紫外-可见分光光度法测定汉麻果胶中总皂苷的含量
摘要：目的建立汉麻果胶中总皂苷含量的测定方法。方法以蕨麻苷Ⅱ号为对照品，5％香草隆冰醋酸和高氯酸的混合溶液为显色剂，采用紫外分光光度法在500衄处测定汉麻果胶总皂苷的含量。结果蕨麻苷Ⅱ号检测浓度在70～177ug与吸光度呈良好的线性关系(r=0.9993)；平均加样回收率为99.0％，RSD=1.7％(n=6)。结论本方法简便，可操作性强，灵敏度高，是汉麻果胶总皂苷含量测定的一个切实可行的方法，为汉麻果胶有效部位的进一步研究提供依据。 关键词：汉麻果胶；总皂苷；蕨麻苷Ⅱ号；紫外-可见分光光度法 1仪器和试药
CarySO Bio紫外可见分光光度计(Varian AustraliaP1、Y LTP)；AL204电子分析天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；R501B旋转蒸发器；硅胶G板(规格：100 mm×200 mm，)；
冰醋酸、高氯酸、甲醇等均为分析纯；香草醛为化学纯。汉麻果胶(取自鲜茎皮杆分离和干茎皮杆分离时脱下的粉状物质，云南军用汉麻材料研究中心)；蕨麻苷II(第302医院中药研究所制备并鉴定，其化学名称为：2α，3β，19β-三羟基-乌苏酸-28-O-β肛毗喃半乳糖苷，经HPLC归一化法计算纯度>98％)。
2方法
2.1对照品的选取
目前国内尚无汉麻果胶皂苷类成分的法定对照品，因此本实验对对照品的选取进行了研究。将汉麻果胶醇提液用D101大孔树脂进行初分离，依次用水，30％、70％、80％和95％的乙醇进行梯度洗脱，各洗脱液浓缩至干，加甲醇溶解，进行薄层层析，结果显示，当以本实验室自行分离制备的蕨麻苷Ⅱ为对照品时，经三氯甲烷一甲醇(8．5：1．5)展开之后，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇，于105℃加热至斑点显色清晰，发现在品值为0.32处，95％洗脱液部分与对照品出现相同的蓝紫色斑点，说明原药中存在与对照品相同或结构类似成分，因此选取蕨麻苷Ⅱ为对照品。 2.2对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的蕨麻苷Ⅱ对照品7 mg，置于2 mL容量瓶中，加甲醇
定容，摇匀，使含蕨麻苷Ⅱ的浓度为3.5 mg·mL-1。 2.3供试品溶液的制备
称取汉麻果胶粉末1 kg，分别加入8、5、4倍量80％乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并3次滤液，于旋转蒸发仪上(65～70℃)回收溶剂至无醇味，加乙醇至含醇浓度为30％(相当于含有0.4 g原生药·mL-1)，静置24 h，取上清液50 mL转移至蒸发皿中蒸干溶剂，用甲醇溶解，溶液转移至250 mL容量瓶中，并用甲醇定容，称重，超声20 min，放冷，再称重。用甲醇补足重量，摇匀，用0．45 um微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。 2.4最大测定波长的选择
精密吸取对照品溶液25uL，供试品溶液200uL和甲醇25uL，分别置于10 mL具塞试管中，挥干甲醇，精密加入新配制的5％香草醛一冰醋酸与高氯酸混合溶液(2:8)2mL，密塞，摇匀。置于70℃水浴中加热15 min，取出立即用冰水冷却终止反应，精密加入乙酸乙酯5.0 mL稀释，摇匀，直接检测，以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版第二部附录IVA)于400～800nm波长内进行扫描，结果对照品和供试品均在可见光区500 nm处具有最大吸收峰，故确定500nm作为测定波长，结果见图1。
2.5标准曲线的绘制
分别精密吸取蕨麻苷Ⅱ对照品溶液20、25、30、35、40、45、50uL，置于10 mL具塞试管中，挥干甲醇，按“2．4”项下方法操作，以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版第二部附录ⅣA)在500 nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标。蕨麻苷Ⅱ浓度C(ug)为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：A=0.0046C-0.1436，r=0.999 3，吸光度与浓度在70～177ug呈良好的线性关系。
3方法学考察 3.1精密度试验
精密吸取对照品溶液25uL。置于10nlL具塞试管中，按照“2．4”项下方法，连续测定6次，RSD为2.0％，结果表明仪器的精密度良好。 3.2重复性试验
取同一批汉麻果胶供试液5份，按“2．4”项下方法重复测定，RSD为0.78% (n=5)，表明该方法的重现性较好。 3.3稳定性试验
精密量取供试液0.5 mL，按“2．4”项下方法测定，每10min测定一次吸光度值，结果表明，在测定波长不变的情况下，吸收值在20 min内相对稳定，RSD=2.5％。 3.4加样回收试验
精密量取已知含量的汉麻果胶样液6份，分别加入一定量的蕨麻苷Ⅱ对照品溶液，按“2．4”项下方法测定，计算回收率，测得平均回收率为98.9％，RSD为1.2%(n=6)，结果见表1。
4样品含量测定
精密吸取供试液0.3 mL平行3份，置于10 mI。具塞试管中挥干溶剂，按照“2．4”项下方法测定，按下式计算总皂苷含量，结果见表2。
W(％)=(250×C)／(0.3×20)x 100，式中W(％)为汉麻果胶中总皂苷含量，C为总皂苷(以蕨麻苷Ⅱ计)的含量(g)。 5讨论
皂苷类可溶于水，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不溶或难溶于乙醚、苯和石油醚等极性较小的有机溶剂，皂苷类一般含有较多的羟基、羧基等极性基团，亲水性较强，因此常采用醇的水溶液为提取溶剂，本实验选用80％的乙醇作为提取溶剂。
汉麻果胶中含有大量的叶绿素，叶绿素的存在给定性和定量工作带来了一定的干扰，传统方法常用石油醚回流提取除去叶绿素，但使用该种方法石油醚消耗量大，同时由于石油醚属于易燃物，操作存在一定的危险性，鉴于上述原因，在制备供试液过程中，我们选用在醇提浓缩之后，加入30％醇沉。并置于冰箱中静置24 h，该方法能将大部分叶绿素除去。
总皂苷的含量测定方法有一般分光光度法和高效液相色谱法，高效液相色谱法重现性和稳定性等指标均较好，但仪器费用昂贵，操作复杂，本试验采用紫外可见分光光度法测定汉麻果胶总皂苷的含量，该方法简便、准确，为汉麻果胶中总皂苷的定量分析提供了快速、准确、有效的分析方法。
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