高效液相色谱法测定饲料中黄霉素含量

试验研究

养殖与饲料2022年第08期

高效液相色谱法测定饲料中黄霉素含量

郑

蓉，钭丽敏，鲁丁丁

钛和检测认证集团股份有限公司，上海200060

摘要［目的］建立饲料中黄霉素含量的准确定性定量检测方法。［方法］样品采用甲醇溶液提取，正己烷去脂净化，提取液过膜经C18色谱柱分离后，用配有紫外检测器的液相色谱仪进行检测，外标法定量。［结果］黄霉素在1.0~100μg/mL范围内线性关系良好，相关系数＞0.995，在2、10、50mg/kg3个水平下进行添加试验考察方法的有效性，饲料中添加不同浓度黄霉素的平均回收率为83.9%~88.2%，相对标准偏差（RSD）为4.40%~10.20%，方法的检测限为1.0mg/kg，定量限为2.0mg/kg。［结论］本试验样品前处理简单易操作、准确度高，可为相关养殖企业开展饲料中黄霉素的监测提供参考。

关键词高效液相色谱；饲料；黄霉素；残留检测

TiTesting驭CertificationGroupCo.，Ltd，Shanghai200060，China

flavomycincontentinfeed.[Methods]Flavomycininsampleswasextractedbymethanoldefattedwith

[Objectives]Establishanaccuratequalitativeandquantitativedetectionmethodof

solutionand

ZHENGRong，DOULimin，LUDingding

4.40%to10.20%，andthemethoddetectionlimitwas1.0mg/kg，andthequantificationlimitwas2.0mg/kg.[Conclusions]Thepretreatmentofsampleinthistestwassimpleandeasytooperatewithhighaccuracy，whichwasprovidedreferenceforrelatedbreedingenterprisestomonitorflavomycininfeeds.

highperformanceliquidchromatography;feeds;flavomycin;residuesdetection;

differentconcentrationsinthefeedwas83.9%to88.2%，therelativestandarddeviation

oftheadditionmethodwastestedatthreelevelsof2，10and50mg/kg.Theaveragerecoveryof

Itwaswellrelatedlinearlyfrom1.0to100滋g/mL，withcorrelationcoefficient>0.995.Theeffectiveness

(RSD)was

-hexane.ThelowerwascleanedthroughthemembraneanddeterminedbyHPLC.[Results]

黄霉素（Flavomycin）又称为斑伯霉素、默诺霉素A，是从灰绿链霉素菌（斑伯氏链丝菌）的发酵产物中分离的磷酸多糖类抗生素。黄霉素主要是通过

收稿日期：2022-03-24作者简介：郑

蓉，女，1977年生，工程师。

干扰构成细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成而抑制细菌的繁殖[1]，对大多数的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有效。在水产养殖中的主要作用是通

养殖与饲料2022年第08期

过影响肠道细菌的滋生，使肠道菌群的代谢活动变

试验研究窑33窑

加入5mL甲醇水（体积比1颐1）溶液，振荡5min，将提取溶液转入另一离心管中，残渣按上述方法再提取1次，合并提取液。在提取液中加入5mL正己烷振荡5min，离心，去除上层，重复操作1次，下层溶液过0.45滋m水相滤膜，供高效液相色谱测定。1.3

仪器分析方法

色谱柱：AgilentSB-C18（250mm伊4.6mm，

是一种新型的抗生素类药物添加剂或促生长剂[2-5]。

得有益于动物生长，间接改善了营养的消化和吸收，50益水浴超声提取30min，4000r/min离心5min，

黄霉素至少含有5种活性成分，其主要活性组分为黄霉素A，根据农业农村部兽药质量标准中的规定，其含量应大于总活性成分的50%，因此可以通过检测样品中黄霉素A的含量来确定黄霉素用药情况。黄霉素A的检测方法多采用配有紫外检测

器的高效液相色谱仪（HPLC）或采用液相色谱-串

[6-9]，液质联用仪虽联质谱仪进行测定（LC-MS/MS）

2.5滋m）；柱温：40益；柱流速1.0mL/min；运行时间：50min；进样量50滋L；流动相为乙腈：缓冲液

）；检测波长256nm。

然灵敏度高，但价格昂贵，基层检测实验室往往难（35颐65，以配置，且因饲料中黄霉素的含量高，用液相色谱仪就能进行精准检测。本研究对黄霉素液相色谱检测方法进行研究，黄霉素药物经色谱柱分离后可用紫外检测器进行定性定量分析。该方法的建立可以提供结果准确可靠的黄霉素残留测定，为养殖企业及时检测饲料中黄霉素含量提供技术支撑。

2结果与分析

将1mg/mL的黄霉素标准储备液，用1颐1的甲

2.1方法线性范围与定量限

醇水溶液稀释成质量浓度分别为1.0、2.5、10、50、100滋g/mL的标准工作液，取50滋L标准溶液注入高效液相色谱仪中，按以上仪器条件进行分析，以黄霉素化合物的峰面积对应质量浓度做校准曲线。黄霉素药物的线性回归方程为：=6.786+4.495，相关系数为0.997。

试验测得在黄霉素加标量为1.0mg/kg时，

1材料与方法

1.1试剂与仪器

1）甲醇、乙腈、正己烷，为色谱级试剂（美国Tedia2）标准储备液：准确称取一定量的黄霉素标准3）流动相缓冲液：分别准确称取3.0g庚烷基

公司），其余为分析纯试剂。黄霉素标准品（99%，中国兽医药品监察所）。

仪器信噪比跃3；加标量为2.0mg/kg时，仪器信噪比跃10，同时回收率跃70%，精密度臆15%，因此将1.0mg/kg确定为方法检测限，2.0mg/kg确定为定量限。

2.2方法回收率与精密度

在阴性饲料样品中添加3个水平的黄霉素标准溶液进行回收率试验，每个加标水平做6个平行88.2%，相对标准偏差为4.40%~10.20%（表1），空白饲料样品加标样品色谱图见图1。

样。测定结果显示，平均添加回收率为83.9%~

品，分别用体积比1颐1的甲醇水溶液超声溶解，配置成1mg/mL的标准储备液。

磺酸钠、l5.5g磷酸氢二钾、1.0g磷酸二氢钾，加水溶解后稀释至l000mL，用20%的磷酸溶液调节至pH值为7.0依0.1。

4）Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦

公司），配有紫外检测器，CF16RX域型离心机（HI原TACHI公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1.2

样品处理方法

3讨论

1）提取方法的选择。黄霉素为有机弱酸，易溶

平均回收

1.717.5444.551.847.9245.66率/%85.583.988.2称取（5.00依0.05）g样品于50mL离心管中，

表1饲料样品中添加黄霉素的平均回收率和精密度

添加质量浓度（/mg/kg）

2.01.6311.7123实测值（/mg/kg）

4精密度/%4.405.2510.050.09.4447.58.2740.99.5343.21.641.727.6942.810.20

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试验研究养殖与饲料2022年第08期

液，用5mL正己烷去脂2遍，下层溶液上机测定，99.6%，几乎没有损失。因此，可以采用在提取液中

2）仪器条件的优化。选择高效液相色谱法较为常来考察正己烷去脂带来的损失，结果回收率为

于水，因此确定将有机溶剂与水混合后作为提取

剂。同时，采用加热超声的方法能使溶剂完全渗透饲料肌肉组织，促进黄霉素的溶出。本试验分别用纯甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水和70%甲醇水作为结果回收率分别为58.2%、77.4%、89.3%、82.7%，

加入正己烷进行液液萃取的方法对样品提取液进

提取剂，在50益加热超声30min，比较提取效率，行净化。50%甲醇水溶液提取效率略高。此外，考虑到水相比

50%甲醇水溶液提取。

例高的情况下，用正己烷去脂效果更好，确定采用

由于饲料样品中含有脂肪，需要对提取液净

SB-C18色谱柱上能获得理想的分离效果，再采用2

用的C18柱作为色谱柱，结果发现黄霉素在Agilent种仪器条件进行分析。A的流动相采用药典中推荐的0.2%甲酸铵与乙腈以45颐55的体积比混合，紫外吸收波长为258nm。B的流动相采用离子对试剂庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾与磷酸氢二钾的混合液与洗脱能力较强的试剂乙腈以35颐65的体积比混合。按B方法分析的黄霉素峰形更好，稳定性好，同时有效

化，常用的样品净化方法包括液液萃取和使用固相萃取柱等，黄霉素药物结构中有羟基，可以采用阴离子柱或C18柱固相萃取净化的方法，但是过柱净化时间较长，操作步骤复杂。因此，利用黄霉素药物不易溶于正己烷的性质，采用液液萃取的方式。试验采取在50%的甲醇水溶液中添加黄霉素标准溶

成分黄霉素A与其他组分完全分离（图1）。庚烷磺酸钠在水中电离成庚烷磺酸钠负离子，与胺类电离

图1饲料空白样品中添加10mg/kg黄霉素的色谱图

成的胺正离子结合，黄霉素分子中含有胺基，与庚烷磺酸钠形成离子对，使各组分间得到很好分离。黄霉素在流动相中完全电离受pH值及离子对试剂浓度影响较大。本试验对流动相的pH值、离子对试剂浓度、流速以及配比均进行了优化，最后确定最佳仪器条件。

本试验通过对色谱条件的优化和样品前处理方法的筛选，建立了饲料中黄霉素残留量的高效液相色谱方法，该方法操作简便，准确度和精密度均能满足方法要求，可实现对饲料中黄霉素残留含量的快速检测。

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【责任编辑：胡敏】