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多糖的结构测定及应用

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多糖的结构测定及应用 田华 ,张义明 (1.贵州大学昆虫研究所,贵阳550025;2.信阳师范学院生命科学学院, 信阳464000;3.贵州工业职业技术学院,贵阳550008) 摘要:多糖是由醛糖或酮糖通过脱水形成糖苷键,并以糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物。本 文就多糖的初级结构和高级结构测定及应用做了综述,初级级结构常用的测定方法有化学分析法、仪器分析 法、生物学分析法,高级结构常用的测定方法有x射线衍射法(XRD)、原子力显微镜法(AFM)、电子显微 镜(EM)、扫描隧道显微镜(STM)、核磁共振(NMR)、圆二色谱(CD)。目前多糖在医药、食品、动物生 产、烟草、化妆品、环境治理等领域应用广泛。 关键词:多糖;结构测定;初级结构;高级结构;应用 中图分类号:TS202.1 文献标识码:A 文章编号:1006—2513(2012)02—0177—05 Structural determination of pOIysaCCha rides and its application TIAN Hua ._.ZHANG Yi-ming (1.Institute of Entomology,Guizhou University,Guiyang 550025; 2.College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000; 3.Guizhou Industry Polytechnic College,Guiyang 550008) Abstract:when Aldose or Ketose is dehydrated,they form glycosidic bond.Then these glycosidic bond linear or branched link together to form chain polymers.The overall primary structure,advanced structure and applications of polysaeeharides were discussed.Chemical analysis methods,instrumental analysis methods and biological analysis methods were common methods in determination of primary structure of polysaccharides.The advanced structure deter- mination methods were x—ray difraction,atomic force microscope,electron microscope,scanning tunneling micro— scope,nuclear magnetic resonance,circular dichroism,etc.Currently polysaccharides aye widely used in medicine, food,animal production,tobacco,cosmetics and environmental improvement. Key words:polysaccharides;stucturarl determination;primary structure;advanced stucture;applrication 多糖(Polysaccharides)又称多聚糖,是由醛 真菌等。大量的研究证明多糖是国际公认的天 糖或酮糖通过脱水形成糖苷键,并以糖苷键线性 或分枝连接而成的链状聚合物,一般聚合度大于 10,相对分子量为数万到数百万(勒学远和董海 丽,2009)。多糖是自然界中含量最丰富的一种 生物聚合物,广泛存在于动物、植物、微生物和 收稿日期:2011—11—16 然、安全、高效的天然免疫调节剂,许多天然中 草药多糖、动物多糖等具有免疫调节、降血糖、 降血脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、保 护胃肠系统等多种生物学活性(刘春兰,2008)。 1969年,世界权威科学杂志(nature>)首次 作者简介:田华(1979一),女,河南南阳人,在读博士,研究方向生物技术。 发表了香菇多糖的抗肿瘤作用,开启了活性多糖 多糖具有多种多样的生物学功能,多糖的化 的研究热潮,人们逐步认识到多糖类是涉及生命 活动本质的生物分子之一,蕴含十分丰富的生物 语言信息,是高密度的信息裁体。在各种错综复 杂的生命现象的产生与疾病的形成过程中,多糖 类化合物起到了重要作用。2001年,“Science” 杂志指出:多糖结构的多样性和复杂性,以及所 学结构是其生物活性的基础,多糖的生物活性又 是多糖应用的前提,因此多糖的一级结构、高级 结构与其生物活性关系的研究是当前糖化学和糖 生物学共同关注的焦点问题。多糖的构效研究是 寻找具有生物活性多糖和多糖药物及多糖功能性 食品开发的基础。因此,本文就多糖的初级结构 携带的信息量远远超过了核酸或蛋白质,这决定 了其功能具有多样性。2002年,世界上最有影响 的科学普及杂志“scientiifc American”以“甜蜜 和高级结构测定及应用做了综述,旨在为多糖构 效及应用研究提供参考,加快多糖工程产品的开 发应用,推动多糖功能性保健品及临床药品的快 速发展,造福人类。 的科学”为题,发表封面文章,指出下一代的肿 瘤治疗药物将来自活性多糖。2003年,美国麻省 理工学院将研究活性多糖结构和功能的科学—— 糖组学(glycomics)列为最有可能改变人类未来 的十大科学技术之首,这是继基因组学和蛋白质 组学后的生命科学研究新前沿。 我国对多糖的研究起步较晚,始于2O世纪 7O年代,研究的对象涉及真菌类多糖、地衣类多 糖、动物类多糖、微生物类多糖等,研究范围涉 及多糖的提取分离、纯化、结构分析、物理化学 性质、免疫学、营养学、药理学、治疗应用及产 品开发等,研究的范围涉及化学、生物学、物理 学、医药等领域。虽然近年来对多糖的研究日益 重视,但多糖的研究水平与蛋白质和核酸相比还 有很大的差距,主要表现在以下几个方面:一是 1 多糖的结构测定 多糖参与细胞的各种生命活动,具有多种生 物学功能,然而并不是所有的多糖都具有生物活 性,多糖的活性直接或间接地受到结构的制约。 多糖的结构分初级结构和高级结构,一级结构为 初级结构,二、三、四级结构为高级结构。一般 将多于20个糖基的糖链称为多糖。多糖的结构研 究是多糖化学研究的关键。由于组成单糖种类与 数目不相同,多糖的结构非常复杂。要完全阐明 一个糖的结构,一般需要提供以下几方面的信 息:①相对分子质量及组成单糖的种类与物质的 量比;②各糖环的构象(呋喃型或吡喃型)与异 头碳的构型;③各糖残基间的连接方式,糖残基 的连接顺序;④二级结构及空间构象等(勒学远 和董海丽,2009)。 多糖结构和功能的关系还不够明确;二是多糖的 结构测定还达不到自动化、标准化和微量化;三 是多糖的合成困难,四是多糖在机体内的作用机 制还不十分清楚。 表1测定糖链一级结构的常用方法(张惟杰,1987;陈国荣。2009) 测定项目 相对分子质量 常用方法 凝胶过滤、质谱、蒸汽压、飞行质谱 部分酸水解、完全酸水解、纸色谱、气相色谱 红外光谱 选择性酸水解、糖苷酶连接次序水解、核磁共振 单糖组成和分子比例 吡喃环或呋喃环形式 连接次序 d一或B一异构体 羟基被取代情况 糖肽连接方式 糖苷酶酸水解、核磁共振、红外光谱 甲基化反应一气相色谱法、过碘酸氧化、核磁共振、质谱 单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应 1.1一级结构 一原子轰击质谱(FAB—MS),电喷雾质谱(ESI— MS),基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI— MS)等。电泳技术,如毛细管电泳(CE)技术, 把多糖衍生化后即可研究多糖的相对分子质量、 级结构是指糖基的组成、糖基的排列顺 序、相邻糖基的连接方式,异头碳构型一级糖链 有无分支,分支的位置和长短等。与蛋白质和核 酸相比,多糖的一级结构非常复杂(勒学远和董 海丽,2009)。 1.2高级结构 组成、纯度鉴定和结构归属;荧光基团标记的糖 的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGEFS)技术可以对 多个多糖样品平行地进行分离和定性分析;十二 烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳一聚偏氟乙烯 薄膜电迁移技术(SDS—PAGE—PVDF)是最新 多糖的高级结构包括多糖的二、三、四级结 构。多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主 要次级键而形成的有规则的构象。多糖的三级结 构是指以二级结构为基础,由于糖单位羟基、羧 基、氨基以及硫酸基之间之间的非共价相互作 用,导致二级结构在有序的空间里产生的有规则 的构象。多糖的四级结构是指多聚链间非共价键 结合形成的聚集体(周鹏等,2001)。 1.3一级结构的测定 多糖一级结构的研究方法有很多,目前已建 立的一级结构测定方法有:化学分析方法、仪器 (物理)分析方法、生物学分析方法等。 化学分析方法常用的有酸水解、高碘酸氧化 法、Smith降解法、甲基化反应等,酸水解主要 确定各单糖的组成,高碘酸氧化法主要判断糖苷 键的键型和比例、糖苷键的位置、支链多糖的分 支数目,Smith降解法推断单糖的连接顺序和键 型,甲基化反应确定各单糖的组成、比例和糖苷 键的位置。 仪器(物理)分析方法主要有紫外光谱 (uV)、红外光谱法(IR)、核磁共振光谱法 (NMR)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱 (GC)、质谱法(MS)、电泳技术。uV主要用于 检测260nm、280nm有无吸收峰来判断多糖中是 否有蛋白质、多肽类及核酸。IR可帮助识别吡喃 糖和呋喃糖、帮助确定糖苷键类型、糖的构型以 及多糖链上羟基的取代情况等信息。3200~ 2800em一、1400~1200cm 这两组峰是初步判断 该化合物是不是糖类化合物的关键峰,730em~~ 960em 多糖的特征吸收峰是鉴定多糖的关键峰。 NMR主要解决多糖结构中糖苷键的构型以及重复 结构中单糖的数目,一般 HNMR测定简单的多 糖、BCNMR测定复杂的多糖。HPLC和GC主要 应用于单糖和甲基化单糖的分离和鉴定。MS主 要用来研究糖链序列连接和结构鉴定信息,如快 发展起来的专门用于糖蛋白分离的技术,该技术 将电泳凝胶上的糖蛋白定量地转移到聚偏氟乙烯 (PVDF)薄膜上直接进行酸水解,分析其氨基酸 和糖基组成,或进行溴化氢降解,各种蛋白酶、 糖肤酶和糖苦酶的水解,以及将PVDF膜直接置 于蛋白质GC序列仪或MS上进行序列分析,从而 获得pmol级糖蛋白的肽链和糖链顺序以及糖肽 连接方式(勒学远和董海丽,2009)。但是由于 多糖结构的复杂性,决定了任何一种单一的方法 都不可能确定多糖的结构,需要多种方法联合使 用。 生物学分析方法主要是酶解法和免疫学法。 酶解法利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到 寡糖片断,再与其它结构分析方法结合推测多糖 的结构。免疫方法分析糖链结构主要是利用相近 抑制常数的多糖结构相似的原理,当某种未知结 构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制,通过 测定其抑制常数,再与已知结构的糖链相比较, 即可推测除未知结构的糖链顺序。 1.4高级结构的测定 多糖高级结构的测定方法主要有:x射线衍 射法(XRD)、原子力显微镜法(AFM)、电子显 微镜(EM)、扫描隧道显微镜(STM)、核磁共 振(NMR)、圆二色谱(CD)。 2多糖的应用 2.1医药领域应用 多糖类药物作用位点是在细胞表面,对细胞 毒性小,对正常细胞影响小,具有促进免疫、抗 肿瘤、抗突变、降血脂、降血糖、抗病毒等作 用,亲水性高,易溶于水,能与生物大分子相连 形成糖脂、糖蛋白等缀合物发挥生物学功能,因 此多糖不仅可以作为治疗药物开发,还可以作为 保健类药物和保健食品进行开发。多糖类医药主 要的研究方向是寻找某些已知或未知多糖的新的 生物活性;加强理论研究,如多糖的构效关系, 结构改造等,通过结构改造的方法产生或提高多 损伤视网膜节细胞保护作用的实验研究(邢达 勇,2008),芦荟多糖(王学梅等,2009)、茶多 糖(胡忠泽等,2005)、酵母多糖(高仕英等, 2000;张运涛,2000)、海藻多糖(朱新产等, 2002)、甘草多糖(王丽荣等,2004)等对肉仔 糖的活性;加强多糖的开发应用工作;深入多糖 的药物代谢、稳定性以及制剂方面的研究工作, 寻找新的给药途径,选择佳给药剂量和给药时间 等,最终目的是寻找低毒高效的多糖药物(芮海 云等,2002)。目前市场上的多糖类药物主要有: 香菇多糖注射液、猪苓多糖注射液、云芝多糖胶 囊、黄芪多糖、云芝肝泰、灰树花胶囊等(蔡文 娥,2005)。 2.2食品领域应用 多糖主要由葡萄糖基单体构成,具有较大的 分子量,溶于水易形成凝胶,除赋予食品特定功 能外,还能明显改善食品的质地,因而具有广泛 的应用。功能饮料中添加一定量多糖可以起到增 稠、稳定和提高口感的作用,如枸杞多糖饮料、 银耳多糖饮料。在面制品中添加一定量多糖具有 增稠、稳定、热凝胶特性等食品加工性能,不仅 增加了面制品的保健功能,还可以有效防止糊 汤、软烂现象,提高面条的弹性。在火腿肠、香 肠、午餐肉等肉制品中添加一定量的多糖,能够 增加肉的持水性,改善制品弹性及切片性能,防 止肉制品脱水脱汁,改善口感。还可利用其稳定 性、凝胶性、成膜性、耐热冷等特性,应用在冰 淇林、果冻、蛋糕、奶酪等食品中。另外,可根 据食物多糖的凝胶作用,制作多糖可食性包装 膜,用作肠衣、果蜡、糖衣、糯米纸、冰衣和药 片包衣等(徐中岳等,2008)。 2.3动物生产中的应用 多糖作为一种重要的免疫促进剂,能够提高 动物自身的非特异性免疫和特异性免疫反应,增 强动物对细菌、真菌、病毒及寄生虫的抗感染能 力,增加动物对外界不良刺激的适应性,从而提 高动物的生产性能,增加经济效益,最重要的是 使用多糖作为免疫调节剂毒副作用小,没有药物 残留,对环境、人类也没有不良影响,可作为抗 生素及一些抗病毒药物的替代品,因此在动物生 产中应用广泛,如米糠多糖对鸡生长与免疫调控 研究(李淑芳,2007),香菇多糖对家兔视神经 鸡生长、鸡肉品质、蛋用仔鸡小肠绒毛保护作 用、免疫系统等方面进行了研究,牲畜(朱辉, 2011;张红英,2009;卢福庄和张宏福,2000; 边传周和王老七,2005)、水产养殖方面(李海 燕等,2004;宋献周和沈月新,2000;郑永标和 江枝和,2000;刘岩和江晓路,2000)也有研 究。现代医学研究发现,多糖类作为补益中药具 有整体的协调功能,其中以神经、内分泌与免疫 调节网络为主,在促进细胞免疫、提高非特异性 免疫功能方面的作用非常显著(陈继红等, 2006)。 2.4烟草领域的应用 刘洋等提取了仙人掌多糖,将其应用于卷 烟,并考察仙人掌多糖对烟丝保润性能、烟叶表 面润湿性以及感官舒适度的影响,结果显示,热 水浸提法提取的仙人掌多糖添加在卷烟中后整体 评吸效果较好,更适用于卷烟生产;仙人掌多糖 具有较好的保润效果,能够在低湿条件下降低烟 丝的失水率,减缓水分的散失,高湿条件下与丙 二醇的吸湿性能较为接近;仙人掌多糖水溶液在 烟叶表面的接触角较小,对烟叶表面的润湿性较 好,更易浸湿烟丝;仙人掌多糖具有增加香气 量,提高烟气细腻度,增强回甜感,减轻杂气等 作用(刘洋等,2010)。 2.5化妆品领域中的应用 多糖是重要的生物活性大分子,是人体皮肤 真皮层的重要组成成分,许多多糖在皮肤新陈代 谢过程中具有突出的调节作用,生物活性多糖作 为功效型化妆品添加剂在化妆品中的应用,是生 物美容的一个重要方向,能产生保湿、稳定、改 善肤色、抗衰老、抗菌、促进上皮纤维成细胞增 殖等多种功能,且高分子多糖无毒副作用,与常 用化妆品成分配伍性好,因此,生物活性多糖作 为功效型化妆品添加剂将有着广阔的前景(刘敏 等,2010)。目前在化妆品中常用的多糖有透明 质酸、肝素和低分子量肝素、甲壳素及其衍生 物。纤维素硫酸酯是纤维素的多糖衍生物,目前 用作化妆品添加剂,不仅可以发挥抗凝血作用, 改善微循环,还起到抑菌、保湿和乳化的多重功 效,是值得进一步开发的功效型多功能化妆品添 加剂(王兆梅等,2004)。 2.6环境治理中的应用 和抗氧化能力的影响[J].2005,25(1):61—64. [12]高仕英,吴纪经,吴英华.酵母多糖对肉用仔鸡免疫系统 的影响[J].中国实验动物学报,2000,8(3):187— 189. [I3 J张运涛,谷文英,王永玲.酵母多糖对蛋用仔鸡小肠绒毛 保护作用的研究[J].粮食与饲料工业,2000(3):3O一 31. 多糖还可作为凝固剂、润滑剂、增稠剂、絮 凝剂、悬浮剂、凝胶剂等广泛应用于化工、石 油、纺织印染、水处理、材料等工业。治理“白 [14]朱新产,王宝维,张庭荣.海藻多糖对肉鸡生长性能的影 响[J].动物营养学报,2002,14(4):54—58. [15]王丽荣,张海棠,刘保国,等.甘草多糖的提取及其对肉 仔鸡生长性能的影响[J].饲料工业,2004(8). [16]朱辉.黄芪多糖与复方黄芪多糖对猪瘟疫苗免疫效果影响 的研究[J].山东农业大学2Ol1硕士论文. 色污染”根本途径是制备可生物降解高分子材 料,多糖因具备生物降解性使其成为这一领域研 究热点。 参考文献: [1]刘春兰.少数名族地区药用植物多糖的化学与药理[M]. 北京:中央民族大学出版社,2008. [2]勒学远,董海丽.天然产物降血糖功能性成分研究[M]. 上海:上海交大出版社,2009. [3]张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技 术出版社,1987. [4]陈国荣,糖化学基础[M].上海:华东理工大学出版社, 2009. [17]张红英.3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研 究[D].河南农业大学2009博士学位论文. [18]卢福庄,张宏福.非淀粉多糖在断奶仔猪和生长肥育猪饲 粮中的作用[J].饲料博览,2000(8):4—6. [19]边传周,王老七.黄芪多糖对断奶仔猪免疫功能及腹泻的 影响[J].畜牧与兽医,2005,37(1):10—12. [2O]李海燕,李桂峰,刘俊.饲料中添加酵母多糖对丰产鲫的 影响研究[J].广州大学学报(自然科学版),2004,3 (2):122—125. [21]宋献周,沈月新.不同平均分子量的 壳聚搪的抑菌作用 [J].上海水产大学学报,2000,9(2):138—141. [22]郑永标,江枝和.868细菌多糖类提取物对甲鱼抗体产生 [5]周鹏,谢明勇,傅博强.多糖的结构研究[J].南昌大学学 报,2OOl,25(2):97—203. 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