（一）SDS—PAGE电泳
1. 试剂配置
a) 30%母液 丙烯酰胺， 甲叉丙烯酰胺，加入纯水定容到100ml过滤保存
于4℃（30天内用完）
b) 10％SDS SDS 10g加入90ml蒸馏水缓慢搅拌溶解后定容到100ml c) 6NHcl
d) Tris-Hcl，PH= 碱加纯水至60ml调解PH值到定容到100ml 储存于4
度 1L
e) M Tris-Hcl，PH= 6gTris碱加纯水至60ml调解PH值到定容到100ml ，
储存于4度 500ml
f) 还原型5XSDS上样缓冲液 mol/L Tris•HCl（） ，二硫叔糖醇（DTT，） ，
SDS ，溴酚蓝 ，甘油 混匀后，分装于离心管中，4℃保存 20ml g) 10×电泳缓冲液 碱 甘氨酸 10gSDS 溶于蒸馏水，定容到1L保存于
4℃如果有沉淀，平衡到室温。用时每50ml10×电泳缓冲液加入450ml蒸馏水混匀即可。 1L
h) 10%过硫酸铵（APS） 100mg溶于1ml蒸馏水中 i) 胶的选择
丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（KD） 15 10～ 43 12 12～ 60 10 20～ 80 8 5 36～ 94 57～212
j) 浓缩、分离胶配置表 8% 块数 2 1 水 30%母液 Tris-cl 10%SDS 10%APS TEMED 2. 步骤 分离胶（） 2 10% 1 2 12% 1 2 15% 1 浓缩胶（） 5% 2 1
a) 组装玻璃板用1大1小两块干净玻璃板组装模具，用夹子夹好，底部要平，
如果用旧槽底部可以用封口膜以防漏胶 b) 把组装好的玻璃板固定在模具上
c) 按照需要在4ml小管中配置如表的浓缩胶和分离胶缓冲（浓缩胶先不加
TEMED）
d) 用小心加入分离胶缓冲液到离上缘4-5cm（3240ul），从玻璃板的左侧加，
从右侧加入纯水到上缘
e) 凝固20分钟以上观察试管中剩余的凝胶凝固情况，如果凝固很好，倒掉
玻璃板内的水，用吸水纸小心尽量吸干水，注意滤纸不要碰到分离胶 f) 浓缩胶缓冲液加入TEMED用加入胶槽，尽力不要产生气泡，如果有小
的气泡可以轻微敲打玻璃板使气泡上升 g) 斜着插入梳子后摆正（为了不产生气泡）
h) 把蛋白样品与上样缓冲液混合 ，煮沸5分钟，13000转离心5分钟。蛋白
上样量一般在30-100μg （95或100度 3min）。
i) 浓缩胶大概40分钟凝固。等胶凝固后，左右各一下缓慢取下梳子。用手
擦掉玻璃板上凝固的胶，防止加样的时候加不进去。把玻璃板加到电泳槽上，两块对好，关上卡子。槽中间缓慢倒入新鲜电泳缓冲液（1×电泳缓冲液），加满。 取下玻璃板，用水冲去胶粒，用食指压住按钮，拇指用力把玻璃板（低面朝内）固定到胶槽中。槽中间缓慢倒入新鲜电泳缓冲液，观察是否漏液，如果不漏垂直拔出梳子，加满电泳缓冲液。 j) 用上样针上样注意不要把针尖挨住凝胶大梳子上扬不超过25ul，小梳子不
超过15ul，。为避免边缘效应，两边也应加入蛋白样品。（2ul蛋白样品） k) 在外槽中加入先前旧的电泳缓冲液，把内槽放入
l) 注意黑接黑红接红80V 30分钟，180V 1个小时到1个半小时（200V 40
分钟）
m) 电泳结束后，把电泳槽拿到水池边，外槽的缓冲液不好的就倒掉，取出内
槽，把内槽的电泳缓冲液倒到外槽，后回收注意是电泳缓冲液的瓶子 n) 取出玻璃板，小心敲开玻璃板，注意不要用一个角用力要平衡，切除浓缩
胶。可以切角标记。 o) 清洗玻璃板及梳子。
（二）转膜
1. 所需物品及试剂配置
a) 所需物品：甲醇、转移缓冲液、春红染液、玻棒 b) 溶液配置
_ 25mM Tris-base 192mM Glycine 20%methanol %SDS
转移缓冲液 Tris-base Glycine methanol 200ml add ddH2O to
1000ml, Do not adjust the pH!!。注意一般目的蛋白的PH值要比转移缓冲液的PH值差2才有较好的转移效率。
半干转 48 mM Tris, 39 mM glycine, (20% methanol) pH
Dissolve g Tris and g glycine [and g SDS or ml of 10% SDS] in dd H2O (add 200 ml of methanol); adjust volume to 1 liter with dd H2O.
10×： Tris g甘氨酸 加水至1L。
用时稀释成1L：加200ml 甲醇（加纯水至250ml） 100ml半干转 650ml纯水。
b) 储存液(10×)：丽春红S 2g，三氯乙酸 30g，磺基水杨酸 30g，蒸馏水至
100ml，使用时将其稀释10倍。（1ml立春红 9ml纯水 放到培养皿里）
2. 200mA转印所需时间
目的蛋白分子大小(kDa) 80---140 25---80 15—40 <20 胶浓度 8% 10% 12% 15% 转移时间(h) 3. 步骤
a) 制备足够转移缓冲液（半干转缓冲液1×）以充满转移槽，另外准备200 ml
用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。
b) 从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬
的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破，同时在胶的右上角做个记号。
c) 将凝胶浸入转移缓冲液中15 - 30 分钟。 d) 准备膜：
纤维素膜：将膜进入转移缓冲液中15 - 30 分钟。 （缓冲液中放
2块胶和2块纤维素膜）。
PVDF 膜：在甲醇中润湿膜15 秒，保证膜由不透明变成半透明。小
心将膜放入双蒸水水中浸泡2 分钟。小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5 分钟。
e) 滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30 秒。
f) 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张纤维素膜，用玻棒来回擀
几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡（滤纸-膜-胶） g) 小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气
泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。） h) 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的红面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。转膜装置置于冰水中，打开电源30 mA过夜或200 mA2小时。（10V恒压 18min ） i) 转完后在膜上做个记号，以判断膜的正反面
j) 将PVDF膜、纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红1成（皿）染色液
中，摇动3-5分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当记录。 k) 用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，
进行后续的Western检测。
（三、免疫反应
1. 试剂配置
a) 所需物品： b) 溶液配置
10×TBS缓冲液1 mol/ L Tris·HCl（，）100ml（ Tris碱） NaCl 88g 蒸
馏水至 1000ml。 1 mol/ L Tris·HCl（）50ml NaCl 44g 蒸馏水至 500ml。
TBST缓冲液（含％Tween20的TBS缓冲液）250μl Tween20加入500ml
TBS溶液中。 500ul Tween 20加入1000mlTBS溶液中。
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）
5g TBST 100ml 溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。（5g奶粉加100mlTBST）
2. 步骤
a) 将膜用TBS浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下,用封闭液在脱色
摇床上摇动封闭2h或者４度过夜，如果预实验做完后，发现背景比较高，可以适当延长封闭时间。1h（可转完膜后放牛奶中放4度） b) 如果以后需要做膜再生实验的，最好用脱脂奶粉做封闭剂。（一抗的管加
2ml封闭液，2ulNaN3， 2ul一抗）将一抗用封闭液稀释稀释至适当浓度；通常用自封袋装溶液，溶液体积大概2-5ml，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后（不必洗涤），将膜蛋白面朝上放于抗体液面上，脱色摇床上室温孵育1-2小时后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次8min，如果预实验发现背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；如果预实验发现条带较淡，可以一抗４℃过夜孵育。（室温一抗1至1个半小时）
c) 金桥的二抗按照1:2000用封闭液稀释，37℃孵育 2h 后。二抗1ul 抗体
加2ml封闭液。（室温二抗1至1个半小时）
d) 用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min；如果预实验发现背景
比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；如果预实验发现条带较淡，可以二抗４℃过夜孵育
（四）、ECL化学发光，显影，定影
1. 试剂配置
a) 所需物品： A 、B液 b) 溶液配置 2. 步骤
a) 平铺两块保鲜膜
b) 将150μl A 和 B（每平方厘米需要A、B液） 两种试剂在离心管中等体
积混合；1min 后，将溶液加在平铺的保鲜膜上，将膜的蛋白面与液体接触，反应2min后去尽残液，用另一块保鲜膜包好，贴在X-光片夹中。（要把液体加在目的条带上） c) 在暗室中，将显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X－光片，
用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开X-光片夹，把 X－光片放在膜 上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果（一般发光超过20分钟）；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带
后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
（五）、膜再生
摸再生法，先用温和再生法如果不行，再用剧烈再生法。 1. 温和膜再生
a) 再生液配制，1L：15g 甘氨酸，1gSDS, 10ml Tween20 调解PH值到到终
体积1L b) 步骤
i. 用能覆盖膜体积的摸再生液室温孵育5-10分钟，弃去。 ii. 再次用能覆盖膜体积的摸再生液室温孵育5-10分钟，弃去。 iii. TBST洗膜10分钟
iv. 再次TBST洗膜10分钟 v. 5分钟TBST
vi. 5分钟TBST洗膜完成，可以用于杂交封闭 2. 剧烈再生法（在通风厨中配置缓冲液或再生）
a) 再生液配制， 20mlSDS 10%， ，纯水，在通风厨中加入β-巯基乙醇。 b) 步骤
i. 加热缓冲液到50℃
ii. 加可覆盖膜体积的膜再生液，最好用一个小的可密封的塑料管 iii. 加入膜，50℃45分钟，过程中晃动膜几次 iv. 弃去缓冲液
v. 水龙头上冲洗1-2h（痕量的β-巯基乙醇就能破坏抗体） vi. TBST洗膜5分钟
vii. 5分钟TBST洗膜完成，可以用于杂交封闭
