黄芪皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫增强作用

中国免疫学杂志２ＯＯ８年第２４卷　黄芪皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫增强作用　杨小敏徐晓武①卢荷莲Ｒ３９２．１２　张天一②（浙江省温州市第三人民医院病理科，温州３２５０００）　文献标识码Ａ　文章编号１ｏｏｏ．４ｓ４ｘ（￣ｏｓ）ｏ９－ｏｓｏ４－ｏ４　中国图书分类号［摘要］　目的：研究黄芪皂苷（Ａｓ）增强巨噬细胞的免疫作用，探讨其调节机体免疫功能的机理。方法：在体外培养的　小鼠腹腔巨噬细胞中加入不同浓度的Ａｓ后，观察其对巨噬细胞一氧化氮（Ｎ０）合成及对肿瘤细胞杀伤活性的影响；透射电子　显微镜观察巨噬细胞的超微结构改变；应用激光扫描共聚焦显微术，结合特异性荧光探针Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ、观察Ａｓ引起巨噬细胞　内ｃａ２＋的变化。结果：５０～８００￣ｇ／ｎａ　ＡＳ作用细胞２４小时后，ＮＯ分泌量增加，杀瘤活性加强，且呈量一效依赖关系；４００　ｔｃ／ｎａ　Ａｓ作用细胞２４小时后，透射电子显微镜观察可见细胞表面突起增多、增粗、增长；滑面内质网、溶酶体增多；５０—８００　ｔｅ，／ｍｌ　ＡＳ　作用细胞４小时后，细胞内Ｃａ２＋的浓度升高，并与药物浓度呈正相关。结论：ＡＳ能增强小鼠腹腔巨噬细胞的免疫作用；细胞内　ｃａ２　浓度的升高可能是Ａｓ激活巨噬细胞，发挥免疫调节作用的机理之一。　［关键词］黄芪皂苷；巨噬细胞；　肝癌细胞；一氧化氮；Ｃａ２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｂｙ　Ａｓｔｒａｇａｌｓ　Ｓａｐｏｎｉｕｎ　ＹＡＮＧ　Ｘｉａｏ—Ｍｉｎ，ＸＵ　Ｘｉａｏ—Ｗｕ，ＬＵ　Ｈｅ—Ｌｉａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｔｉａｎ—Ｙｉ．Ｔｈｅ　３２５０２７．Ｃｈｉｎａ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｗｅｎｚｈｏｕ，Ｗｅｎｚｈｏｕ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｏｔｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　Ｓａｐｏｎｉｎ　ｏｎ　ｍａｃｍｐｈａｇｅｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｈｔｅ　ｎｌｅｃｈａｌ３ｉｓｍｓ　ｏｆ　ｉｔｓｉｎｕｎｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｙ　ａｄｄｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆＡＳ　ｉｎｔｏ　ｃｕｈｕｒｅｄ　ｍｉｃｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｍｐｈａｇｅｓ，ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆＡＳ　ｏｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏ　ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ＮＯ　Ｋｉｔ（ｅｎｚｙｍｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ）．ＭｑＴ　ａｓｓａｙ　Ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔＯ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｈｅｔ　ｃｙｔｏｔｏｉｃｘｉｔｙ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｉｎ—　ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡＳ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｈｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｔｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｂｙ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＬＳＣＭ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｉｃｉｆｔｙ　ｌｆｕｏｒｅｓ—　ｃｅｎｔ　ｐｒｏｂｅ　Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　Ｃａ２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡＳＲｅｓｕｌｔｓ：ＡＳ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　．ＮＯ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｅｉｌｉｌｎｃａｅ　ｔｈｅ　ｃａｐａｃｉｙｔ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｅｍｐｈａｇｅｓ　ｆｏｒ　ｃｙｔｏｔｏｉｘｃｉｙｔ　ｔｏ　ｃａｒｃｉｌｌｏｌｌｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｓ　ｏｎｆ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｍｕｈｉｐｌｉｃａｔｉｎｇ，ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｔｅｎｔｉｎｇ　ｖｉａ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ　ｉｎｔ￣ａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ＬＳＣＭ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡＳ　Ｃａｎ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｉｌｏｉｎｔｌｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ２　ｂｅ　ｏｎｅ　ｏｆｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ．　１Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ａｓｔｒａｇｌａｓ　ｓｎａｐｏｎｉｎ；Ｍａｃｍｐｈａｇｅ；　ｃｅｌｌｓ；Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ；Ｃａ２　寻找有效的生物反应调节剂，以调节和恢复患　者免疫系统的功能是当今肿瘤生物治疗领域内一个　ＡＳ）由本室按文献介绍方法提取ｌ　，　；ＲＰＭＩ１６４０　（Ｇｉｂｃｏ）；小牛血清（上海实生细胞生物技术有限公　司）；ＭＴｒ（Ｓｉｇｍａ），二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，Ｓｉｍａ进口分　ｇ装）；一氧化氮检测（酶法）试剂盒（晶美生物工程北　京有限公司）；ｎｕ０．３　ａｅｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ（　ｏ一３／ＡＭ，　重要方向。黄芪含多糖、苷、黄酮、谷甾醇、棕榈酸、　羽扇醇、联苯双脂、氨基酸及微量元素等，是目前临　床应用广泛，研究比较深入的中药。已知黄芪对免　疫系统有广泛的影响，但黄芪单一组份的作用尚待　深入研究。本实验观察了黄芪皂苷对体外小鼠腹腔　巨噬细胞免疫功能及抗瘤作用的影响，初步探讨其　作用机制。　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）；２５％戊二醛水溶液（上海升龙达生　物有限公司，进口分装）；锇酸（Ｓｉｍａ）；环氧树脂８１２　ｇ（Ｅｐｏｎ８１２）（Ｓｉｇｍａ）；环氧丙烷（Ｓｉｍａ）；十二烯基丁二　ｇ酸酐（Ｄｏｄｅｃｅｎｙｌｓｕｅｅｉｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ，ＤＤｓＡ）（Ｓｉｇｍａ）；甲　１材料与方法　１．１材料　１．１．１药物与试剂黄芪皂Ｗ，，（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　Ｓａｐｏｎｉｎ　基内次甲基四氢苯二酸酐（Ｍｅｔｈｙｌｎａｄｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ，　ＭＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）；其它均为国产分析纯。　１．１．２实验动物和细胞清洁级ＩＣＲ小鼠，８～１２　周龄，体重２２～２５　ｇ，雌雄兼用，购自南通大学医学　院动物实验中心，合格证号：ＳＹＸＫ（苏）２００２．００２２；　Ｈ２２腹水型细胞株（引自中国医学科学院上海药物研　究所）。　①通讯作者，温州医学院附属第二医院普外科，温州３２５０２７，Ｅ—ｍａｉｌ：　ｘｘｗ９１８＠１６３．ｅｏｌｌｌ　②南通大学神经再生重点实验室，南通２２６００１　作者简介：杨小敏（１９７８年一），女，硕士，住院医师，主要从事肿瘤免　疫研究。　１．１．３仪器Ｌｅｉｅａ　ＴＣＳ．ＳＰ　２激光共聚焦扫描显微　维普资讯 http://www.cqvip.com 杨小敏等黄芪皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫增强作用第９期　镜（ｔｓｃ￣ｉ，德国Ｌｅｉｅａ公司），ＲＥＶＣＯ二氧化碳培养　醇逐级脱水，Ｅｐｏｎ８１２环氧树脂包埋，半薄切片机制成　箱（Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ　ＮＣ，ＵＳＡ），高速冷冻离心机ＭＲ２３ｉ（法国　Ｊｏｕａｎ），７５４紫外可见光光度计（上海光谱仪器有限　公司），全自动酶标仪ＥＬＸ８００（Ｂｉｏ．Ｔｅｋ，ＵＳＡ），透射　电子显微镜（ＪＥＭ．１００Ｓ，ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ）。　１．２方法　２脚厚的半薄切片［引。光镜下定位，选取细胞集中　部位在超薄切片机上做超薄切片，厚度为５０　ｎＩｎ左　右。醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察。　１．２．５共聚焦显微镜检测腹腔巨噬细胞内Ｃａ２　浓　度的变化　１．２．５．１细胞培养取按１．２．１所述而得的细胞，　１．２．１小鼠腹腔巨噬细胞的制备颈椎脱位处死　小鼠，常规消毒后，注射预冷的含０．１％柠檬酸三钠　的生理盐水，收集腹腔洗液，４℃、１　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１０　分钟后弃上清，Ｄ．Ｈａｎｋｓ液洗细胞，后计数。用含　ｌＯ％ｔＪ￣牛血清ＲＰＭＩ１６４０培养液配成密度为１　Ｘ　ｌＯ６　Ｈｌｌ　的细胞悬液，在３７％、饱和湿度及５％ｃｏ２条件　培养２小时后，用Ｄ－Ｈａｎｋｓ液洗去未贴壁细胞，加　Ｏ．０４％ＥＤＴＡ作用３～７分钟后弃消化液，加预冷Ｄ—　Ｈａｎｋｓ液吹打或刮取收集贴壁细胞并计数即获得腹　腔巨噬细胞（ｐＭｃ￣）。　再调节密度为１×１０６　ｍｌ＿。，接种于９６孔培养板（每　孔１００　），培养２４小时后以不加药物组为阴性对　照，以５０、１００、２００、４００、８００￣ｇ／ｍｌ　ＡＳ分别作用于细　胞４小时后染色并上机检测。　１．２．５．２染液配制　将Ｆｌｕｏ一３／ＡＮ溶于二甲亚砜　（ＯＭＳＯ），配成１　ｍｍｏｌ／Ｌ储备液，分装冻存于一３０℃　条件下。染色前用ＨＥＰＥＳ缓冲盐溶液（１４５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａｅｌ、５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｋｅｌ、１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２、０．５　ｍｍｏｌＺＬ　Ｍｇ－　ｓｏ４、５　ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ调ｐＨ至　７．４）配成工作液。　１．２．２　ＭＴｒ比色法检测小鼠腹腔巨噬杀瘤活性　将收集所得的ＰＭ　配成１×ｌＯ６　ｍｌ　的细胞悬液接　１．２．５．３荧光探针标记吸除培养孔内的培养液，　种于９６孔培养板，每孔加１００　细胞悬液，培养２４　小时后添加ＡＳ致所需浓度（终浓度分别为５０、１００、　２００、４００．８００　ｍｌ，每个浓度重复３孔，重复三　次，以不加药物组为阴性对照），孵育２４小时后，从　用ＨＥＰＥＳ缓冲盐溶液洗３次，在培养孔中加入１Ｏ　ｐ＿ｍｏｌ／Ｌ　Ｆｌｕｏ一３／ＡｌＶｌ　３７℃孵育４５分钟，吸除染液用　ＨＥＰＥＳ缓冲盐溶液洗３次再加入ＨＥＰＥＳ缓冲盐溶　液０．１　ｍｌ，３７℃孵育３０分钟后上机。　每孔缓慢吸出上清１００　（分管保存于一２０￣Ｃ，用于　ＮＯ释放量的检测）。然后，用完全培养基洗细胞一　次，作为效应细胞。取对数生长期Ｈ　肿瘤细胞用　ＲＰＭＩ１６４０培养液配成１×ｌｏ５　ｍｌ　悬液，按效靶比　１０：１加入各孔（１００　）。以　肿瘤细胞为靶细胞，　１．２．５．４共聚焦显微镜检测：将负载好的细胞置于　激光共聚焦显微镜下，参数设置如下：Ｌａｓｅｒ　Ｐｏｗｅｒ：２０　ｍＷ、氩离子激光器，激发波长均为４８８　ｎＩｎ、检测波　长分别５３０　ｎＩｎ和５２０　ｎｉｎ，各组均以同一参数迅速扫　描３个不同的视野，从各视野中随机选取２０个细　将培养板在３７￣Ｃ，５％ｃｏ２饱和湿度下培养２４小时　后，按ＭＴｒ法，以单纯培养液孔调零点，测各孔Ａ　值，ＰＭ　的杀伤活性按下列公式计算ｌ３ｊ：　杀伤活性（％）＝［（效应细胞孔Ａ值＋靶细胞孔Ａ值）一反应孔Ａ　值］／靶细胞值Ａ值Ｘ　１００％。　胞，计算６０个细胞的平均荧光强度用于统计学分析　（荧光强度数据为Ｉ￣ｉｃａ　ｅｏｎｆｏｃａｌ　ｓｏｆｅｗａｒｅ软件对扫描　图像进行处理所得）。　１．２．６统计学方法数据用　±ｓ表示，多组样本　均数比较用单因素方差分析，组间比较用Ｓｅｈｅｆｆｅ检　验法，全部实验数据用Ｓｔａｔａ７．０软件分析。　１．２．３腹腔巨噬细胞释放一氧化氮量的检测　按　一氧化氮（Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）试剂盒（酶法）说明书操　作，测定ＮＯ释放量。取上述１．２．２所得细胞培养　上清液，每组三管，每管０．１　ｍｌ，融化后作为测定管，　取０．１　ｍｌ　１００　ｐａｎｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３作为标准管，０．１　ｍｌ试剂　２（还原酶），轻轻混匀，３７℃水浴１小时后，各管　一２结果　２．１腹腔巨噬细胞杀瘤活性随ＡＳ作用浓度的增　ｎｌ１　加，杀瘤活性不断增强，各浓度组与对照组差异显著　（Ｐ＜０．０１）。２００与４００￣ｇ／ｍｌ组、４００与８００　次加０．５　ｍｌ试剂３，０．５　ｍｌ试剂４，混匀，室温放置　组之间差别无统计学意义（Ｐ＞０．０５），其余各浓度　组之间差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），结果见表１　和图１。　ｌ０分钟后，５３０　Ｉｌｍ波长，０．５咖比色杯，空白管调　零，分别读取标准管、测定管Ａ值，按下式计算：　ＮＯ（　Ｌ）＝测定管／Ａ标准管×１００￣ｎｏｌ／Ｌ。　２．２腹腔巨噬细胞一氧化氮释放量随ＡＳ作用浓　１．２．４透射电子显微镜观察ＰＭ　超微结构改变　收集经４００￣ｇ／ｍｌ　ＡＳ作用２４小时和未经药物作用的　对照组的　，４％戊二醛前固定，１％锇酸后固定，乙　度的增加，ＮＯ释放量依次增加，各浓度组与对照组　差异显著（Ｐ＜０．０１），各浓度组之间差异均有统计　学意义（Ｐ＜０．０５），结果见表１。　维普资讯 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中国免疫学杂志２００８年第２４卷　２．３透射电子显微镜观察　超微结构改变（图１）　２．３．１对照组巨噬细胞表面可见较小、较细的突　起，细胞核呈圆形或椭圆形，局部略有凹陷，染色质　分布无异常。细胞质内糖原颗粒较少，核蛋白体可　见；线粒体界线清楚，双层膜完整；嵴突向腔内，嵴间　隙存在。粗面内质网发达，滑面内质网散在，溶酶体　少见。　２．３．２　ＡＳ（４００　７ｇ／ｎ￣）　巨噬细胞处于极度活跃状　态，细胞表面突起增多、增粗、增长，交错重叠。核呈　表１腹腔巨噬细胞杀伤活性及一氧化氮释放量　图２不同浓度ＡＳ对巨噬细胞内Ｃａ２　浓度变化的影响（×　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＰＭＯ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＯ　４ｏ）　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ＡＳ　Ｏｉｌ　Ｆｌｕｏ－３　ｆｌｕｏｒｅｓ－　ｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ（×４０）　Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．５０　ｖｇ／ｍｌ；Ｃ．１００　ＩｌｌＩ；Ｄ．２００　ｖ．ｇ／ｍＩ；Ｅ．４ＯＯ　ｔ，￣／ｍｌ；Ｆ．８００　／ｍ１．　圆形或椭圆形，局部有凹陷，常染色质丰富，未见异　常。粗面内质网丰富，未见脱粒、扩大现象；滑面内　Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜Ｏ．Ｏ１　ＶＳ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ａｓ．Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　Ｓａｐｏｎｉｎ　质网增多。但溶酶体增多更明显，尤以次级溶酶体　最为明显。　２．４黄芪皂苷对腹腔巨噬细胞内ｃｄ　浓度的变化　ＬＳＣＭ观察可见随着作用浓度的增加，细胞的荧　光强度不断增加。５０　ｇ／ＩＹｌｌ组增加不明显，与对照　组相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．ｏ５），其余各组与　对照组差异显著（Ｐ＜０．０１）。结果见表２和图２。　３讨论　ＡＳ是黄芪诸多组份中，主要的有效成分。黄芪　图１透射电子显微镜下观察ＡＳ诱导的狲厦　的形态学改　对免疫系统的影响已有许多研究，但有关ＡＳ对巨　变（×１２　０００）　噬细胞影响所知甚少。本实验证实在体外ＡＳ对小　Ｆｉｇ。１　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｓａｐｏｎｉｎ（ＡＳ）（４００￣ｇ／ｔｍ）ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｍｏｒ－　鼠ＰＭ西有直接激活作用，激活的ＰＭ　细胞毒作用　ｐｈｏｌｏ＃￣ｄＩａ］ｄｇｅｓ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｖｉｅｗｅｄ　ｂｙ　增强。经ＡＳ刺激２４小时的　怖，对Ｈ２２肿瘤细胞　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｌｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（×１２　０００）　Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ＡＳ（４０Ｏ　ｍ１）．　的细胞毒作用明显增强，从２００、４００到８００　ｇ／ＩＩｌｌ组　杀伤活性呈缓慢上升趋势，到８００　ｇ／ｍｌ杀瘤率达　表２不同浓度ＡＳ对腹腔巨噬细胞ｎ１ｌｏ－３荧光强度的影响　７４．７８％。本实验还发现，经ＡＳ作用的ＰＭ西，ＮＯ分　Ｔａｂ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆＡＳ　Ｏｉｌ耵咖－３　ｆｌｕ－　泌水平增加且呈剂量依赖性，８００　ｇ／ｍｌ可达６５４．０４　ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃ￣ｐｈａｇｅｓ　ｔｍａｏｌ／Ｌ。ＮＯ是一种高活性和不稳定的自由基，是活　（ＰＭＯ）　化的巨噬细胞杀灭肿瘤细胞及病原微生物的主要效　ＡＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｖｇ／ｍ１）　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｐ№（　±ｓ）　应分子之一。ＮＯ抗肿瘤机制可能是ＮＯ与瘤细胞　Ｏ（ｃｏｎｔｒｏ１）　５５．７２±１２．５６　代谢关键酶活性部位Ｆｅ—Ｓ基团结合，形成铁　亚硝　５０　７０．７５±１９．８８　１ｏ０　８２．８４±２２．４９　酰基复合物，引起酶中铁的丢失，破坏ＤＮＡ合成限　２０ｏ　９３．４１±３１．２３　速酶，阻断肿瘤细胞的ＤＮＡ损伤修复、能量代谢［引。　４ＯＯ　１０８．８Ｏ±２１．７４ｊ　由此可见，ＡＳ不仅能促进小鼠ＰＭ　细胞因子的分　８００　１２９．２ｌ±３７．２５　泌而且还可以提高小鼠ＰＭｑ）细胞杀瘤活性，提示　Ｎｏｔｅ：１）Ｐ＜Ｏ．０１　ＶＳ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ａｓ．Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｓａｐｏｎｉｎ　ＡＳ有刺激巨噬细胞活性的作用。　维普资讯 http://www.cqvip.com 杨小敏等黄芪皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞的免瘗增强作用第旦　王淑静等¨６ｊ研究表明活化的巨噬细胞表面突起　巨噬细胞内游离ｃａ２　浓度的途径影响细胞的信息　增多、增粗，粗面内质网丰富，滑面内质网增多，溶酶　传递，激活巨噬细胞，发挥免疫调节作用。　体增多。本研究以ＡＳ（４０ｏ　ｔｅ／ｍ１）刺激巨噬细胞２４　综上所述，Ａｓ能增强巨噬细胞的免疫调节功　小时后，透射电镜观察超微结构发现经ＡＳ处理的巨　能，其调节机制可能与其引起细胞内Ｃａ２　的浓度升　噬细胞与对照组细胞相比，细胞处于极度活跃状态：　高有关。本研究为黄芪皂苷和巨噬细胞应用于肿瘤　细胞表面突起增多、增粗、增长，交错重叠；核呈圆形　免疫治疗提供了理论和实验依据，为ＡＳ作为免疫　或椭圆形，局部凹陷明显；粗面内质网丰富，未见脱　增强剂应用于临床奠定了实验基础，这对于继承和　粒、扩大现象；滑面内质网增多，但溶酶体增多更明　发扬祖国医药宝库具有十分重要的意义。　显，尤以次级溶酶体最为明显。由此可见，超微结构　上的这种形态学特征改变是ＡＳ活化巨噬细胞的一种　４参考文献　外在表现，进一步说明ＡＳ对巨噬细胞有激活作用。　１李力，陈宇红．黄芪皂甙提取分离方法的研究［Ｊ］．宁夏大学学　在上述实验的基础上，本研究对ＡＳ激活巨噬　报（自然科学版），２００６；２７（１）：５９—６１．　细胞的免疫机制进行了初步探讨。细胞的许多重要　２李力，陈宇红．黄芪皂甙提取与含量测定方法研究［Ｊ］．福建分　析测试，２００４；１３（３）：２００６—２０１０．　生理代谢活动与钙离子浓度有关。细胞钙以结合钙　３黄波，冯作化，张桂梅．Ｈｓｐ７０．肿瘤抗原肽复合物修饰的Ｄｃ疫　和游离钙两种形式存在，细胞内钙９９．９０％以上为　苗体内外特异性抗瘤作用［Ｊ］．中国免疫学杂志，２００２；１８：６１　结合钙，主要分布在细胞核、线粒体、内质网、肌浆网　６１７．　和质膜，而细胞内游离Ｃａ２　极少。细胞在非激活状　４　Ｙｅｎ　Ｗ　Ｗ，Ｌｉ　Ｙ　Ｓ，Ｃｕｉ　Ｚ　Ｔ．Ｌｉｇｈｔ－ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｉｍｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　态时，胞内游离Ｃ　浓度仅为１０～～１０～ｍｏｌ／Ｌ。　０ｆｔｈｅ　ｓｐｉｎａｌ　ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆｍｉｃｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ａｎａｔ（Ｂａｓｅ１），１９８９；１３４　细胞内游离Ｃａ２　浓度的改变是细胞生理功能的关　（２）：１４１—１４３．　５　Ｒａｏ　Ｄ　Ｎ．Ｃｅｄｅｒｂａｕｍ　Ａ　Ｉ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｉｒｏｎ—ＣＯＩｌ—　键环节　ｊ。ｃａ２　作为细胞信使的基础，首先是在细　ｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｄｕｒｉｇｎ　ｔｈｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｐｍｓｓｉｄｅ　ｂｙ　Ｈ　－　胞质与胞内钙库或胞外ｃａ２　之间存在浓度梯度。　ｃｒｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　ｂｙ曲ｏｌｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｂｉｃｅｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９５；３２１（２）：３６３—　由于胞内Ｃａ２　浓度很低，而胞外Ｃａ２　浓度要高几个　３７１．　数量级，当外界信号分子刺激使胞外即使少量的　６王淑静，杨建军，张焱．两种中药多糖对巨噬细胞超微结构影响　Ｃａ２　进入细胞质或钙库释放ｃａ２　稍有增加时，均可　的分析［Ｊ］．宁夏医学院学报，２０００；２２（５）：３１５—３１７．　７　Ｍｉｎａｇａｗａ　Ｎ，Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ｂ　Ｅ，Ｎａｔｈａｎｓｏｎ　Ｍ　Ｈ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｃｈｏｌａｎ—　导致胞浆内Ｃａ２　浓度大幅增加，继而引发细胞一系　ｇｉｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｇａａｔｒｏｅｎｔｅｍｌ，２００６；１２（２２）：３４６６—３４７０．　列生理生化反应，从而起到传递信号的作用ｌ８。因　８＿８孙大业，郭艳林，马力耕．细胞信号转导［Ｍ］．第２版．北京：科学　此，胞内游离Ｃａ２　浓度的变化是细胞生理功能的重　出版社，２０００：９１—１２４．　要物质基础，胞内Ｃａ２　游离水平的调节也就成为信　号转导过程中的关键环节。本实验通过ＡＳ引起小　［收稿２００７—０９—１７修回２００７—１２－１０］　鼠ＰＭ（Ｉ）［Ｃａ２　］　升高的现象，提示Ａｓ可能通过增加　（编辑许四平）　（上接第８０３页）　５杨佳荟，刘莉，郭品娥ｅｔ　ｏ１．系统性红斑狼疮病人外周血１１１细　１２Ｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００２；３５（６）：３８１—３８７．　胞和Ｔｃ细胞ＩＦＮ一７及　２４表达水平与疾病的关系［Ｊ］．中国免疫　１０　ＶａｌｅｎｃｉａＸ，ＹａｔｈｏｒｏＣ，ＩｌｌｅｉＧ　ａ／．ＤｅｆｉｃｉｅｎｔＣＩＭ　ＣＤ２５ｈｉ小Ｔ唧ｌａ—　学杂志，２００５；２２（２）：１６８—１７７．　ｔｏｒｙ　ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｈｔ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｙｓｔｅｉｍｃ　ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ　６　ＴｈｅｏｆｄｏｐｏｕｌｏｓＡＮ，Ｋｏｕｎｄｏｕｒｉｓ　Ｓ，Ｋｏｎｏ　ＤＨ　ｅｔ　ａ／．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆＩＦＮ－ｇａｍ－　ｌＪＪ．Ｊ　ｈｒａｎｕｎｄ，２ＯＯ７；１７８（４）：２５７９－２５８８．　ｍａ　ｉｎ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ａ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｔｈｌ／Ｔｈ２　ｐａｒａｄｉｇｍ　１１　ＣｓｉｓｚＯｘ　Ａ，Ｎａｇｙ　Ｇ，Ｇｅｒｇｅｌｙ　Ｐ　ｅｔ　ａ／．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｎｍｌａ（ＩＦＮ—　ｉｎ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ａｒｔｈｒｉｉｔｓ　Ｒｅｓ，２００１；３（３）：１３６－１４１．　ｇａｍｍａ），ＩＬ－１０ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄＩＬ４ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　７龙湘俊．青藤碱研究进展［Ｊ］．中南药学，２００３；１（５）：２９９—３０１　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）ｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ　ｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓ　ｅｃｔｈｅｍ￣ｔｏ—　８赵毅，余克强，李娟．青藤碱对类风湿关节炎病人树突状细胞　ＳＵＳ（ＳＩＥ）［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｒｒａｍｏｌ，２０００；１２２（３）：４６４－４７０．　免疫活性的影响［Ｊ］．中国药学杂志，２ｏｏ６；４１（２ｏ）：１５４３—１５４５．　９　ＳｕｇｉｍｏｔｏＫ，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ　Ｓ，ＫａｎｅｋｏＨ　ｅｔ　．ＤｅｃｒｅａｓｅｄＩ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＣＩＭ　［收稿２００７－１２．２７修回２００８．０３—２０］　Ｔ　ｃｅｌｌｓｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｈｔ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ—ｒｅｌａｔｉｏｎｔｏＩＬ－　（编辑张晓舟）