感受态细胞制备和细菌的转化
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
(a) 从冻存管中挑取细胞在LB培养基平皿上划线接种后过夜培养；
(b) 挑取单克隆菌落至5 ml LB培养基中，37℃，220 r/min振荡培养过夜；
(c) 把菌液按1:100(视浓度而定)转接入50 ml LB液体培养基内，37℃, 200 r/min
培养至OD600≈0.5 (大约3小时)，此时菌液呈现半透明、云雾状；
(d) 把菌液冰浴冷却10-15 min；
(e) 于4 ℃，4000 r/min，离心10 min；收集菌体;
(f) 用30 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2）重悬细胞沉淀，于冰上操作；
(g) 4 ℃，4000 r/min离心10min；
(h) 每50 ml初始培养物用2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaC12重悬细胞沉淀；
(i) 加入860μl 50%甘油，混匀，按50μl/管分装于1.5 ml无菌离心管中，液氮速冻，-80℃保存。
大肠杆菌的热激转化
A. 取出感受态细胞置于冰上融化，加入5μL连接产物，在冰上放置15min；
B. 将离心管放置42℃水浴，热击90s后，迅速将离心管转移至冰浴，放置1-2min；
C. 每管加700μL LB（或SOC）液体培养基，于37℃摇床220 rpm温育60min；
D. 4000r/m室温下离心5min，弃上清，菌体用剩余的50μL液体重悬菌体，涂布于含相应抗生素的LB的固体培养基上；
E. 倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜(12-16 h)。
农杆菌感受态细胞制备
(a) 养
从冻存管中挑取农杆菌在YEP培养基(含50mg/L Rif)平皿上划线接种后过夜培
(b) 过夜;
挑取单菌落接种于5 ml含50mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，振荡培养
(c) 取2m1菌液转入50 ml YEP液体培养基(含50mg/L Rif)中，继续培养至OD
值为0.3～0.4;
(d) 转入无菌离心管，冰浴30min，4℃，5000 r/min离心10min;
(e) 弃上清，用30ml的冰预冷的0.15M NaCl重悬农杆菌沉淀。然后5000r/min，
4℃离心10min。
(f) 弃上清用2ml的冰预冷的20mM CaCl2重悬农杆菌沉淀。
(g) 加入860μl 50%甘油，混匀，每份50μl分装于1.5 ml无菌离心管中，液氮速
冻，-80℃保存。
