茶多酚对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的实验研究

茶多酚对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的实验研究1

武红莉1，陈信义1，韩冷2，崔巍3

北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京（100700）

2

苏州大学生命科学学院，江苏苏州（215007）

3

教育部、北京市重点实验室（中医内科学），北京（100700）

E-mail：chenxinyi0729@sohu.com

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摘 要：目的：观察茶多酚（TP）对体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的和凋亡

的影响。方法：倒置相差显微镜、RT-PCR法进行HUVEC的观察及鉴别。应用MTT法和流式细胞仪测定不同浓度TP（1、10、100µg/ml）对HUVEC增殖、细胞周期、增殖指数及凋亡率的影响。结果：目的条带测序结果与GenBank人CD31基因序列完全一致。10、100µg/ml TP能抑制HUVEC增殖（P<0.01）。100µg/ml TP与对照组相比：细胞增殖指数PI降低，G1期细胞增加，S期细胞减少，G2期细胞减少，凋亡率显著增加（P<0.05）。结论：TP能抑制内皮细胞增殖并诱导其凋亡，是一种潜在的新生血管抑制剂。 关键词：茶多酚；人脐静脉内皮细胞；细胞增殖；凋亡

内皮细胞与增殖是肿瘤血管生成的物质基础，因而成为抗血管生成研究课题中的主要对象之一。已有研究表明茶多酚可抑制肿瘤的血管生长，本实验以HUVEC为模型，研究茶多酚对血管内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨茶多酚对血管生成作用及其机制。

1 材料

1.1 受试样品及试剂

茶多酚（tea polyphenol,TP）：江西绿康天然产物有限责任公司惠赠，纯度98%，临用前用三蒸水配制成100mg/ml母液，再用完全培养液稀释成各种实验浓度；噻唑兰（MTT）粉、Rnase、碘化丙啶（PI）：Sigma公司产品，临用前PBS配制成5mg/ml；DMEM高塘培养基、胎牛血清(FBS)：GiBCO公司产品；二甲基亚枫（DMSO）：国产分析纯。

1.2 细胞株

人脐静脉内皮细胞（中国典型物种保藏中心CCTCC）李梢老师惠赠，培养于含10%胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的DMEM高糖培养液（完全培养液）中，于37℃、5%CO2条件下培养。

2 方法

2.1人脐静脉内皮细胞的鉴定

用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长情况。采用RT-PCR对HUVEC进行鉴定。引物的设计与合成：根据检索NCBI数据库提供的CD31基因的cDNA编码序列（NM_000442.3）进行了PCR引物设计。其序列为：①上游引物：5' CACCAAGATAGCCTCAAAGTCGG 3'；②下游引物：5' CACCTTCACCCTCAGAACCTCAC 3'。目的基因的扩增与纯化按说明书步骤操作，抽提培养5天的细胞总RNA。RT-PCR反应条件为42℃45分钟，94℃3分钟，94℃预变性3分钟，以94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸59秒，35个循环后，再于72℃延伸7分钟。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，回收目的条带，送英俊基因公 1

本课题得到国家自然科学基金资助项目（编号：30472280）的资助。

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司测序[1]。

2.2 MTT法检测TP对细胞生长的抑制作用

取对数生长期的HUVEC于96孔板接种4×103/孔，培养24h后加入1、10、100µg/ml 3个浓度的TP及完全培养液的对照组，每组6个复孔，继续培养48h后吸弃上清，每孔加入不含血清的DMEM培养液200µl及5mg/mlMTT液20µl，再培养4h后，弃去上清液加入DMSO 150µl/孔，振荡10min，置于日本550型全自动酶标仪490nm波长处测各孔吸光度（OD值）,根据文献按下式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=（1-OD实验组/OD对照组平均）×100%。

2.3流式细胞仪测定细胞周期及凋亡

胰酶消化，分别收集经TP 1、10、100µg/mL处理48h的HUVEC细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，1000rpm20min收集细胞，PBS洗2次，加入50µg/mL Rnase37℃反应30min，碘化丙啶（PI）冰浴避光染色40min，上机检测。按照以下公式计算增殖指数 PI＝［(S＋G2/M)/(S＋G2/M＋G0/G1)］×100％

2.4 统计学处理

采用SAS9.0统计软件进行统计分析，数据不满足方差分析条件，采用非参数秩和检验Kruskal-Wallis法。

3 结果

3.1细胞形态观察：倒置相差显微镜下可见

对照组正常生长的HUVEC接种后4h内，细胞基本贴壁伸展，呈单层扁平状生长；12h后HUVEC细胞生长旺盛，梭形细胞呈典型“铺路石”样排列，核相多见，1～2个核仁，胞浆丰富；72h后HUVEC融合达80%以上。100µg/mlTP组细胞数量明显少于对照组，细胞变大变圆。

3.2目的条带测序结果与GenBank人CD31基因序列完全一致。 3.3 MTT法测定TP对HUVEC的生长抑制作用

10、100µg/mlTP处理HUVEC 48h，与对照组有显著性差异，抑制率随浓度的增加而增大。结果见表1。

表1 TP对HUVEC的生长抑制作用

对照组

TP浓度分组

1µg/ml 10µg/ml

100µg/ml

1.041±0.036 0.937±0.110 0.822±0.054* 0.475±0.020* 0.00±3.51% 10.04±10.55% 21.08±5.16%* 54.35±1.%* 与对照组相比*P<0.01

3.4 流式检测TP对HUVEC细胞周期、增殖指数和凋亡率的影响

100µg/ml TP作用48h后与对照组相比：细胞增殖指数PI降低；细胞周期各时相群体比例发生了变化（P<0.05）：G1期细胞增加，S期细胞减少，G2期细胞减少；凋亡率显著增加。结果见表2、图1、2。

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表2 TP对HUVEC细胞周期、凋亡率、增殖指数的影响（%）

G1 G2 S PI A 对照组

37.32 20.00 42.68 62.68

2.58 2.23 4.06 13.06*

1µg/ml 50.51 13.91 35.58 49.49 10µg/ml 50.41 16.86 32.73 49.59 100µg/ml

与对照组相比 * P<0.05

65.85* 16.12* 18.03* 34.15*

图1 对照组HUVEC流式图 图2 TP100µg/ml组HUVEC流式图

4 讨论

茶多酚（TP）是茶叶的主要活性成分，占茶叶干重的20%～35%。流行病学研究揭示，摄入绿茶多酚能降低冠心病和肿瘤等疾病的发生率。这种良性作用部分来源于其抑制血管形成的能力[2]。

内皮细胞的增生是血管形成过程中的重要步骤，有研究显示茶多酚及其主要成分EGCG能抑制血管内皮细胞的增生，进而抑制肿瘤血管生成。Cao等[3]发现，牛毛细血管内皮细胞在纤维母细胞生长因子刺激下，生长加速，加入EGCG后，其生长被抑制，呈明显的剂量依赖关系。而且这种抑制作用是内皮细胞特异的。Oak 等[4]研究发现，绿茶多酚以剂量依赖性方式显著抑制了内皮细胞的增生，导致细胞在G1期停滞，而不影响细胞的生存。

本研究中MTT试验显示茶多酚对HUVEC的增殖有一定抑制作用，且呈剂量依赖性关系，随药物浓度的增加，抑制率增加。一杯茶约含150mg的EGCG，饮一杯茶后，一个体重60kg的人血液中EGCG的最大浓度可达60µmol/l，本研究中100µg/ml的茶多酚作用48h后对HUVEC的抑制率达50%左右，从治疗剂量角度考虑，也使茶多酚作为一种治疗药物应用于临床成为可能。

细胞增殖周期中，在G1期和S期之间及G2期和M期之间，存在影响细胞周期进行的控制点，一旦细胞通过这些控制点，将不能阻止细胞进入和通过S期或M期，药物对细胞增殖的影响可能证实通过上述环节来实现的。本次实验结果提示：100µg/ml的茶多酚作用48h后，细胞周期分布显示G0/G1期的比例逐渐增加，细胞周期被阻滞于G0/G1期，同时在G0/G1期前面可见亚二倍体峰为凋亡峰，流式细胞仪直方图上可见明显的亚二倍体峰凋亡率增加，细胞指数降低。表明茶多酚可抑制人脐静脉内皮细胞生长，其机制主要是通过阻滞G1～S期的转化，影响DNA合成，从而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。综上述，TP

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通过抑制内皮细胞的增殖活性和诱导其凋亡进而抑制肿瘤血管的形成，其具体作用环节有待进一步研究。

参考文献

1 PJ Newman, MC Berndt, J Gorski , et a1．PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily.Science, 247(4947): 1219-1222

2 Yang Cs, Maliakal P,Meng X. Inhibition of carcinogenesis by tea．Annu Rev Pharmacol Toxicol，2002,42:25 3 Cao Y, Cao R. Angiogenesis inhibited by drinking tea..Nature, 1999,(398):38

4 Kojima-Yuasa A，Hua JJ，Kennedy DO，et a1．Green tea extract inhibits angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells through reduction of expression of VEGF receptors．Life Sci，2003,(73):1299

Effects of tea polyphenols on proliferation and apoptosis of

human umbilical vein endothelial cell in vitro

Wu Hongli1，ChenXinyi1，HanLeng2，CuiWei3

1

Department of Oncology and Hematology，Dongzhimen Hospital，affiliated with the Beijing

University of Traditional Chinese Medicine，Beijing （100700） 2

School of Life Science，Soochow University，Suzhou，Jiangsu（215007）

3

Key Laboratory of the Ministry of Education and the Beijing Municipality，Chinese Internal

Medicine Laboratory，Beijing （100700）

Abstract

Objective To ivestigate the effect of tea polyphenols on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) in vitro. Methods To observe and identificate HUVEC by inverted phase contrast microscope and RT-PCR. The effects of various concentrations of tea polyphenols （1、10、100µg/ml） on proliferation、cell cycle、proliferation index and apoptosis of HUVEC cells were observed by MTT assay and flow cytometer, respectively. Results The sequence of target strain gene was consistent with the hunan CD31 reported by GenBank .Tea polyphenols(10、100µg/ml)inhibited the proliferation of HUVEC cells（P<0.01）. In the100µg/ml TP group, the proliferation index (PI) were decreased, the G1 phase cells were increased，G2 and S phase cells were decreased in cell cycle，the apoptosis was signi ficantly increased compared to those of the control group（P<0.05）. Conclusion TP may be a potent antiangiogenic agent because of inhibiting proliferation and inducing apoptosis of HUVEC.

Keywords：Tea polyphenols，human umbilical vein endothelial cell，cell proliferation，apoptosis

作者简介：

武红莉（1979-），女，2005级博士研究生。研究方向：中西医结合治疗恶性肿瘤应用基础研究；

陈信义（1954-），教授、博士生导师。

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