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第３４卷第１期 ２００８年２月 湖南农业大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） ＶＯ１．３４ ＮＯ．１ Ｆｅｂ．２ｏｏ８ 文章编号：１００７．１０３２（２００８）０１．００８４．０３ 茶多酚氧化酶酶学性质研究 赵淑娟 ，王坤波 ，傅冬和 ，李园莉 ，雷玉国 ，李（湖南农业大学ａ．园艺园林学院；ｂ．茶学教育部重点实验室，湖南长沙４１０１２８） 勤 摘 要：采用柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液（ｐＨ ５．６）匀浆浸提法和硫酸铵沉淀法，从茶鲜叶中提取多酚氧化酶， 并通过分光光度法研究ｐＨ，温度，抑制剂对酶活性的影响．结果表明：以邻苯二酚为底物，茶多酚氧化酶ＰＰＯ 的最适ｐＨ为５．６，最适温度为５０℃，亚硫酸钠、半胱氨酸和Ｖ－Ｃ为ＰＰＯ的抑制剂． 关键词：茶；多酚氧化酶；抑制剂 中图分类号：￥５７１．１０１ 文献标识码：Ａ Ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｅａ ＺＨＡＯ Ｓｈｕ－ｊｕａｎａ＇ｂ，ＷＡＮＧ Ｋｕｎ－ｂ ｂ，ＦＵ Ｄｏｎｇ－ｈｅ￣ｂ＊，ＬＩ Ｙｕａｎ－ｌｉ ，ＬＥＩ Ｙｕ－ｇｕｏａ＇ｂ￣ＬＩ Ｑ．ｍ （ａ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ；ｂ．Ｔｅａ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅａｃｈｉｎｇ．ＨＮＡＵ．Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）ａｎｄ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ．Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ＰＰＯ ｆｒｏｍ ｔｅａ，ｓｕｃｈ ａｓ ｐｒｏｐｅｒ ｐＨ，ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｃａｔｅｃｈｏｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒ ｐＨ ｗａｓ ５．６，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ５０℃，ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ， ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｉｔｅ，Ｌ—ｆｃｙｓｔｅｉｎｅ，ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＰＰＯ ｆｒｏｍ ｔｅａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｅａ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ；ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ 茶多酚氧化酶（邻苯二酚氧化还原酶，ＰＰＯ， Ｅ．Ｃ．１．１０．３．１）是茶树体内的一种重要酶类，它对茶树 的生长发育具有积极意义，在茶叶加工中占有极为 重要的地位，其活性的高低也是决定茶树品种适制 性的一个重要指标…．在茶叶加工过程中，茶多酚 氧化、降脂等多种药理功能，并对动脉粥样硬化、 高血压、龋齿等都有一定的防治效果Ｉ４ 】．研究茶多 酚氧化酶的生物学特性，是茶叶生化领域的一大热 点．掌握多酚氧化酶的特性，可以为红茶加工过程 中控制适度发酵及提高茶黄素的含量提供理论依 据，丰富茶叶加工及生物化学理论． 氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化成邻 醌进而形成茶黄素等氧化聚合物【２Ｊ．伴随着儿茶素 等多酚类物质的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气前 体物质发生偶联氧化，产生多种香气化合物，形成 红茶的独特品质．有研究证明，茶黄素含量与红茶 １材料与方法 １．１ 材料 品质呈高度正相关，并具有良好的生理活性 】．近 代研究表明，茶黄素具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗 收稿日期：２００７．０５．１５ 基金项目：湖南省教育厅项目（０６Ｃ４０４） 作者简介：赵淑娟（（１９８２．），女，山东德州人，硕士研 究生． 通讯作者：ｆ７８７９＠１２６．ｃｏｒｎ． 茶鲜叶槠叶齐，采于长沙高桥茶园，储藏于一７Ｏ ℃冰柜中． １．２方法 １．２．１ ＰＰＯ的提取 取５０ ｇ，一７０℃茶鲜叶加入到３００ ｍＬ预冷的 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液（ｐＨ ５．６）中，并加入１０ ｇ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第３４卷第１期 赵淑娟等 茶多酚氧化酶酶学性质研究 ８５ ＰＶＰＰ和０．５ ｇ Ｖ－Ｃ，在组织粉碎机中匀浆２次，每 次２ ｍｉｎ．匀浆物收集于大三角瓶中，于４℃冰箱 中，静置浸提１２ ｈ，其间振荡２次．将浸提后的酶 液经４层纱布过滤后，在冷冻离心机中以４℃离心 发现在偏酸的条件下发酵有利于茶黄素的形成从 而提高红茶品质． ５００ ４００ ２次，每次２０ ｍｉｎ，转速分别为４ ０００和９ ０００ ｒ／ｍｉｎ， ３００ ２００ 弃去沉淀，边搅拌边向上清液中加入固体硫酸铵 分级盐析，取３０％～８０％盐析沉淀物经ｐＨ ５．６的 藿１００ 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液透析，即得到茶多酚 氧化酶粗酶液． １．２．２ ＰＰ０活性测定及最佳反应条件的确定 于３７℃，ｐＨ ５．６的条件下，用ＵＶ－２５５０分光 光度计在４６０ ｎｍ波长下检测酶活．单位时问内，单 位体积酶液吸收值变化０．００１定义为一个酶活单位． 配制０．１ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸磷酸缓冲液，在ｐＨ分 别为４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０ 时，以１０ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚为底物测定多酚氧化 酶的活性． 配制０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ５．６的柠檬酸磷酸缓冲液，分 别在２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０， ７５，８０℃条件下，以１０ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚为底物， 测定多酚氧化酶的活性． 以ｌ０ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚为底物，在 述检测的 最适ｐＨ及最适温度的条件下测定亚硫酸钠、半胱 氨酸和Ｖ－Ｃ对多酚氧化酶活性的影响． 配制１０ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ焦性没 食子酸，２ ｍｍｏｌ／ＬＥＧＣｇ，２ ｍｍｏｌ／ＬＥＣｇ，再用ｐＨ ５．６的柠檬酸磷酸缓冲液调配成不同终浓度水平， 测定米氏常数Ｋｍ和最大反应速率Ｖｍａｘ． ２结果与分析 ２．１ ｐＨ对ＰＰ０活性的影响 以邻苯二酚为底物，于３７℃条件下测定不同 ｐＨ值时多酚氧化酶的活性，结果见图１．从图ｌ可 以看出，以邻苯二酚为底物，茶鲜叶中多酚氧化酶 的最适ｐＨ约为５．６．当ｐＨ降至４．０时，酶活性为 最高活性的６８．５％；当ｐＨ升至８．０时，酶活性为最 高活性的３５．８％．毛清黎Ｉ１ 】在研究红茶发酵中ｐＨ 对多酚氧化酶活性及茶黄素形成的影响时，也 ４ ６ ７ ｐＨ 图１ 荼多酚氧化酶活性随ｐＨ值的变化 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｐｉｔ ２，２温度对ＰＰ０活性的影响 以邻苯二酚为底物，ｐＨ ５．６条件下测定不同温 度对多酚氧化酶活性的影响，结果如图２．茶多酚 一Ｔ１Ⅲ．Ｔ口冒．ｎ）、妲鞋 氧化酶对温度很敏感，其最适温度为５０℃．温度 ∞ ∞∞∞∞ ０ 比最适温度低时，随着温度的升高，酶活性也升高， 直至最适温度才表现最大活力．但是温度高于最适 温度以上时酶活性呈直线下降，温度升至８０℃时， 茶多酚氧化酶的活性完全受到抑制．所以，调节反 应温度可以有效提高多酚氧化酶活性． 图２温度对茶多酚氧化酶活性的影响 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２．３亚硫酸钠、半胱氨酸和Ｖ－Ｃ对ＰＰ０活性的影响 底物为１０ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚，在３７℃，ｐＨ ５．６ 时测定不同添加剂对多酚氧化酶的抑制作用，结果 见图３．亚硫酸钠、半胱氨酸和Ｖ—Ｃ都对茶叶中的 多酚氧化酶有强烈的抑制作用．当Ｖ—Ｃ浓度达到 ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎａ２ＳＯ３浓度达到０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，半胱氨 酸浓度达到０．４ ｍｍｏｌ／Ｌ，均能完全抑制茶多酚氧化 酶的潘ｌ生． 维普资讯 http://www.cqvip.com ８６ 湖南农业大学学报（自然科学版） ２００８年２月 Ｉ２０ ８０ 。・４０ 蠢 。０ ０．０２５ ０．０５ Ｕ．１ ０ ２ Ｕ．３ Ｕ．４ 抑制剂终浓度／（ｍｍｏｌ・ｍＬ ） 图３ Ｖ－ｃ，Ｎａ ＳＯａ和半胱氨酸对茶多酚氧化酶活性的影响 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃ￣ｏｆＶ－Ｃ Ｎａ２ＳＯ３ ａｎｄ Ｌ－ｃｙｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈ－ｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ ２．４不同底物对ＰＰ０活性的影响 以不同底物测定酶促反应的动力学性质．根据 中间复合物假说，在ｐＨ ５．６，３７℃条件下，测定了 不同底物存在时的吸光值．采用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ 双倒数法求得各底物的Ｋｍ和Ｖｍａｘ，结果见表１． 表１不同底物的 和Ｉ／ｍａｘ ＴａｂｌｅＩ ＫｍａｎｄＶｍａｘ ｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ 从以上结果中可以看出，不同底物对茶多酚氧 化酶的催化反应有不同的Ｋｍ和Ｖｍａｘ．４个底物 中，茶多酚氧化酶的最佳底物是ＥＣｇ，其次是 ＥＧＣｇ，焦性没食子酸和儿茶酚．但从反应速度来 讲，儿茶酚的Ｖｍａｘ最大，其余大小依次是儿茶酚， ＥＣｇ，ＥＧＣｇ，焦性没食子酸． ３ 讨 论 ＰＰＯ是一种含铜的蛋白质，其作用机制在于铜 的氧化还原作用，在酸性环境中，酶中ｃｕ 被解离 出来，使酶失活，而在碱性环境中酶蛋白与ｃｕ 脱离成为不溶性氢氧化铜，也能使酶失活 ¨．本试 验以邻苯二酚为底物，茶鲜叶中多酚氧化酶的最适 ｐＨ约为５．６．不处于最适ｐＨ条件下时，ＰＰＯ都不 能充分发挥其催化作用．因此，控制适宜的ｐＨ值 能有效提高酶活性，有利于酶促反应的进行．同 时，儿茶素的组成和温度等条件也对酶促反应影 响较大． 参考文献： 【１］黄建安，黄意欢，罗军武，等．茶树多酚氧化酶基因的 ＳＮＰ分析【Ｊ】．湖南农业大学学报：自然科学版，２００７， ３３（４）：４５４—４５８，４８５． 【２］宛晓春．茶叶生化【Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００３： １８０． 【３】曾晓雄，罗．酶在茶叶加工中的应用研究现状与展 望【Ｊ】＿食品科技，１９９１，２７（４）：２５—２６． ｆ４］Ｌｅｕｎｇ Ｌ Ｋ，Ｓｕ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ ｉｎ ｂｌａｃｋ ｔｅａ ａｎｄ ｃａｔｅｃｈｉｎｓ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ａｒｅ ｅｑｕａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｏｘｉｄ－ ａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００１，１３１（９）：２２４８．２２５１． 【５］陈虎，胡英，周睿，等．茶黄素的抗氧化机理 的研究进展［Ｊ】．茶叶科学，２００５，２５（４）：２３７—２４１． 【６］丁阳平，刘仲华，黄建安．茶黄素类抗肿瘤作用研究进 展［Ｊ］．河南科技大学学报：农学版，２００４，２４（１）：６０—６４． ［７】李立祥，萧伟祥．茶色素及茶黄素药理作用研究进展［Ｊ】 ＿福建茶叶，２００２（４）：３５—３８． ｆ８］ 楼福庆．茶色素与动脉粥样硬化症ｆＪ］．中国茶叶， １ ９８７（２）：２８—３０． 【９］杜琪珍，江和源．茶色素的药理及功效ｆＪ］．中国茶叶， １９９７，１９（５）：４２—４３． 【１０】毛清黎，朱旗，刘仲华，等．红茶发酵中ｐＨ 对多酚氧化酶活性及茶黄素形成的影响［Ｊ】．湖南农业 大学学报：自然科学版，２００５，３１（５）：５２４—５２６． 【１ １］ 胡 军．莲藕中多酚氧化酶的特性及莲藕的护色ｆＪ］． 食品与发酵工业，１９８９（３）：４７—５１． 责任编辑：罗慧敏 英文编辑：胡东平
