第３３卷第１４期 甘肃科技 Ｇａｎｓｕ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．３３ Ｎｏ．１４ ２０１７年７月 Ｊｕ１． ２０ｌ７ ＵＳＰ２２通过ＡＫＴ磷酸化途径影响肝癌细胞增殖 马光荣．马克林 （甘肃省东乡族自治县人民医院普外科，甘肃东乡族自治县７３１４００） 摘 要：利用ＲＮＡ干扰技术研究ＵＳＰ２２沉默对肝癌细胞系增殖的影响及其可能的分子机制。本研究采用ＵＳＰ２２小 干扰ＲＮＡ技术．对体外培养的ＵＳＰ２２阳性肝癌细胞株ＨｅｐＧ一２及ＳＭＭＣ一７７２１细胞株进行ｓｉＲＮＡ转染，用ｑＲＴ— ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ技术分析胞内ＵＳＰ２２、ＡＫＴ￣ｐ－ＡＫＴ表达水平，并利用ＣＣＫ８检测细胞增殖能力。结果发现： ＵＳＰ２２一ｓｉＲＮＡ转染２４ｈ及４８ｈ后．两株肝癌细胞株胞内ＵＳＰ２２水平明显降低，ＡＫＴ磷酸化水平明显降低。ＣＣＫ８结 果显示．ＵＳＰ２２沉默和显著抑制肝癌细胞增殖能力。结果提示：对ＵＳＰ２２的沉默可显著抑制ＡＫＴ的磷酸化，ＵＳＰ２２ 可能通过ＡＫＴ的磷酸化途径促进肝癌细胞增殖。ＵＳＰ２２可能是肝癌患者预后的重要靶点。 关键词：泛素水解酶２２（ＵＳＰ２２），ＡＫＴ，磷酸化，细胞增殖，肝细胞肝癌 中图分类号：Ｒ３２１．１ 肝细胞肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是 １．２ 实验方法 全世界第三大由癌症导致死亡的疾病．其发病过程 参与多种复杂的分子病理学机制的ｌ１１。目前， ＵＳＰ２２基因序列ｓｉＲＮＡ干扰片段的设计及合 成利用ＧｅｎＢａｎｋ工具确定ＵＳＰ２２蛋白序列．设计特 ＨＣＣ相关信号通路已有许多研究．包括ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ ｍＴＯＲ通路、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路、ＷＮＴ／［３一Ｃａｔｅｎｉｎ 异性ｓｉＲＮＡ序列。并设计阴性对照（ｎｅｇａｔｉｖｅＭＯＣＫ） ｓｉＲＮＡ序列 ＵＳＰ２２小分子干扰ＲＮＡ（ＵＳＰ２２－－ｓｉＲＮＡ）、 阴性对照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ—ｓｉＲＮＡ）质粒由广州爱科生物 技术有限公司参考文献报道的方法合成 正义５ 一 ＡＡＣＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＴＩＴｒＣＡＡＧＡＧＡＡＴ 通路以及ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ通路等［ｚ ３１ 信号通路中肿 瘤标记物以及肿瘤抑制剂在癌症发生中起关键作 用，揭示它们之间的复杂关系，对于预防或治疗肿 瘤发生具有重要的临床意义 泛素水解酶２２（ｕｂｉｑ． ＴＧｒＩ＇ＦＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＧＴＧｑｑｑｑｑ￣Ｃ－３．反义３，＿ｒｆ］ｒＧＡ— ＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＴｒＧＴｒＡＡＡＧＴＴＣＴＣＴＩ＇ＡＡＣＡＡＣＴ ｕｉｔｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２２．ＵＳＰ２２）是一种 直接或间接参与哺乳动物细胞增殖，并与乳腺癌、 结直肠癌、肝癌及肺癌在内的多种肿瘤的发生、发 展密切相关的基因 。近年的研究表明．ＵＳＰ２２在多 ＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴ一５ ．阴性对照．正 义５ 一ＡＡＣｒｒＩＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣ＿，ＩＴＩＴＩ１ＣＡＡＧＡＧ ＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＧｒＩＴｒＣＧＧＡＧＡＡ１ＴＩＴ１Ｔ丌Ｃ一３ ：反义３ 一种肿瘤中表达水平异常．沉默ＵＳＰ２２的表达水平可 以产生对恶性肿瘤的抑制效果Ｉ５’６１ 但目前ＵＳＰ２２与 肝癌发生发展之间的关系尚不明确［７１ 本研究采用 ＵＳＰ２２ ｓｉＲＮＡ对肝癌细胞株ＨｅｐＧ一２及ＳＭＭＣ一 ７７２１进行转染．观察ＵＳＰ２２沉默对肝癌细胞增殖能 ＴｒＧＡＡＡＧＡＧＧＣＴＩ１ＧＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＡＧ—ＴＴＣＴＣＴＴ ＧＣＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＴＣＴＩ＇ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴ一５’。 细胞培养及转染 人肝癌细胞株ＨｅｐＧ一２及 ＳＭＣＣ一７７２１利用ｌ０％ＦＣＳ的ＤＭＥＭ高糖培养基在 ３７ｏＣ、５％ＣＯ 浓度培养箱中培养，２４ｈ后更换培养 基。实验分两组：阴性对照组和实验组。本实验利用 力的影响，并初步阐明其调节的分子机制。 ＢＬＯＣＫ—ＩＴＦＭ Ａ１ｅｘａ Ｆ１ｕｏ 光试剂检测转染效率． １材料与方法 １．１ 实验材料 细胞在２４孔培养皿中进行培养．转染试剂 （ＬＰ２０００）浓度为分别为每孑Ｌ Ｏ．５ｔｘｌ，ｌｌｘｌ和１．５１ｘｌ； 人肝癌细胞系ＨｅｐＧ一２及ＳＭＭＣ一７７２１细胞株 ＲＮＡｉ浓度分别为１０ｐＭ，２５ｐＭ，５０ｐＭ，通过组合后 发现．在本实验中．ＬＰ２０００为ｌｔｘ１．ＲＮＡｉ为５０ｐＭ组 购自上海细胞库。抗一ＡＫＴ．抗ＵＳＰ２２购自Ｓｉｇｍａ公 司；抗一Ｐ—ＡＫＴ购自Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司：抗［３－ａｃｔｉｎ 转染效率最高．平均为９０％左右 在此转染浓度的 基础上．对细胞ＡＦＰ利用ｓｉＲＮＡ进行抑制．结果利 抗体购自ａｂｃａｍ公司。 用罗氏Ｅｌ７０化学发光仪进行检测．结果发现， 第ｌ４期 马光荣等：ＵＳＰ２２通过ＡＫＴ磷酸化途径影响肝癌细胞增殖 １４７ ＵＳＰ２２一ｓｉＲＮＡ对细胞ＵＳＰ２２表达水平有强的抑制 率 利用凝胶成像系统进行图片采集及数据分析 文验 结果利用ＳＰＳＳ１３．０进行统计分析 一ｌ＾． 一１■ｌＩ●ｑ 廿—＾－量ＩＨ Ｏ．．善－ｌ＇ｃ呈 ■＿鼍 细胞增殖 将细胞种于９６孔板中（２０００个／ 孔）．利用ＣＣＫ８试剂盒检测细胞增殖 在４５０ｎｍ处 检测活细胞增殖状态 所有实验均重复３次 ２结果 ２．１ ＵＳＰ２２低表达抑制肝癌细胞增殖 通过对实验组进行ＵＳＰ２２ ｓｉＲＮＡ干扰．本实验 总蛋白提取及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 分别于２４ｈ． ４８ｈ后利用细胞刮收集细胞．利用ＲＩＰＡ试剂盒裂解 细胞．调整组问蛋白浓度．每个泳道蛋白上样量为 ６０１＊ｇ．湿转条件下利用ＰＶＤＦ膜进行转膜．５０ｍＬ／Ｌ 发现．ＵＳＰ２２一ｓｉＲＮＡ十扰后的两株肝癌细胞系 ＵＳＰ２２表达水平明显降低，而且．通过ＣＣＫ８细胞增 殖试剂盒检测．转染组肝癌细胞增殖能力明显减弱 （如图ｌ所示）。 脱脂奶粉封闭．利用不同抗体进行免疫化学染色． ＋Ｃｏｎｔｒｏｌ －Ｏ－ＵＳＰ２２－ｓｉＲＮＡ 一ｔＩ．占ｎ●＇．一ｉｏ Ｎ卜 ｏＵｔ‘毋 Ｊ． Ｅ｜＇ｃ●嘉－－● ２‘ 船 ７２ 冁 Ｄ 越 ７２ ＴＩｍｅ（ｈ） 图１ ＵＳＰ２２沉默对肝癌细胞ＨｅｐＧ２ ａｎｄ ＳＭＣＣ一７７２１增殖能力的影响 ２．２ ＵＳＰ２２低表达影响细胞ＡＫＴ信号通路 本实验利用ｓｉＲＮＡ转染技术对细胞ＵＳＰ２２表 达进行抑制 检测ＵＳＰ２２对细胞ＡＫＴ信号通路的 影响 通过ＵＳＰ２２一ｓｉＲＮＡ转染后．发现胞内ＡＫＴ表 达水平明显未受到抑制，但ｐ—ＡＫＴ水平受到显著抑 制 （如图２所示） ＳＭＣＣ一７７２１ ３讨论 肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一．中国是 肝癌高发国家．全世界儿乎５Ｏ％的新发和死亡病例 都发生在中国．由于肝癌的高恶性率和高转移率． 中围的肝癌形势１３益严峻．为改善当前肝癌的治疗 环境．因此针对肝癌相关分子的研究已经成为当前 的研究热点 ＵＳＰ２２是一种特异性的泛素水解酶．定位于人 类染色体的１７ｐｌ １．２位点．包含ｌ４个外显子及一个 ＵＳＰ２２ １５００ｂｐ左右大小的开放读码框，可编码５２５个氨基 ｐ诅ＫＴ ＡＫＴ 圉 羹鞠麓麟 酸１８１ ＵＳＰ２２蛋白分子量约６０ｋＤａ，一般表达于细胞 核．主要功能为从大蛋白上移除泛素分子ｆ９１ ＵＳＰ２２ 蛋白末端的氨基末端存在的锌指序列是其实现与 靶蛋白结合和相互作用的重要结构ｌ】Ｏｌ 诸多研究表 １３一ａｃｔｉｎ｝Ｉ｜－— —■——叫 明．ＵＳＰ２２的表达水平与肿瘤的恶性程度、增殖、转 移及预后相关．上调肿瘤细胞的ＵＳＰ２２表达可促进 肿瘤的增殖．而抑制ＵＳＰ２２基因的表达则可以抑制 图２ ＵＳＰ２２沉默对肝癌细胞ＨｅｐＧ２ ａｎｄ ＳＭＣＣ－７７２１ ＡＫＴ及其磷酸化水平的影响 １４８ 甘肃科技 第３３卷 细胞的增殖和侵袭，并促进凋亡…］。ＵＳＰ２２有望成为 ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５．４６０（３）： ７０３—７０８． 对宫颈癌干细胞进行基因治疗的良好靶点 ＵＳＰ２２水平．初步明确了其起效机制 本研 究通过导入外源性ＵＳＰ２２ ｓｉＲＮＡ．降低肝癌细胞内 ｎｇ Ｚ，Ｗａｎｇ Ａ，Ｌｉａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．ＵＳＰ２２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ— ［６】 Ｎｉｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ＦＡＫ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ 在本实验中．我们发现．肝癌细胞行ＵＳＰ２２ ｓｉＲＮＡ转染后．与对照组相比．胞内ＡＫＴ表达水平 ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＯｎｃｏｌＲｅｐ．２０１４．３２（４）：１４５１－１４５８． Ｏｒｇａｎｉｓｔａ—ＮａｖａＪ，Ｇｏｍｅｚ－Ｇｏｍｅｚ Ｙ，Ｇａｒｉｇｌｉｏ Ｐ．Ｅｍｂ￣ｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏ１． 未受到显著抑制，胞内ＡＫＴ发生磷酸化转变为Ｄ— ＡＫＴ。细胞增殖实验发现，肝癌细胞增殖水平明显降 ［８】 ２０１４．３５ｆ３、：１７２７－１７３８． Ｙａｎｇ ＤＤ，Ｃｕｉ ＢＢ，Ｓｕｎ ＬＹ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＵＳＰ２２ 低。这说明，ＵＳＰ２２可能通过ＡＫＴ信号通路关键分 ａｎｄ ＢＭＩ一１ ｍａｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃａｎｃｅｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅｒ 子ＡＫＴ磷酸基团转移促进肿瘤细胞生长．抑制凋亡 发生。研究发现，进展期肝癌中ＵＳＰ２２持续高表达． 发现其可能是反映预后的生物标志物１１３，１４１ 另 有研究显示：ＵＳＰ２２在肝癌耐受化疗药物敏感性过 程中起重要作用 肝癌细胞中ＵＳＰ２２基因敲除可通 过上调Ｓｍａｄ４及抑制ＡＫＴ增加５－Ｆｕ的化疗敏感性 吗，说明ＡＫＴ可能是ＵＳＰ２２的重要靶点。本文首次 证明ＵＳＰ２２可能通过参与ＡＫＴ磷酸化途径调节肝 癌细胞增殖。该实验结果可能对肿瘤增殖相关靶向 分子的研制及临床应用提供重要的理论依据和方向 参考文献： 【１】 Ｓｃｈｉｉｔｔｅ Ｋ，Ｂｏｒｎｓｃｈｅｉｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ— ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｒｅｎｄｓａｎｄＲｉｓｋＦａｃｔｏｒｓ．Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． ２００９．２７ｆ２１：８０—９２． 【２】 Ｇｉｎａｎｎｉ Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ Ｓ，Ｍｏｒｉｎｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｍａｌｌ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ ａｎｄ ｅｔ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１．２００９．２９（１）：１０３—１ １２． ［３】 Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｓ，Ｍａｒａｉｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１０．２９（３６）：４９８９－５００５． ［５１ Ｘｉａｏ Ｈ，Ｔｉａｎ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＵＳＰ２２ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ一２ ｉｎ ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ａｐｙｆａｉｌｕｒｅｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ．２０１１． ６１（３）：７０３－７１０． ［９］ ＳｃｈｒｅｃｅｎｇｏｓｔＲＳ，ＤｅａｎＪＬ，ＧｏｏｄｗｉｎＪＦ，ｅｔａ１．ＵＳＰ２２ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ ｄｒｉｖｅ ｌｅｔｈａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓ ｓｉｏｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１４．７４（１）：２７２—２８６． ［１０］ Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｙａｏ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＵＳＰ２２ ｉｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．ＪＣａｎｃｅｒＲｅｓＣｌｉｎＯｎｃｏ１．２０１１．１３７（８）：１２４５— １２５３． ＨｕＪ，ＬｉｕＹＬ，ＰｉａｏＳＬ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆＵＳＰ２２ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ＢＭＩ－１，ＦＦＥＮ，Ｐ—ＡＫＴ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ．２０１２．７７（３）：５９３－５９９． 【１２】 ＬｉｕＹＬ，ＹａｎｇＹＭ，ＸｕＨ，ｅｔａ１．ＡｂｅｒｒａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＵＳＰ２２ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃ ｔａｌｃａｎｃｅｒ．ＪＳｕｒｇＯｎｃｏ１．２０１１．１０３（３）：２８３—２８９． 【ｌ３】 Ｔａｎｇ Ｂ，Ｔａｎｇ Ｆ，Ｌｉ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ ＵＳＰ２２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５． ６：１２６５４—１２６６７． 【１４】 Ｔａｎｇ Ｂ，Ｌｉａｎｇ Ｘ，Ｔａｎｇ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＳＰ２２ ａｎｄ Ｓｕｒ ｖｉｖｉｎ ｉｓ ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＩｎｔＪ Ｏｎｃｏ１．２０１５．４７：２２０８—２２１ ６． ［１５】 Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｌｕｏ Ｎ，Ｔｉａｎ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＵＳＰ２２ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｔｏ５－Ｆｕｂｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｄ４ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１７．８（１５）：２４７２８—２４７４０．
