一、前言
对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过性内切酶处理以后，再克隆到用相应性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物时，在引物的)!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后，将PCR产物用相应的性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上[1]。这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则有可能切断PCR产物。
近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4DNA聚合酶补平，另一种是T-A克隆法。其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一。但是，在采用T-A克隆法时，随
着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。有的学者针对不同长度的PCR产物尝试了不同的T-A克隆法，并且对其克隆效率进行了比较，对不同长度的PCR产物提出了相对优化的克隆法。结果表明，对于较短的PCR产物500bp左右），采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率；对于中等长度的PCR产物(3000bp左右)，用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率；对于较长的PCR产物（6000bp左右），用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率[2]。
二、材料与方法
2.1材料
实验材料：
新鲜的团头鲂肝脏、Trizol、氯仿、异丙醇、75%酒精（用DEPC水和无水乙醇配制）、DEPC水、琼脂糖、LoadingBuffer、无RNA酶的头（1mL、200μL、10μL）、无RNA酶的1.5mL离心管、（1mL、200μL、10μL）移液、反转录酶、RNA酶抑制剂、oligo引物、反转录buffer、10mmol/LdNTP、无RNA酶的10μLPCR管、无菌水、buffer、正向和反向引物、模板、rTaq、dNTP、无菌10μLPCR管、DNA纯化试剂盒、pMD18-T、感受态细胞、LB液体培养基（含氨苄和不含氨苄）、无菌头（1mL、200μL、10μL）、无菌0.5mL离心管
2.2方法
实验流程新鲜肝脏组织
mRNA
cDNA
2.2.1RNA提取
（1）先向玻璃匀浆器中加1mLTrizol并放在冰上预冷，取约30-100mg新鲜组织至匀浆器中，迅速匀浆至无可见组织块。将匀浆液转移至2ml离心管中，室温静置5min。
（2）向离心管中加入200～300μL氯仿（约为RNAiso的1/5体积量），振荡混匀至液体不粘稠。室温静置5-15min。
（3）12，000g，4℃离心15min。
（4）吸取上清液至1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒数下混匀，室温静置5-10分钟。
（5）12，000g，4℃离心8min，弃上清。
（6）加入1ml75%乙醇，轻微振荡数下，12，000g，4℃离心5min，弃上清。
（7）用75%乙醇重复洗涤一次（可选）。
（8）室温干燥3-5min（不能完全干燥）。加入20~50ulDEPC水溶解，电泳检测。
2.2.2反转录PCR
1）总RNA5μL+DEPC水补充到11μL
2）20μmol/LPoly（T）引物1μL
3）稍离心后使溶液到管底后，在PCR仪上68℃孵育10min，立即将PCR管插入冰中，放置2－5min
4)继续加入以下组分：
M-MLV5_ReactionBuffer4μL
10mmol/LdNTP2μL
RNasinRibonucleaseInhibitor1μL（40u）
M-MLVReverseTranscriptase1μL（200u）
用手指轻弹PCR管底部混匀，短暂离心后42℃PCR仪中反应1h。反应结束后，可用于下一步实验，抑或保存于-20℃冰箱中备用。
2.2.3PCR
反应体系（50ul体系）：
10_buffer5ul（若5_buffer则2ul）25mMMgCl25ul
Template5ul
PrimerF2ul
PrimerR2ul
2.5mMdNTP4ul
rTaq2ul
ddH2O补足至50ul
程序设置：94℃3min
94℃30s
55℃30s30个循环
72℃30s
72℃10min
反应结束后，取2μL在浓度为1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。
2.2.4T-A克隆
1)DNA回收
电泳—切胶—胶回收试剂盒
电压电泳液
2)连接
pMD18-Tvetor0.5μL
SolutionI2.5μL
回收的DNA2-7μL（依浓度而定）
灭菌水补充至10μL
4℃or16℃连接0.5-2h。
3).转化、涂平板
①在超净工作台内将连接产物加入含有100μl感受态细胞的离心管中。反复用头轻吸2-3次以混匀。然后置于冰中30min。
②从冰中取出离心管，置于42℃循环水浴中90s（热激），然后迅速置于冰中2min。
③在超净工作台上，每个离心管加入600μlLB液体培养基（不含氨苄），放到摇床上，37℃培养60min，转速不超过100rpm。此过程主要是让细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
④常温4000rpm离心1min，吸去部分上清（大约剩100μl），留下细胞沉淀，吹匀后用玻璃棒涂布于含氨苄的平板上（50μl/个）。注：玻璃棒蘸取酒精后，在酒精灯上烤一下，要稍微放置冷却，以免太热导致细胞死亡。涂布时一定要均匀
⑤把涂布好的平板倒置于37℃恒温培养箱中，至长出肉眼可见大小合适的菌落（一般需要12-16小时）。
三、实验结果与分析
图1：团头鲂肝脏总RNA抽提电泳结果
图2：团头鲂总RNA的RT-PCR结果
图3：菌液检测结果
3.1总RNA分离
从肝脏中提取总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测可见清晰的28S，18S和
5S3条带，表明总RNA完整性良好（图1）。
3.2目的片段RT-PCR扩增和cDNA克隆
经RT-PCR扩增可得到团头鲂β-actin基因的cDNA片段（图2）。目的片段经与pMD18-T载体连接后，成功转化到大肠杆菌DH5a。阳性克隆的重组子经蓝白斑筛选，证明外源片段成功插入载体。此外，重组子经PCR鉴定，得到了与图2相同的扩增结果（图3），证明该质粒是含有外源目的片段的阳性重组子。
四、结论
部分组别成功克隆了团头鲂的β-actin基因。在进行蓝白斑筛选的过程中，可能是由于涂布菌液时玻璃刮铲余温过高且涂布的菌液过多，没有等菌液完全被培养基吸收就把培养皿颠倒过来，导致只有培养皿的边缘长出菌落，而且单个菌落较少，只有极少数培养皿长出蓝斑。把白斑接种到LB培养基中培养时，部分组别培养基仍旧澄清，可能是挑菌落时没有挑到。RT-PCR中，有的组别没有得到cDNA，可能是本次制作的凝胶太薄，在点样时，样品溢出点样孔，所以没有结果，也可能是因为操作不当导致RNA降解。
