实验二 植物化学成份的鉴别方法
07食品营养2 200730600630 张颖芬
一、实验目的
1.掌握各类植物常见化学成分的鉴别方法 2.了解不同植物间的不同化学成分的组成情况
二、实验步骤
一、生物碱的鉴别 1．检品溶液的制备：
取粉碎的植物样品大黄约2g，加蒸馏水20~30ml，并滴加数滴盐酸，使呈酸性。在60℃水浴上加热15分钟，过滤，滤液供作以下试验。 2．生物碱类成分的鉴别：
生物碱类成分（除有少数例外）均与多种生物碱沉淀试剂在酸性溶液（水液或稀醇液）中产生沉淀反应。操作如下：
（1）取上备酸水浸液四份（每份1 ml左右即可）,分别滴加碘-碘化钾﹑碘化汞钾试剂﹑碘化铋钾试剂﹑硅钨酸试剂。若四者均有或大多有沉淀反应，表明该样品可能含有生物碱，再进行下试验，进一步识别。
（2）取上备其余酸水浸液，加适量Na2CO3溶液使呈碱性，置分液漏斗中，加入乙醚约10ml振摇，静置后分出醚层，再用乙醚3ml，如前萃取，合并醚液。将乙醚层置分液漏斗中，加酸水液10ml振摇，静置分层，分出酸水液，再以酸水液5ml如前萃取，合并酸水液，分为四份分别作以下沉淀反应。
a．碘化汞钾试剂（Mayer试剂）：酸水提液滴加碘化汞钾试剂，产生白色沉淀。 b．碘化铋钾试剂（Dragendorff试剂）：酸水提液滴加碘化铋钾试剂，产生桔红色或红棕色沉淀。
c．碘-碘化钾试剂（Wagner试剂）：酸水提液滴加碘-碘化钾试剂，产生棕色沉淀。
d．硅钨酸试剂：酸水提取液滴加硅钨酸试剂产生淡黄色或灰白色沉淀。
此酸水提液与以上四种试剂均（或大多）产生沉淀反应，即预示本样品含有生物碱。
（3）备注：以上（1）、（2）沉淀反应结果：沉淀的多少以“+++”，“++”，
“+”表示，无沉淀产生则以“—”表示。若（1）项试验全呈负反应，可另选几种生物碱沉淀试剂（可参考有关资料）进行试验，若仍为负反应，则可否定样品中有生物碱的存在，不必再进行（2）项试验。 二、苷类的鉴别
（一）苷的一般鉴别反应 1．检品溶液的制备：
中草药水浸液：取粉防己中草药碎块或粉末2g，加蒸馏水约20ml，70℃水浴，浸提10分钟，过滤，滤液供鉴别用。
中草药醇浸液：取中草药碎块或粉末少许于试管中，加95%乙醇10ml，在温水浴上浸渍10分钟，过滤，滤液供鉴别用。 2．鉴别试验：
（1）-萘酚试验（Molish）反应
取醇浸液1ml，加10%-萘酚醇液1滴，摇匀，沿管壁缓慢加入浓H2SO4 10滴，不振摇，观察两液介面间是否出现紫红色杯（此反应检识糖、苷类化合物，反应较灵敏。若有微量滤纸纤维或中草药粉末存在于溶液中，都能产生上述反应，故在过滤时应加以注意）。
（2）水解反应：
取水浸液3ml于试管中，加10%HCl 1ml沸水浴加热20分钟，观察是否有絮状沉淀产生。
（3）碱性酒石酸铜（斐林试剂Fehling’s test solution）试验 取水浸液2ml，加入新配制的斐林试剂（甲+乙等量混合）1ml，沸水浴加热数分钟，如产生红色的氧化亚铜沉淀，则行过滤，滤液中加10%HCl调成酸性，置水浴上加热10分钟。进行水解，如有絮状沉淀则滤去。然后用10%NaOH中和，再加入斐林试剂1ml，置沸水浴上加热5分钟，观察是否有黄色，砖红或棕色沉淀产生？（此反应试多糖，苷类）从反应结果说明供试中草药中是否含有苷？（此试验法亦可采用同体积同浓度的中草药浸液两份，一份先经酸水解过滤碱化后，另一份再同时进行如上的还原反应，对比生成的氧化亚铜量，两份是否有差异来判断，具体方法见系统预试实验）。
注：中草药对苷的一般鉴别是正反应，还可进一步作个别苷类的鉴定。具体方法如后。
（二）蒽苷的鉴别 1．检品溶液的制备：
取大黄粉末2克，加乙醇20ml，在沸水浴上回流浸提10分钟，过滤供鉴别用。
2．鉴别试验：
（1）与碱成盐显色反应（Borntrager反应）：取1ml乙醇提取液，加入1ml 10% NaOH溶液，如产生红色反应，加入少量30%过氧化氢液，加热后红色不褪，加酸使呈酸性时，则红色消褪再碱化又出现红色。
注：或取大黄粉末少许，置小试管中，加水1~2ml，加浓H2SO4 2—3滴，置水浴中加热10分钟，冷却，加乙醚1—2ml振摇。用吸管吸取醚液（黄色）于另一洁净试管中，加入NaOH试液1ml振摇，则醚层应褪为无色，碱层（下层）为红色，示有蒽醌类成分存在，如供试的中草药在以上试验中碱水层仅现黄色，可分出碱水溶液，置试管中，加30%H2O2溶液1~2滴，在沸水浴中加热数分钟，混液如能转为橙红色，说明中草药中可能有蒽酚类成分存在。
（2）园形滤纸层析： 样品：大黄醇浸液
显色：1）于自然光下观察色带 2）于紫外光下观察荧光环
3）氨熏，观察是否出现红色环，再置uv下观察荧光环
4）喷0.5%MgAC2甲醇液，于90℃烘5分钟，是否出现橙红或紫红色环。 （三）黄酮苷的鉴别
1．检品溶液的制备：
取槐花米约1克压碎于试管中加乙醇10~20ml在水浴上加热20分钟。过滤，滤液供以下试验。
2．鉴别试验：
①取醇浸液2ml，加浓盐酸2~3滴及镁粉少量，放置（或于水浴中微热），产生红色反应。
②取醇浸液1ml，滴加pbAC2溶液数滴，产生黄色沉淀。 ③纸片法：
将醇浸液滴于滤纸上，分别进行以下试验：
①先在紫外灯下观察荧光，然后喷1%AlCl3试剂，再观察荧光是否加强。 ②氨熏后出现黄色，棕黄色荧光斑点。
与氨接触而显黄色，或者原呈黄色，但与氨接触后黄色加深，滤纸片离开氨蒸气数分钟，黄色或加深后的黄色又消褪。
③喷以3%FeCl3乙醇溶液，出现绿、兰或棕色斑点。 （四）皂苷的鉴别 1．检品溶液的制备：
1）取皂角碎块1g于大试管（或小烧杯）中，加蒸馏水15ml，于30~90°水浴上浸渍15分钟后过滤，滤液供鉴别用。
2）取薯蓣碎块0.5g加上法同样制备得薯蓣水浸液。
3）取薯蓣碎块0.5g于大试管或小锥形瓶中加95%乙醇10ml于水浴上温浸15分钟，滤液供鉴别。 2．鉴别试验：
（1）泡沫试验：薯蓣浸液，皂角浸液各2ml，分别置于试管中。用力振摇一分钟后放置，在10分钟内观察二管是否都有持久性泡沫产生？
（2）醋酐浓硫酸试验（Liebermann-Burchard反应），皂角浸液5ml，于蒸发皿中在水浴上蒸干，加入1ml醋酐使其溶解，滴于干燥比色盘中，从边沿缓缓滴加浓硫酸1滴，观察颜色变化。
另取薯蓣浸液5ml，置于蒸发皿中，在水浴上蒸干，加入1ml醋酐溶液，并倾入比色盘中，（试管）沿管壁加入几滴浓硫酸，观察界面间是否有紫红色环产生？
（3）氯仿—浓硫酸试验（Salkowski反应）：取薯蓣醇浸液2ml，在水浴上蒸干，有氯仿1ml溶解，转入干燥小试管中，沿壁小心加浓硫酸1ml，氯仿层显红色或蓝色，硫酸层有绿色荧光，示含甾体皂苷。 （五）氰苷的鉴别
取苦杏仁4~5粒，研碎，置50ml锥形瓶中加入3ml。 5%硫酸溶液，充分混合，塞好，进行以下（1）、（2）反应。
（1）苦味酸钠试验：取滤纸条先滴加饱和苦味酸液侵润，稍干后，再滴加10%碳酸钠1~2滴润湿，干后，悬于上述锥形瓶中，在水浴上加热10分钟，滤纸渐变为橙色或砖红色。
（2）取滤纸条先滴加3~4滴愈创木树酯醇溶液润湿，干后，再滴加1%硫酸钠液3~4滴润湿后，悬于同一锥形瓶中，放置，滤纸条渐变为鲜蓝色（放置过入色渐褪）。
（3）亚铁氰化铁反应（普鲁士兰反应）：另取苦杏仁一粒研碎，放入试管中，加水1~2滴润湿（切勿过量），立即用已被10%NaOH试剂1滴湿润的滤纸条悬于管口置50℃水浴上约10分钟，将滤纸取出，于滤纸上加10%FeSO4液1滴，加10%HCl1~2滴及1%FeCl3，试液1滴即显蓝色。 四、挥发油的定性鉴别 1．外观性状：
（1）取各种挥发油（松节油、薄荷油、丁香油）观察其色泽，是否有特殊香气，及辛辣烧灼味感。
（2）挥发性：取滤纸一小块，滴加薄荷油一滴，放置2小时或微热后观察滤纸上有无清晰的油迹（与菜油作对照实验）。
（3）pH检查：（检游离酸或酚类）。
取样品一滴加乙醇5滴，以预先用蒸馏水湿润的广泛pH试纸进行检查，如显酸性，示有游离的酸或酚类化合物，剩下的样品乙醇液供下面（7）（8）试验用。
（4）FeCl3反应（检酚类）：
取样品一滴，溶于1ml乙醇中，加入1%得FeCL3醇液1~2滴，如显蓝紫或绿色，示有酚类。
（5）苯肼试验（检酮、醛类）
取2，4—二硝苯肼试液0.5~1ml，加1滴样品的无醛醇溶液，用力振摇，如有酮醛化合物，应析出黄一橙红色沉淀，如无反应，可放置15min后再观察之。
（6）荧光素试验法：
将样品乙醇液滴在滤纸上，喷酒0.05%荧光素水溶液，然后趁湿将纸片暴露在5%Br2/Col4蒸汽中，含有双键的萜类（如挥发油）呈黄色；背景很快转变为浅红色。
（7）香荚醛——浓硫酸试验：
取挥发油乙醇液一滴于滤纸上，滴以新配制的0.5%香荚醛的浓硫酸乙酸液，呈黄色、棕色、红色或蓝色反应。
五、鞣质类化合物的鉴别 1．检品溶液的制备：
取五倍子（含可水解鞣质），儿茶（含缩合鞣质），没食子酸（鞣质水解产生伪鞣质）少量（约0.1克）分别置大试管中，加蒸馏水约10ml，加热煮沸，过滤，滤液作以下试验：
2．鞣质的一般反应（鞣质与伪鞣技的区别鉴定）
（1）感观试验：取制备的鞣质和伪鞣质溶液，尝其味，并以石蕊试纸检查溶液是否呈酸性反应。
（2）三氯化铁反应：取制备的鞣质溶液（五倍子溶液或儿茶溶液）及伪鞣溶液（食子酸溶液）各1~2ml ，分别加入三氯化铁试液,鞣质产生绿色或兰黑色反应或沉淀;伪鞣质产生蓝色反应。
（3）沉淀蛋白反应：取鞣质溶液和伪鞣质溶液各1~2ml，分别入明胶溶液数滴，鞣技立刻产生沉淀反应。 3．可水解鞣和缩合鞣质的区别鉴定
（1）鞣红反应：取五倍子浸液（含可水解鞣质），儿茶浸液（含缩合鞣质）各2ml，分别加盐酸0.5ml，加热煮沸30分钟左右放冷。可水解鞣质不发生沉淀，缩合鞣质有红色沉淀产生。
（2）三氯化铁反应：取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加入三氯化铁试液数滴，可水解鞣质显蓝色或黑蓝色反应，缩合鞣质显黑绿色反应。
（3）溴水反应：取五倍子浸液用儿浸液各1~2ml，分别加入溴水数滴，可水解鞋帽质不产生沉淀反应，缩合鞣质产生沉淀。
（4）石灰水反应：取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加入新制石灰水数滴，可水解鞣质显青灰色沉淀，缩合鞣质显棕色沉淀。
（5）醋酸溶液中与醋酸铅反应：取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加醋酸液数滴，摇匀后再分别滴加醋酸铅溶液数滴，可水解鞣质产生絮状沉淀，缩合鞣质无沉淀产生。
三、实验结果记录
1生物碱的鉴别（大黄）
表1 生物碱鉴别结果
碘-碘化钾
现象
由棕色变成黑色，有黑色
沉淀
由棕色变黑色，有黑色沉
淀
由棕色变黑色，有黑色沉
淀
有少量棕色沉淀
程度 + + +
碘-碘化汞钾 + +
碘-碘化铋钾 硅钨酸
+ +
表2
加Na2CO3后，溶液变棕黑色，经乙醚萃取和酸处理后得浅黄色溶液。
碘-碘化汞钾 碘-碘化铋钾 碘-碘化钾 硅钨酸
2苷类的鉴别
2.1苷的一般鉴别反应（粉防己）
（1）-萘酚试验（Molish）反应 取粉防己醇浸液1ml，加10%-萘酚醇液1滴，摇匀，沿管壁缓慢加入浓H2SO4 10滴，不振摇，两液介面间出现紫红色杯。
（2）水解反应：
取粉防己水浸液3ml于试管中，加10%HCl 1ml沸水浴加热20分钟，有絮状沉淀产生。
（3）碱性酒石酸铜（斐林试剂Fehling’s test solution）试验 取粉防己水浸液2ml，加入新配制的斐林试剂（甲+乙等量混合）1ml，沸水浴加热数分钟，产生红色的氧化亚铜沉淀，过滤，滤液中加10%HCl调成酸性，置水浴上加热10分钟。进行水解，有絮状沉淀，滤去。然后用10%NaOH中和，
现象 棕黑色沉淀 红棕色沉淀 棕色沉淀 淡黄色沉淀
程度 + + + + + +
再加入斐林试剂1ml，置沸水浴上加热5分钟，砖红沉淀产生。 2.2蒽苷的鉴别（大黄）
表3 与碱成盐显色反应
大黄醇浸液 加NaOH 再加H2O2，加热 补加HCl 再加NaOH
表4 圆形滤纸层析
大黄醇浸液 氨熏处理 MgAC2甲醇液处理
2.3黄酮苷的鉴别（槐花米）
表5 黄酮苷鉴别实验结果
槐花米醇浸液 加浓盐和镁粉，水浴
加PbAC2
表6 纸片法鉴别结果
槐花米醇浸液 1%AlCl3 氨熏
自然光色带
黄色 黄色 黄色加深
UV色带 黄色 黄色荧光加强 黄色斑点 现象 黄色 变红色 现象不明显
自然光色带 黄色 黄色 黄色
UV色带 黄色 红色环 橙色环 现象 棕黄色 红色 红色不褪 红色慢慢消褪 红色出现
氨熏后放置数分钟 3%FeCl3乙醇液
黄色 黄绿色
黄色 绿色斑点
2.4皂苷的鉴别（皂角和薯蓣）
表7 泡沫试验结果
振荡处理 薯蓣浸液 皂角浸液
表8 醋酐浓硫酸试验
蒸干，加醋酐，加浓硫酸处理
薯蓣浸液 皂角浸液
表9 氯仿-浓硫酸试验
蒸干，氯仿溶解，加浓硫酸处理
薯蓣醇浸液
2.5氰苷的鉴别（北杏）
（1）苦味酸钠试验：滤纸渐变为黄色。
（2）亚铁氰化铁反应（普鲁士兰反应）：滤纸显蓝色。
3挥发油的定性鉴别
表10 各种挥发油定性实验结果
色泽 是否有特殊香味
松节油 无色透明 味淡
薄荷油 浅黄色 薄荷味
丁香油 棕黄色 风油味 现象
分层，有气泡产生，上层有绿色荧
光，下层显浅红色
现象
界面有紫红色环产生 与浓硫酸接触后变紫红色
持久性泡沫
有 有
挥发性差，放置1小时后还有油
挥发性
挥发性强
迹，油迹直径
挥发性较差，放置1小时后还有油迹，油迹直径
1.2CM，热烘1分2.7CM，热烘1分钟完全挥发
PH FeCL3 苯肼 荧光 香荚醛
4、鞣质类化合物的鉴别
表11 鞣质化合物鉴别结果
PH 属性 FeCl3反应 沉淀蛋白反应
属性 鞣红反应 溴水反应 石灰水反应 醋酸与醋酸铅反应
五倍子 5 鞣质 黑蓝色 白色沉淀 可水解鞣质 无沉淀 无沉淀 青灰色沉淀 絮状沉淀
儿茶 6 鞣质 墨绿色 —— 缩合鞣质 红色沉淀 沉淀 棕色沉淀 无沉淀
没食子酸
4 伪鞣质 蓝色 无沉淀 —— —— —— —— ——
5~6 黄色浑浊 无变化 浅红 黄色
5~6 深黄色透明 分层，下层粉红
色沉淀 浅红 棕色
钟完全挥发
5~6 深蓝色沉淀 乳黄色沉淀 浅红 蓝色
四、实验分析与讨论
1、大多数生物碱均几乎不溶或难溶于水。能溶于氯氯仿、乙醚、酒精、丙酮、苯等有机溶剂。也能溶于稀酸的的水溶液而成盐类。生物碱的盐类大多溶于水。因此，提取植物生物碱的时候，我们需要滴加数滴盐酸使它变成
水溶性的盐类，这样过滤后我们就能得到生物碱的盐类溶液。
2、生物碱（alkaloid）是存在于自然界（主要为植物，但有的也存在于动物）中的一类含氮的碱性有机化合物，常压时绝大多数生物碱均无挥发性，主要以有机酸盐、无机酸盐、游离状态、酯、苷等存在形式。 3、从氨熏和MgAC2的荧光观察可以鉴定蒽醌类化合物。
4、盐酸－镁粉反应原理：一般黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类成分在乙醇或甲醇溶液中可被还原成红色至紫红色，个别的显蓝或绿色（如7、3′、4′－三OH二氢黄酮）。而异黄酮不显色。此反应可用于鉴识黄酮类化合物，也可鉴识某提取物或提取液中是否含有上述黄酮类成分。
5、黄酮苷能与金属盐类试剂进行络合反应，共轭加强，并有荧光。 6、皂苷的化学结构中，由于苷元具有不同程度的亲脂性，糖链具有较强的亲水性，使皂苷成为一种表面活性剂，水溶液振摇后能产生持久性的肥皂样泡沫。
7、强氧化性酸的条件下，氧化脱氢，形成共轭体系，因而皂苷有显色反应。醋酐-浓硫酸（liebermann-burchard）反应： 可用以区别甾体皂苷和三萜皂苷，甾体皂苷最后呈蓝绿色，三萜皂苷最后呈红色或紫色。
8、构成挥发油的成分主要是单萜、倍半萜及其含氧化物，如薄荷油——含薄荷醇（menthol）8%左右。还有芳香族化合物和脂肪族化合等。荧光素试验法中可以观察到是否含有萜类化合物。
9、从FeCl3反应，苯肼试验中可以看出丁香油里面含有酚类，酮或醛类物质，而薄荷油里面则含有酮或醛类物质，松节油两者都没有。
