高效液相色谱法测定四环素片含量的方法改进

黄萍;高琳;司马磊;饶雅琨;刘霞;郑妍

【摘 要】目的：建立高效液相色谱（HPLC）法测定四环素片的含量。方法采用Kromasil C18（250 mm ×4．6 mm ，5μm）色谱柱，以0．1 mol · L -1磷酸氢二铵-乙腈（84∶16）为流动相，柱温为35℃，流速为1．0 mL · min-1，检测波长为280 nm。结果四环素质量浓度在0．0240～0．7697 mg · mL -1范围内呈良好的线性关系，r＝1．000（n＝6），平均回收率为100．4％，RSD为0.8％（n＝3）。结论该方法操作简便、准确、重复性好，可用于四环素片的含量测定。%Objective To establish an improved HPLC method for the determination of Tetracycline Tablets .Methods The separa-tion was performed on a Kromasil C18 (250 mm × 4 .6 mm ,5 μm) column ,with the mobile phase of 0 .1 mol · L -1 diammonium hydrogen phosphate-acetonitriles(84∶16) at a flow rate of 1 .0 mL · min-1 .The column temperature was set at 35 ℃ ,and the detection wavelength was 280 nm .Results Tetracycline presented a good linear correlation in the range of 0 .024 0-0 .769 7 mg · mL -1 (r=1 .000) ,the limit of detection was 21 ng · mL -1 ,and the average recovery was 100 .4% ,with RSD of 0 .8% (n=9) .Conclusion This method was simple ,accurate ,reproducible ,and suitable for the quality control of Tetracycline Tablets . 【期刊名称】《西北药学杂志》 【年(卷),期】2014(000)003 【总页数】3页(P255-257)

【关键词】四环素片;高效液相色谱法;含量测定 【作 者】黄萍;高琳;司马磊;饶雅琨;刘霞;郑妍

【作者单位】西安市食品药品检验所，西安 710054;西安市食品药品检验所，西安 710054; 西安交通大学药学院，西安 710061;西安市食品药品检验所，西安 710054;西安市食品药品检验所，西安 710054;西安交通大学药学院，西安 710061; 西安市食品药品检验所，西安 710054;西安市食品药品检验所，西安 710054

【正文语种】中 文 【中图分类】R927.2

四环素为四环素类广谱抗生素，主要用于治疗革兰阳性和阴性菌、支原体、衣原体、立克次体等致病原引起的感染或混合感染[1]。《中国药典》2005年版和2010年版均采用高效液相色谱法测定盐酸四环素及其制剂的含量[2-3]，但四环素及其制剂的含量测定为微生物测定法[4-5]。微生物法测定费时，繁琐，专属性和准确度不高。目前已有报道[6-8]采用HPLC法测定四环素制剂含量，但是采用的流动相0.05 mol·L-1草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-磷酸氢二铵溶液(75∶20∶5)、乙腈-水-甲酸(25∶75∶1)，配制较复杂，毒性较强，并且未对四环素相关杂质进行系统分析。本实验建立了以0.1 mol·L-1磷酸氢二铵-乙腈(84∶16)为流动相采用高效液相色谱法测定四环素片含量的方法。结果表明，该方法操作简便、准确、重复性好，4-差向四环素、差向脱水四环素、脱水四环素等相关杂质对含量测定无干扰，可用于四环素片的含量测定。 1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪；BT25 S电子天平(Sartorius)；KQ5200DB型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 四环素(中国药品生物制品检定所，批号130306-200317，1 mg相当于970单位)；盐酸四环素(中国药品生物制品检定所，批号130488-200403，含量97.5%)；4-差向四环素(中国药品生物制品检定所，批号130401-200209)；脱水差向四环素(中国药品生物制品检定所，批号130403-200204)；土霉素(中国药品生物制品检定所，批号130487-200302)；脱水四环素(中国药品生物制品检定所，批号130402-200203)；四环素片(西安金花企业股份有限公司，批号101206，101207，101208，规格：0.25 g)；乙腈(色谱纯，Merck公司)；磷酸氢二铵(西安化学试剂厂，分析纯)；三蒸水(自制)。 2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性 色谱柱：Kromasil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1 mol·L-1磷酸氢二铵-乙腈(84∶16)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL。记录色谱图，见图1。色谱图中4-差向四环素、土霉素、脱水差向四环素、盐酸四环素和脱水四环素，理论板数均大于4 000，相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，对四环素的含量测定无干扰。 图1 系统适用性实验色谱图1.4-差向四环素；2.土霉素；3.脱水差向四环素；4.四环素；5.脱水四环素Fig.1 Chromatograms of system suitability test1.4-epitetracycline;2.oxytetracycline;3.4-epianhydrotetracycline;4.tetracycline;5.anhydrotetracycline

2.2 溶液制备 称取4-差向四环素、土霉素、差向脱水四环素和脱水四环素对照品各约3 mg及盐酸四环素对照品约4 mg，置于50 mL量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶液溶解，并稀释至刻度，作为系统适用性实验溶液。取盐酸四环素对照品适量，精密称定，用0.01 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释成1.03mg·mL-1的溶液，

作为对照品储备溶液。精密量取10 mL，置于100 mL量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取样品10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量，加0.01 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释成每1 mL含四环素0.1 mg的溶液，过滤，即得供试品溶液。 2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 吸取适量盐酸四环素对照品储备液，用0.01 mol·L-1盐酸溶液稀释配制成质量浓度分别为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4和0.8 mg·mL-1的对照溶液。照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积对溶液质量浓度进行线性回归，得回归方程：Y= 37 014X -98.286，r=1.000，线性范围为0.024 0 ～ 0.769 7 mg·mL-1。

2.3.2 检测限和定量限考察 取2.2项下对照品溶液，用0.01 mol·L-1盐酸溶液逐级稀释进样，测得盐酸四环素的检测限为21 ng·mL-1(S/N=3∶1)，定量限为70 ng·mL-1(S/N=3∶1)。

2.3.3 重复性实验 取同一批样品6份，照2.2项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，按外标法以峰面积计算含量，平均含量为93.6%，RSD为1.12%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 精密度实验 取2.2项下的对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样5次，以峰面积计算，RSD为0.18%，表明该方法精密度良好。

2.3.5 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0，1，2，4，6 和8 h，照上述色谱条件，测定峰面积，RSD为0.60%，结果表明，四环素在8 h内稳定。 2.3.6 加样回收率实验 取已知含量供试品(批号101208，规格：0.25 g)20片，研细，精密称取9份(相当于四环素5.0 mg)，分别置于100 mL量瓶中，分别加入盐酸四环素对照品储备液3.0，5.0和7.0 mL，用0.01 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度，配制成高、中、低3个质量浓度的供试品溶液。照上述色谱条件，

取续滤液进样，测定含量，测定结果见表1，平均回收率为100.4%，RSD为0.8%。

表1 四环素加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery for tetracycline(n= 3)样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率

/%RSD/%4.753.017.7499.374.883.017.8799.454.743.017.76100.394.845.019.8499.694.835.019.92101.58100.40.84.885.019.92100.554.907.0212.02101.454.887.0211.92100.244.7.0211.98101.06

2.4 样品含量测定 分别取对照品溶液和不同批号的供试品溶液，按上述的色谱条件测定，以外标法(峰面积)计算含量，结果：批号为101206，101207和10208的3批样品用HPLC法测得含量为94.5%,94.0%和93.6%；用微生物检定法测得含量为94.2%，94.0%和94.3%。 3 讨论

3.1 波长的选择 取盐酸四环素对照品，用0.01 mol·L-1的盐酸溶液溶解配制成30 μg·mL-1的溶液，在200～400 nm波长范围内扫描，结果在270 nm处有最大吸收，同时对4-差向四环素、土霉素、脱水差向四环素和脱水四环素进行波长扫描，在280 nm附近都有较强吸收，考虑上述因素并参考文献[3]，选择检测波长为280 nm。

3.2 流动相的选择 本实验比较了乙腈-水-甲酸(25∶75∶1)，0.05 mol·L-1草酸铵-二甲基甲酰胺-0.1 mol·L-1磷酸氢二铵(68∶27∶5)，0.1mol·L-1磷酸氢二铵-乙腈(84∶16)等流动相，比较系统适用性实验各色谱图峰形及分离情况，结果表明，系统在0.1 mol·L-1磷酸氢二铵-乙腈(84∶16)的流动相条件下，保留时间适中，且4-差向四环素、土霉素、脱水差向四环素、盐酸四环素和脱水四环素5种组分的分离均符合规定，对含量测定无干扰，为以后四环素有关物质的研究奠定了基础。 3.3 柱温的选择 本实验考察了25，30，35和40 ℃等温度下，对各组分物质的分

离情况，结果表明,柱效基本不变，但在35 ℃时，各组分的分离度和对称因子较好，因此本实验选择35 ℃。

采用HPLC法测定四环素片的含量与微生物检定法测定结果基本一致，结果见表2。微生物检定法测定费时，繁琐，专属性和准确度不高。而HPLC法操作简便，快速，重复性和精密度好，专属性强，能很好地满足该产品的质量控制要求。

【相关文献】

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[2] 国家药典委员会.中国药典2005年版[S]二部.北京：化学工业出版社，2005:483-484. [3] 国家药典委员会.中国药典2010年版[S]二部.北京：化学工业出版社，2010:6-666. [4] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：抗生素药品：第一册[S].19:11.

[5] 傅燕芳，张正洁，张玉良，等. 短小芽孢杆菌作实验菌测定四环素类抗生素效价[J].西北药学杂志，1999，14(3):111-112.

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