供光明前景。

3、对酸性蛋白酶影响动物营养物质代谢的确切机制作进一步研究，进行大规模应用试验，以确定酸性蛋白酶产品在不同动物饲料中的适宜添加剂量，为饲料工业中科学合理使用酸性蛋白酶提供依据。

尽管酸性蛋白酶的应用在目前还存在着各种问题，但相信随着科学技术的不断发展，这些问题都会得到彻底解决。无论如何，酸性蛋白酶的本质特性和应用效果决定了其发展和应用的前景十分广阔。

附件一

酸性蛋白酶对生长肥育猪生长性能的影响研究

1．材料和方法

1.1 酸性蛋白酶：河南省瑞特利生物技术有限公司提供。产品酸性蛋白酶酶活力8000u∕g。

1.2 微生态制剂：河南省瑞特利生物技术有限公司提供，主要成分是枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母菌。

1.3 试验动物及试验设计：选体重、生长日龄相近的长大杜生长猪72头，随机分为4个处理组，每组18头。1组为对照组，饲喂日粮为基础日粮；2组为基础日粮中添加0.15％的微生态制剂；3组为基础日粮中添加0.02％酸性蛋白酶；4组为基础日粮中添加0.02％酸性蛋白酶和0.15％的微生态制剂。

1.4 试验日粮及饲养管理试验：日粮配方见表1。预试期5天。预试期内分别饲喂含4种不同的日粮。自由采食，自由饮水，常规免疫，在试验中观察猪的采食及健康情况，每天以组为单位记录采食量、健康情况；正试期期初、期末分别对猪只称重，每次称重均在早晨饲喂前空腹进行。计算平均日增重、饲料转化率、饲料成本，并对计算结果进行统计分析。

1.5 试验地点：武陟县城关镇尚武养殖场。

1.6 试验时间：试验期从2010年9月16日至10月30日。共45天，其中预试期5天，正试期40天。

表1 试验猪日粮配方及营养水平（％）

日粮组成 玉 米 浓缩饲料 米 糠 麸 皮 微生态制剂 酸性蛋白酶 合 计 粗蛋白质（%） 钙（%） 有效磷（%） 赖氨酸（%） 饲料成本（元/吨） 1组 50.0 20.0 18.0 12.0 0.0 0.0 100.0 15.5 0.60 0.30 0.80 1768.8 2组 50.0 20.0 18.0 11.85 0.15 0.0 100.0 15.5 0.60 0.30 0.80 1780.8 3组 50.0 20.0 18.0 11.98 0.0 0.02 100.0 15.5 0.60 0.30 0.80 1769.8 4组 50.0 20.0 18.0 11.83 0.15 0.02 100.0 15.5 0.60 0.30 0.80 1808.8 2. 试验结果分析

2.1饲养试验结果 2.1.1 对平均日增重的影响

经过40天的饲养试验，各组平均日增重见表2

表2 试验各组平均日增重 （单位：千克/头、克/头-日、％）

组别 头数 1组 2组 3组 4组 18 18 18 18 天数 40 40 40 40 平均始重 76.6±0.54 75.5±0.68 76.2±0.62 平均末重 105.5±1.59 105.8±1.82 106.8±1.43 平均日增重 750.7±27.1 799.3±22.2 802.3±29.3 855.9±28.7 相对比较 100.0 106.5 107.5 114.0 76.0±0.51 108.45±1.39 试验结果表明：在生长猪的日粮中添加微生态制剂、酸性蛋白酶

能有效地提高生长猪的平均日增重，较对照组分别提高6.5％，7.5％。酸性蛋白酶与微生态制剂合用的4组极显著提高了生长猪的平均日增重，较对照组平均日增重提高14％。

2.1.2 对采食量及饲料转化率的影响

经过40天的饲养试验，试验各组采食量及饲料转化率如表3

表3 试验全期采食量及饲料转化率（单位：千克/头、克/头-日、％） 组别 1组 2组 3组 4组 头数 18 18 18 18 天数 40 40 40 40 总耗料量 1660 1740 1748 1826 日采食重 2565 2688 2700 2821 料肉比 3.41 3.35 3.33 3.28 料肉比比较 100.0 98.4 97.8 96.4 试验结果表明，三个试验组都显著提高了生长肥育猪的平均采食量，微生态制剂组、酸性蛋白酶组、微生态制剂与酸性蛋白酶合用组较对照组分别提高采食量4.82%，5.3%,10%.分别降低料肉比1.6%,2.2%,3.6%.

2.1.3 猪的发病率及健康状况

试验过程中，无死亡，无腹泻，猪仔有发热现象，各组的发病率情况见表4。

表4 试验各组的发病率（单位：％）

组别 1组 2组 3组 4组 头数 18 18 18 18 天数 40 40 40 40 饲养头数 720 720 720 720 发病头次数 发病率 发病率比较 16 8 6 0 2.22 1.11 0.83 0 100.0 50.0 37.4 0 发病率（％）＝累计发病头日数/累计饲养头日数×100

试验结果表明，微生态制剂组、酸性蛋白酶组均能有效降低猪的发病率，酸性蛋白酶与微生态制剂合用组能明显提高猪仔的抗病力。

2.2 经济分析

表5 试验各组猪的经济效益分析 （单位：元/千克、％）

组别 1组 2组 3组 4组 头数 18 18 18 18 天数 40 40 40 40 饲料成本 1.7688 1.7808 1.7968 1.8088 增值成本 6.032 5.983 6.000 5.951 增重成本比较 100.00 99.18 99.40 98.65 试验结果表明，在生长猪的日粮中添加微生态制剂组、酸性蛋白酶组、微生态制剂与酸性蛋白酶合用组较对照组均降低了猪的增重成本，分别提高经济效益0.82％、0.6％、1.35%。 3．讨论与分析

本次试验结果表明，在生长猪日粮中添加微生态制剂、酸性蛋白酶、微生态制剂与酸性蛋白酶合用分别提高了生长肥育猪日增重6.5％、7.5％、14.0％，日采食量提高4.8％、5.3％、10％，料肉比分别下降1.6％、2.2％、3.68%，提高经济效益0.82％、0.6％、1.35％。本次试验只计算了饲料成本与增重的关系。 4．结论

酸性蛋白酶和微生态制剂合用，具有无污染、无毒副作用等特点，能显著提高猪的日采食量、日增重，提高抗病能力，增加经济效益。其组分来源于天然，应用效果显著，具有抗生素所不具有的特点，符合绿色环保饲料的要求。随着人们对绿色、安全和环保意识的增强，它产生的社会效益将得到更多有识之士的认可，应用前景更加广阔。

附件二

酸性蛋白酶对仔猪的影响研究

本试验旨在研究添加酸性蛋白酶对仔猪的增重、料肉比和腹泻率的影响研究。 1 材料和方法

1.1 试验动物

本试验于2011年4月9日—2011年5月29日在河南省正阳种猪场吕河分场进行，试验期为35天。试验仔猪由正阳种猪场提供的杜长大仔猪，选取20窝杜长大仔猪，随机分为2组，每组10窝，7日龄饲喂开食料，21日龄断奶，仔猪料为常规饲料（含抗生素），由本场自配。试验组添加0.02%的酸性蛋白酶。试验猪采取高床饲养，进行有关资料的记录与收集，包括：初生重，7日龄、21日龄、35日龄窝重，仔猪腹泻头数，饲料量等。

1.2 样品来源

试验用酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供，酶活力8000u∕g。

1.3 数据处理与统计分析

应用Excel对实验数据进行预处理，再用SPSS进行单因素方差分析，并用LSD进行多重比较。 2 结果与分析

2.1酸性蛋白酶对仔猪增重的影响

从试验开始到试验结束，试验组仔猪的初生重、7日龄、21日龄、35日龄平均体重与对照组比较，均无显著性差异（P＞0.05），就其各试验时间段平均日增重比较，添加酸性蛋白酶组仔猪在断奶前采食量少而导致日增重有低于对照组的趋势（243.60±21.83对248.00±42.46，P＞0.05）。断奶后经过断奶、免疫、去势的应激，添加酸性蛋白酶组的试验猪表现出高于对照组的趋势（试验组146.85±35.07，对照组142.17±46.80，P＞0.05）。

表1 酸性蛋白酶对仔猪生长性能的影响研究

项 目 带 仔 头 数 初 生 重（㎏） 7 日 龄 重（㎏） 21日 龄 重（㎏） 35 日 龄重（㎏） 0-7 日增重（g） 8-21日增重（g） 8-35日增重（g） 8-35日增重（g） 0-35日增重（g）

对照组 11.65±1.03 1.26±0.17 2.35±0.31 5.90±0.71 7.82±0.61 139.83±42.46 248.00±45.25 142.17±46.80 196.08±22.35 185.85±21.30 试验组 10.78±1.63 1.40±0.61 2.41±0.31 5.97±0.54 7.96±0.77 140.49±27.36 243.60±21.83 146.85±35.07 196.27±21. 186.14±20.21 2.2 酸性蛋白酶对仔猪料重比的影响

由表2所示：添加酸性蛋白酶组与对照组增重差异不明显，但添加酸性蛋白酶处理组8-21日龄采食量比对照组减少了35.29%（P＜0.05），8-35日龄饲料采食量比对照组减少了20.53%（P＜0.05）。饲喂酸性蛋白酶处理组8-21日龄饲料效率比对照组减少了34.62%（P

＜0.05），8-35日龄饲料采食量比对照组减少了20.32%（P＜0.05）可见酸性蛋白酶具有明显的提高仔猪饲料利用率的优势，这对于养猪行业具有直接的经济效益。

表2 酸性蛋白酶对仔猪饲料利用率的研究

组别 Wg8-21 wg22-35 Wg8-35 Fi8-21 fi22-35 Fi8-35 Fcr8-21 fcr22-35 Fcr8-35 对照组 246.00 144.18 195.09 255 a205.77 455.67 1.04 202.09 362.09 0.68 bbaa1.38 1.31 -5.07 1.23 0.98 -20.32 ba酸性蛋白酶组 241.61 148.96 195.28 165 3.32 b差异％ -1.78 0.10 -35.29 -1.78 -20.53 -34.62 注：a,b同列比较，上标无字母相同者示差异显著（P＜0.05）

2.3 酸性蛋白酶对仔猪腹泻的影响

试验猪腹泻发生情况见表3。0天到7天，试验组仔猪的总腹泻率比对照组高1.43个百分点（高22.88％，P＞0.05）；7日龄至21日龄断奶期间，酸性蛋白酶组腹泻比对照组低0.45个百分点（低26.66%, P＞0.05）；断奶以后2周内，试验组仔猪的腹泻率更是比对照组低了0.82个百分点（低57.75%,P＜0.01）。可见，酸性蛋白酶具有明显的提高仔猪的抗病性能的作用。

表3 酸性蛋白酶对仔猪腹泻的影响的研究

组别 对照组 0-7天 6.25 7.68 1.43 22.88 8-21天 1.69 1.24 -0.45 -26.66 22-35天 1.42A 0.60B -0.82 -57.74 0-21天 4.25 4.44 0.19 4.48 0-35天 3.18 2.95 -0.23 -7.23 酸性蛋白酶组 差异 ％ 注：A,B同列比较，上标无字母相同者示差异显著（P＜0.01）。

3 结果讨论

本试验中，开始诱食前，试验组仔猪腹泻率比对照组有高出的趋势，但自7日龄开始，含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的腹泻率有低于对照组的趋势。断奶后，酸性蛋白酶增强仔猪抗应激能力的优势更加明显，添加含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的抗病能力明显增强，腹泻发生率极显著地低于对照组（P＜0.01）。研究表明饲料中添加酸性蛋白酶能促进仔猪的生长，作用非常明显。同时可减少断奶后饲料对仔猪的应激，促进仔猪的健康，提高其抗病性能，降低仔猪腹泻率。

附件三

酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响研究

1 材料与方法

1.1 试验材料

本次试验的酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供。试验鸡种为新罗曼鸡。

1.2 试验时间和地点

试验在河南省武陟县蛋鸡场进行，预试开始时鸡龄在11个月；试验时间为2010年9月19日至2010年11月27日，其中头11天为预试期，后60天为正试期。

1.3 试验设计

将1200只商品蛋鸡，随机分为6组，每组设4个重复，每个重复50羽；其中第一组为空白对照组、第二组为添加0.01%酸性蛋白酶组、第三组为添加0.015%酸性蛋白酶组、第四组为添加0.02%酸性蛋白酶组、第五组为添加0.025%酸性蛋白酶组、第六组为添加0.03%酸性蛋白酶组。

1.4 试验基础日粮配方

蛋鸡常规饲料配方为：玉米（62%）、豆粕（25%）、贝壳（8%）、预混料（5%）。预混料中除微量元素、维生素外，还添加了占大料中1%的鱼粉，并添加了蛋氨酸。

1.5 试验蛋鸡的饲养管理

本次试验中鸡只自由采食、饮水，光照时间为16小时。每只蛋鸡日平均饲喂料两次，第一次在上午8点，饲喂量为全天所需饲喂量的60%，第二次在下午4点，饲喂量为全天所需饲喂量的40%。饲养方式为三层阶梯式笼养，每笼3只鸡。 1.6 预试期鸡群调整方法 在预试期开始时，将鸡舍内各笼内的蛋鸡数均调整为每笼3只，然后按笼为单位每天记录各笼的产蛋数。记录11天后按各重复小组统计产蛋数，并根据统计结果进行适当调整，即将产蛋数高的小组内的鸡，按笼为单位调整到产蛋数较低的组内，以使各小组在正式试验开始时的产蛋数基本相等。 1.7 测定指标 试验期间每天下午3点分笼记录产蛋数、分重复组称测产蛋重，并记录每天的耗料量；并在试验结束时，选取试验效果明显的组及对照组作为蛋品质量测定组，每个重复组选取10枚蛋，进行常规蛋品指标测定。 1.8 统计分析方法 将试验原始记录资料输入到SPSS统计软件中，通过统计软件进行数据处理，多重比较采用LSD。 表1 酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响 项 目 空白对照 产蛋率（%） 产蛋总重/日 蛋重/枚（g） 84.00eCD±5.86 2.50dD±0.17 66.15bB±1.56 料蛋比 2.17dD±0.16 2.08bB±0.14 2.03aA±0.12 0.01%酸性蛋白酶 86.59eB±5.19 2.61bB±0.20 66.90aA±3.96 0.015%酸性蛋白酶 .74aA±4.83 2.67aA±0.15 66.19bB±1.48

0.02%酸性蛋白酶 88.60bA±5.21 2.aAB±0.16 66.40bB±1.46 0.025%酸性蛋白酶 85.23dC±5.52 2.54cC±0.16 66.27bB±1.71 0.03%酸性蛋白酶 83.90eD±5.94 2.46eD±0.17 65.35eC±1.51 2.05AB±0.12 2.13cC±0.14 2.21eE±0.16 注：以上同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著（P<0.05），大写字母表示差异极显著（P<0.01），下同。 2 结果与分析 2.1酸性蛋白酶对蛋鸡产蛋率的影响 经对各试验组间进行统计分析，试验各组在整个试验期的产蛋率分别为：84.00%、86.59%、.74%、88.60%、85.23%、和83.90%。显著性分析检验表明，0.015%酸性蛋白酶组和0.02%酸性蛋白酶组的产蛋率均极显著高于其它各组（P<0.01）；0.01%酸性蛋白酶组的产蛋率极显著高于空白对照组（P<0.01）；0.025%酸性蛋白酶组的产蛋率显著高于空白对照组（P<0.05）。其中以0.015%酸性蛋白酶组的产蛋率为最高（表1）。 2.2 酸性蛋白酶对蛋鸡产蛋重的影响 由表1可见，0.015%酸性蛋白酶组和0.02%酸性蛋白酶组的每日平均产蛋总重均极显著高于其它各组的产蛋总重（P<0.01）；0.01%酸性蛋白酶组和0.025%酸性蛋白酶组的每日平均产蛋总重均显著高于对照组和0.03%酸性蛋白酶组（P<0.01）；对照组产蛋总重显著高于0.03%酸性蛋白酶组（P<0.05）。其中以0.015%酸性蛋白酶组每天平均产蛋重为最高。 2.3 酸性蛋白酶对蛋鸡平均蛋重的影响 由表1可见，0.01%酸性蛋白酶组的平均蛋重极显著高于其它各组

的平均蛋重（P<0.01）；0.03%酸性蛋白酶组的平均蛋重极显著低于其它各组的平均蛋重（P<0.01）。 2.4 酸性蛋白酶对蛋鸡料蛋比的影响 由表1 可见，0.01%酸性蛋白酶组、0.015%酸性蛋白酶组和0.02%酸性蛋白酶组的料蛋比极显著低于空白对照组、0.025%酸性蛋白酶组和0.03%酸性蛋白酶的料蛋比（P<0.01）；0.015%酸性蛋白酶组的料蛋比极显著低于0.01%酸性蛋白酶组的料蛋比；各组间以0.015%酸性蛋白酶的料蛋比为最低。 2.5 各组蛋品质分析结果 在试验结束前，选取试验效果比较显著的0.015%酸性蛋白酶和0.02%酸性蛋白酶组的蛋与对照组的蛋进行蛋品质量比较分析，结果表明：在蛋壳强度、蛋黄比色、蛋壳百分率、哈氏单位等指标上，0.015%和0.02%酸性蛋白酶组和空白对照组之间没有显著差异（P>0.05）；在蛋形指数（长径比横径）上，0.015%酸性蛋白酶组显著高于0.02%酸性蛋白酶组（P<0.05），但二组与空白对照组间没有显著差异（P>0.05）；在蛋壳厚度上，空白对照组极显著高于两个试验组的蛋壳厚度（P<0.01）；在蛋黄百分率上，0.015%酸性蛋白酶组显著高于对照组（P<0.05）（见表2）。 表2 酸性蛋白酶对鸡蛋常规品质的影响 项目 蛋形指蛋壳强度 蛋壳厚度 蛋壳百分率蛋黄比色 2数 （㎏/㎝） （㎜） （%） abAa蛋黄百分率（%） 哈氏单位 a1.31±13.41±空白对照 0.045 3.06 0.015% 1.32±14.53±酸性蛋白酶 0.036 2.79 0.02% 1.30±13.90±酸性蛋白酶 0.032 2.80 bAaaAa0.43±0.03 0.41±0.03 0.40±0.02 bBbBaA9.10±75.45±abA12.40±0.91 25.06±1.78 0.79 6.95 9.36±75.14±aaA12.22±0.01 25.88±1.47 0.79 7.78 9.16±25.16±a12.40±0.61 0.68 1.72 aabAaaa75.06±12.02 a

2.6 酸性蛋白酶对蛋鸡饲养效益的影响 2.6.1 计算依据： 各试验组鸡数200只，平均日投放饲料0.120kg/只，本次试验期共进行了60天。以本次试验期60天计算毛利。鸡蛋8.00元/kg，饲料2.40元/kg，酸性蛋白酶按12元/kg计。 2.6.2 计算公式 计算时按试验期内各组实际产蛋重、饲料消耗量和酸性蛋白酶添加量，按下列公式计算毛利润（即包括劳动力工资在内的纯收入）： 毛利润（元）蛋重×8.00－饲料×2.40－酸性蛋白酶费用 2.6.3 试验期各组鸡的毛利润分析 现以在日粮中添加0.015%和0.02%酸性蛋白酶的结果进行各组鸡的毛利润分析，根据试验数据对三组的毛利润进行了分析。结果表明：在饲料中添加0.015%和0.02%的酸性蛋白酶可分别比对照组提高10.98%和8.92%饲养毛利。如采用在饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶，则每只蛋鸡每月可多获毛利0.17元，一个年养1000只蛋鸡的农户，如果将蛋鸡饲养10个月淘汰，则每年仅此一项就可多获毛利1770元，经济和社会效益十分可观（见表3）。 表3 试验期各组获毛利分析 项 目 总蛋重（㎏） 蛋收入（元） 饲料重（㎏） 饲料费（元） 空白对照组 157.39 1101.73 340.2 476.28 0.015%酸性蛋白酶组 168.08 1176.56 340.2 476.28 0.02%酸性蛋白酶组 166.53 1165.71 340.2 476.28

酸性蛋白酶用量（克） 酸性蛋白酶费用（元） 毛利（元） 比对照组增毛利（元） 0 0 625.45 - 51 0.61 694.16 +68.71 68 0.82 681.27 +55.82 3 结论与讨论

3.1 添加0.015%的酸性蛋白酶能促进蛋鸡生产性能的提高 试验结果表明在蛋鸡饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶可极显著提高蛋鸡的日产蛋率和日产蛋总量和料蛋比，该组日产蛋率比对照组高6.83%，组日产蛋重比对照组高6.8%，组日均料蛋比比对照组下降6.45%。结果表明：在日粮中添加0.015%酸性蛋白酶不能使每枚鸡蛋的平均蛋重提高，但可以使组日产蛋量的提高和组日均料蛋比的下降。

3.2 添加酸性蛋白酶不会降低蛋的品质

试验结果表明，在日粮中添加0.015%的酸性蛋白酶，该组的蛋黄占整个蛋的百分比，比对照组提高了3.27%，提高幅度显著；该组的蛋壳厚度比对照组下降4.65%，且下降幅度显著；该组蛋的哈氏单位比对照组提高了2.24%，但差异不显著，其他常规指标间没有显著差异。

3.3 在饲料中添加酸性蛋白酶能提高蛋鸡的饲养效益

本试验结果表明，在饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶，比对照的饲养毛利提高10.98%，显著地提高了商品蛋鸡的饲养效益，增加了养殖户的收入。在饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶后，虽然该组蛋鸡的产蛋率显著提高，但每日的采食量并未增加，酸性蛋白酶能提高蛋鸡对饲料的吸收率。

附件四

酸性蛋白酶与微生态制剂及抗生素对 肉鸡肠道菌群和生产性能的影响研究

肠道微生物对肠组织的形态、代谢和功能有极大影响。建立良好的肠道微生物区系，充分发挥消化机能，有助于提高动物生产性能及饲料料转化率。饲料中添加抗生素、微生态制剂、酸性蛋白酶均能影响动物肠道微生物群落的组成。抗生素通过非选择性抑菌或杀菌，消除肠道有害微生物对动物生长的抑制作用。微生态制剂通过补充有益微生物，利用有益菌菌群优势竞争性抑制有害菌的增殖。酸性蛋白酶有助于提高动物生产性能及饲料料转化率。近年来，鉴于抗生素大量使用导致肠道菌群失衡、药物残留、耐药性及其传递和转移等负效应，微生态制剂、酸性蛋白酶或者两者配伍使用替代抗生素的研究和应用成为饲料添加剂热点之一。 1 材料与方法

1.1试验时间和地点

试验2010年11月19日至2010年12月31日在武陟县肉鸡场进行。

1.2 试验动物与实验设计

选取1日龄健康AA肉鸡1200羽，随机分成6组，每组8个重复，每个重复25羽，分别饲喂在基础日粮中添加抗生素（杆菌肽锌16.7mg.㎏和硫酸粘杆菌3.3mg.㎏，对照组）、0.02%酸性蛋白酶、0.005%酸

性蛋白酶＋0.005%微生态制剂、0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂、0.005%酸性蛋白酶＋抗生素（同对照组）和0.01%酸性蛋白酶＋抗生素（同对照组）。

微生态制剂由河南省瑞特利生物技术有限公司提供，主要含嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供。

1.3 试验日粮及饲料管理

基础日粮配方及养分含量如表1。试验鸡采用层叠笼饲养，自由饮水，自由采食，24小时连续光照，并按常规程序进行严格免疫。

表1 试验基础日粮配方及养分含量

原料（%） 玉米 豆粕 5%预混料 营养水平（%） ME（Mcal/kg） Cp Ca Ap Lys Met＋Cys 0—21d 62 33 5 / 12.12 21 0.9 0.48 0.98 0.77 22—42d 68 27 5 / 12.54 19 0.85 0.43 0.88 0.67 注：5%预混料含氨基酸、微量元素和维生素等。

1.4 测定指标与方法 1.4.1生产性能测定

试验鸡于21龄和42龄晨分别进行空腹称重；记录每天耗料量、鸡只死亡数；计算增重、饲料转化率和死亡率。

1.4.2空肠菌群数 1.4.2.1采样

42日龄晨9.00从各处理中随机选取6只试验鸡屠宰后立即解剖，取出并结扎空肠，用酒精棉球消毒各结扎口，然后放入消毒容器内。测定乳酸杆菌的样品厌氧采样。

1.4.2.2 内容物稀释

空肠内容物运回试验室，立即于无菌操作台中取0.5g内容物于无菌试管内，加入无菌的稀释液4.5ml，用磁力振荡器振荡3～5min（250r/mm），进行10-1稀释，在1000r/min下离心，吸取上清液0.5ml加入盛有4.5ml无菌稀释液的第二根试管中进行10-2稀释，并依次进行10-3—10-6倍稀释。

1.4.2.3接种和培养

大肠杆菌：将空肠内容物稀释液各10μl接种于麦康凯No.3培养平皿上（各稀释度设设3个重复），37˚C有氧培养24h后进行菌落计数。

乳酸杆菌：将空肠内容物10-3-10-6稀释液10ml接种子乳酸杆菌选择性培养平皿上（各稀释度设3个重复），37℃厌氧培养48h后进行菌落计数。

细菌数量采样平板菌落计数进行统计，最后用每克肠道内容物中细菌个数的对数lg（CFU）表示。

1.5 统计分析

试验数据采用SPSS11.0统计软件中One-Way ANOVA分析，并进行Duncan法进行多重比较，数据以平均数±标准误差表示。 2 结果与分析

2.1酸性蛋白酶与抗生素及益生素对肉鸡生长性能的影响 各组试验鸡的体增重、饲料转化率及死亡率如表2、3.与抗生素对照组相比，个试验组前期、后期和全期的体增重分别提高了0.8%—15.1%、2.9%—29.0%、和2.2%—4.0%，添加0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂0.005酸性蛋白酶＋抗生素和0.01%酸性蛋白酶＋抗生素均极显著提高了试验鸡前期、后期和全期的体增重（p<0.01）,添加0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂显著提高试验鸡全期增重（p<0.05）,tianj 0.02%酸性蛋白酶组试验鸡体增重改善不显著（p>0.05），酸性蛋白酶＋微生态制剂或抗生素组试验鸡全期增重提高程度分别是0.02%酸性蛋白酶组的3—7倍和5—11倍，与酸性蛋白酶＋微生态制剂组相比，添加0.005%酸性蛋白酶＋抗生素显著地提高了试验鸡全期的体增重（p<0.01）。各试验组肉鸡后期和全期的饲料转化率分别降低了25%、43%、10.4%、6.9%12.5%和1.0%、3.3%、6.2%、7.1%、6.2%，各试验组肉鸡死亡率高低不一，提示添加抗生素对提高试验成活率的作用效果较好。综合各指标以添加0.005%酸性蛋白酶＋抗生素的效果为最佳。

2.2酸性蛋白酶与抗生素、微生态制剂与肉鸡空肠菌群的影响

表2 酸性蛋白酶与抗生素、微生态制剂对肉鸡体增重的影响

0-21日 改善程度（%） ＋0 ＋0.8 ＋3.2 ＋10.4 22-42日 体增重（g） 11±38aA 1224±44aA 1290±36abAB 1406±38dBC 1534±22ec 1390±29bcB 0-42日 组别 体增重（g） 1 2 3 4 5 6 598±7aA 603±10aA 617±6aA 660±8bB 改善程度（%） 体增重（g） 改善程度（%） ＋0 ＋2.9 ＋8.5 ＋18.3 ＋29 ＋16.9 1787±38aA ＋0 1826±48abA ＋2.2 1907±39bA 2066±40cB 2215±16dC ＋6.7 ＋15.6 ＋24 681±11bcB ＋13.9 688±8cB ＋15.1 2078±32cBC ＋16.3

注：同一列小写字母不同者表示差异显著（p<0.05）,大写字母表示差异显著（p<0.01）

表3 酸性蛋白酶与抗生素、微生态制剂对肉鸡饲料转化率、死亡率的影响

1 2 3 4 5 6 0-21日 1.47 1.53 1.58 1.39 1.58 1.42 1.00 1.00 0.50 0.50 1.00 1.00 22-42日 2.79 2.72 2.67 2.50 2.32 2.11 6.57 9.60 6.53 7.54 4.55 6.06 0-42日 2.10 2.08 2.03 1.97 1.95 1.97 7.50 10.50 7.00 8.00 5.50 7.00 组别 饲料转化率 死亡率（%） 饲料转化率 死亡率（%） 饲料转化率 死亡率（%）

表4 酸性蛋白酶与抗生素、微生态制剂对肉鸡空肠菌群的影响

组别 1.抗生素（对照组） 2.0.02%酸性蛋白酶 3.0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂 大肠杆菌 3.366±0.403aA 乳酸菌 5.671±0.226aA 4.98±0.365bB 4.696±0.292bAB 4.588±0.562bAB 3.251±0.234aAB 4.024±0.377abAB 6.799±0.421bA 6.191±0.115abA 4.0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂 6.817±0.231bA 5.0.005%酸性蛋白酶＋抗生素 6.4±0.310ahA 6.0.01%酸性蛋白酶＋抗生素 6.621±0.219bA 注：肠道菌群数量用lgCFU/g肠道内容物表示，同一列小写字母不同者表示差异显著（p<0.05）,大写字母表示差异极显著（p<0.01）。 由表4可见，添加0.02%酸性蛋白酶、0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂、0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂组试验鸡空肠大肠杆菌数量较对照组高（P<0.05），抗生素更有效的抑制了空肠大肠

杆菌的增殖，添加0.005%酸性蛋白酶＋抗生素组试验鸡大肠杆菌数量显著低于0.02%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂组（P<0.05）和0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂（P<0.05），也低于抗生素组，但差异不显著，提示酸性蛋白酶与抗生素联用有协同抑菌作用，与对照组比，各试验组肉鸡空肠乳酸菌数量分别增加19.%（P<0.05）、9.17%、20.21%（P<0.05）、13.98%（P<0.05）和16.75%（P<0.05），各试验组之间乳酸菌数量差异不显著（P<0.05）。 3. 讨论

本试验证实，与抗生素对照组比较，在肉鸡日粮中添加酸性蛋白酶显著提高了肉鸡空肠乳酸菌数量，而且酸性蛋白酶与抗生素及微生态制剂联用均有效的促进了空肠乳酸菌的增殖，以添加0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂效果最佳，可以认为酸性蛋白酶和微生态制剂对乳酸菌的增殖有协同作用，而抗生素对乳酸菌的抑制作用部分为酸性蛋白酶促进作用所缓解或中和，但双倍剂量添加酸性蛋白酶对抗生素的缓解作用没有累加效果。

本试验在抑制空肠大肠杆菌增殖上，微生态制剂和酸性蛋白酶的抑菌效果优于酸性蛋白酶，但酸性蛋白酶及微生态制剂和酸性蛋白酶略差于抗生素，0.005%酸性蛋白酶与抗生素联用具有更强抑制大肠杆菌增殖的趋势。

本试验结果中，添加酸性蛋白酶各组均不同程度的改善了肉鸡的体增重，饲料转化率的改善程度优于单一高剂量添加酸性蛋白酶，以酸性蛋白酶与抗生素联用的协同效应为最佳。关于酸性蛋白酶与抗生素及微生态制剂联用，以最大限度的替代抗生素或降低抗生素用量的最佳添加量组合的研究尚待进一步试验。

附件五

酸性蛋白酶对犊牛腹泻的影响研究

一、材料和方法 1、试验材料

酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供。 2、试验动物与试验设计

试验于2011年5月—9月在郑州市示范奶牛场进行。选择7日龄左右的母犊牛30头，分为3组，每组10头。要求胎次、体重相近或相同，遗传组成基本相似，健康状况良好。其中对照组不添加任何添加剂；试验组分别添加5、10g/（g.头）的酸性蛋白酶。三组犊牛的初始体重差异均不显著（P﹥0.05）。60日龄断奶。每组采食相同的精料补充料（开食料）和粗料，自由采食，自由饮水，试验期42d。开食料日粮组成、营业水平见表1，试验设计见表2。

表1 开食料日粮组成及营养水平

日 粮 玉米 豆粕 小麦麸 DDG 磷酸氢钙 食盐 糖蜜 预混料 合 计

含量（%） 42 19 15 16 1.5 0.5 5 1 100 营养水平 粗蛋白（%） 粗脂肪（%） 粗纤维（%） 钙（%） 总磷（%） 含量（%） 19.5 5.4 8.25 0.96 0.

表2 试验设计方案

组 别 对照组 试验5g(d.头）组 试验10g(d.头）组 饲粮组成 牛奶＋开食料 牛奶＋开食料＋5g/(d.头）的酸性蛋白酶 牛奶＋开食料＋10g/(d.头）的酸性蛋白酶 3、饲养管理

本研究试验各组均是在光照通风等环境和饲养管理条件一致的情况下进行的。

饲喂方法：于饲喂前将酸性蛋白酶拌于饲料中，分早、中、晚3次均匀饲喂。从7日龄起在犊牛栏的草架上放置优质干草，任犊牛自由咀嚼，练习采食。第10日龄开始训练犊牛吃开食料，精料磨成细粉，涂擦与犊牛口鼻，教其舔食。7日龄后，在水中加入少量牛奶，诱其自由饮用。 4、测定指标和方法

4.1 腹泻指数

试验开始后，每日观察犊牛排粪情况，记录腹泻个体和持续时间，最后以每组犊牛发生腹泻的头日数除以总饲养头日数计算出腹泻指数。

腹泻指数=5、数据处理

试验数据利用SAS8.1进行两因素方差分析和Duncan`s多重比较。

二、结果与分析

腹泻头日数×100% 4210

酸性蛋白酶对犊牛腹泻指数的影响（见表3）

表3 酸性蛋白酶对犊牛腹泻指数的影响

项 目 对照组 5g/(d.头）组 10g/(d.头）组 样本数 10 10 10 腹泻指数（%） 4.2 0.8 2.1 由表3可知，对照组犊牛腹泻指数高于5g/(d.头）组合和10g/(d.头）组，10g/(d.头）组的腹泻指数高于5g/(d.头）组。 三、讨论

本试验添加10g/(d.头）组在减少腹泻方面的效果不及添加5g/(d.头）组。可能是由于过量添加造成的负面影响，具体原因有待进一步研究。

附件六

酸性蛋白酶和微生态制剂配伍在肉兔饲料中的应用研究

本项试验研究酸性蛋白酶和微生态制剂联合使用对肉兔生产性能的影响，探讨其协同效应，为合理应用酸性蛋白酶和微生态制剂提供参考依据。 1 材料与方法

1.1试验兔的选择

选600只伊普吕配套系42日龄健康幼兔，随即分为4组，即对照组、试验1组、试验2组和试验3组，每组平均150只兔。

1.2 方法

对照组喂基础日粮，试验1组在基础日粮中添加0.2%的微生态制剂和0.02%酸性蛋白酶，试验2组在基础日粮中添加0.02%酸性蛋白酶，试验3组在基础日粮中添加0.2%的微生态制剂。基础日粮组成与营养水平见表1。

表1 基础饲料配方及营养水平

日 粮 玉米/% 豆粕/% 麸皮/% 麦芽根/% 大麦/% 苜蓿粉/% 花生秧粉/% 植物油/% 预混料/% 含 量 11.00 6.00 13.00 16.00 7.00 20.00 23.00 2.00 2.00

营养水平 消化能/(MJ.kg-1) 粗蛋白/% 粗纤维/% 钙/% 总磷/% 赖氨酸/% 蛋氨酸＋胱氨酸/% 含 量 10.00 16.00 14.50 1.02 0.56 0.78 0.60

表2 各组兔的生产性能

平均始组 别 质量/g 1231±对照组 12 1222±试验1组 13 1219±试验2组 11 1228±试验3组 10 2338±121 1110.00 37±1.3 3885 3.50 8 14541 2359±116 1140.00 38±1.0 3944 3.46 7 13327 2422±129 1200.00 40±1.1 3900 3.25 3 6145 2221±112 990.00 33±1.2 3574 3.61 13 20862 量/g 增质量/g 增质量/g /g 比 亡数/只 量/g 平均末质每只全期每只平均日每只耗料料重试期死死兔称质1.3要求

试验期间，前2周按统一饲喂标准饲喂，之后自由采食。每周1次空腹称质量。试验兔统一人员管理，统一防疫管理程序。 1.4 试验时间：2010年10月—11月，换料时间3d。 2 结果与分析

试验期各组兔的生产性能见表2。由表2可见，试验1组、2组和3组在试验期间每只兔平均比对照组多增重210、150和120g，试验1组、2组合3组与对照组差异均极显著，试验2组与试验3组差异不显著。试验1组在试验期的饲料报酬比对照组提高10.0%，差异极显著，试验2组和3组的饲料报酬分别比对照组提高4.2%和3.0%，差异不显著，试验1组比试验2组和3组的饲料报酬分别提高6.1%和7.1%，差异均显著。试验期各组兔的经济效益见表3。

表3 经济效益分析

组 别 每只兔多增质量/g 每只兔多收入/元 每只兔多耗饲料/元 每只兔投入微生态制剂/元 每只兔投入酸性蛋白酶/元 每只多成活兔的效益/元.只 每只兔纯增收/元

对照组 试验1组 试验2组 试验3组 0.00 210.00 150.00 120.00 0.00 2.10 1.50 1.20 0.00 0.52 0.59 0.50 0.00 0.12 0.00 0.12 0.00 0.08 0.08 0.00 0.00 1.00 0.53 0.44 0.00 2.38 1.36 1.02 由表3可见，试验1组、2组合3组每只兔平均分别比对照组多收入2.38、1.36和1.02元。 3 讨论与结论

酸性蛋白酶与微生态制剂混合物进入肠道后可能产生一定的协同作用。微生态制剂与酸性蛋白酶的配伍使用既可发挥益生菌的生理性细菌活性，又可选择性的增殖有益菌，从而使益生菌作用更持久。

肉兔饲料中同时添加0.02%的酸性蛋白酶和0.2%的微生态制剂，可使肉兔的生长速度、成活率、饲料报酬和经济效益得到较大提高，对肉兔无任何毒副作用，是理想的肉兔绿色饲料添加剂。

附件七

低聚木糖对草鱼生长性能的影响研究

草鱼属于鲤科草食性鱼类，是“四大家鱼”之一，也是我国主要养殖鱼类，具有味美、生长快和产量高等特点，但其幼鱼成活率低，抗病力差，严重制约草鱼养殖。据研究，与草鱼相关的疾病有10多种，而严重的有草鱼出血病、肠炎病和烂鳃病等。然而，随着人们对水产品安全健康要求的提高，开发广谱、高效且安全的天然抗生素替代物，建立优质、高产和安全的草鱼健康养殖体系势在必行。

本试验探讨在草鱼饲料中添加不同浓度梯度的低聚木糖对草鱼生长性能影响，为其在水产养殖中的应用提供参考。 1 材料与方法

1.1 试验饲料及动物分组

参照草鱼营养需要，配制基础饲料。健康、规格和体质量基本一致的180尾鱼种，随即分为6组，1组为对照组，不添加酸性蛋白酶，2—6组为试验组，酸性蛋白酶（河南省瑞特利生物技术有限公司提供）添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%。试验于2011年7月6日—8月在郑州黄河渔场进行。

1.2 增重率测定

试验结束后，用电子天平对试验鱼逐条称体质量。计算试验鱼的增重率=[试验鱼末质量（g）-试验鱼初质量（g）]/试验鱼初质量（g）×100%。

1.3 数据处理

试验数据采用SAS9.0统计软件进行方差分析。

表1 酸性蛋白酶对草鱼生产性能的影响

项目 0 b0.10% 3.52±0.82 3.02±0.86 cbb0.20% 3.88±1.46 3.17±1.01 cbb0.30% 2.73±1.23 2.±0.38 bbb0.40% 5.19±0.94 4.05±0. dcc0.60% 0.66±0.55 0.71±0.83 3.53±2.75 aaa体长增加/cm 3.25±0.53 全长增加/cm 2.96±0.36 增质量/g bb17.05±3.25 25.11±6.73 26.06±6.16 19.49±7.13 33.12±9.31 由表1可见，添加0.4%酸性蛋白酶组（5组）增重比对照组显著提高。

与对照组相比，2、3和4组各组体长和全长增加差异不显著，但2和3组增重比对照组显著提高。添加0.6%酸性蛋白酶的试验鱼增重、体长和全长增加却低于对照组（P﹥0.05）。

河南省科技成果鉴定材料

成果名称：酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究 完成单位：河南省科学院生物研究所有限责任公司 河南省瑞特利生物技术有限公司

二0一一年十月