５０ 生物学通报 ２０１０年第４５卷第９期 一种贴壁培养细胞制片方法水 方黎祥 刘芳芳 张婷婷 梁 妃 陈功星一 （杭州师范大学医学实验中心 浙江杭州 ３１００３６） 中国图书分类号：Ｑ一３３ 文献标识码：Ｂ 细胞形态分析以及免疫组织化学技术中一个 完成一个细胞培养孑Ｌ底板的熔割。最后，用镊子对 必不可少的操作过程，就是细胞制片，即把细胞附 分离的细胞培养孔底板边缘稍加修整，除去毛刺． 着于透明的支撑物上（比如：玻璃、塑料等），大部 完成细胞制片。 分的细胞制片是对离体组织细胞进行固定切片处 １．２．２细胞染色操作 参照《中华医学检验全 理，而对于科研、教学等基础实验室的少量培养细 书》 方法，加入苏木素染色液数滴，以刚好淹没 胞制片，则需要有更合适的技术。虽然已经有了商 培养孔中全部细胞为宜，ｌ０ １５ ｍｉｎ后，自来水漂 品化的内置玻璃片无菌培养皿用于培养细胞制 洗，用吸水纸包住制片的４周，用大拇指、食指和 片．取得了一定程度的成果，被广大生物医学基础 中指按捏制片４周及背面，吸去非细胞区水分，然 研究、教学人员认同，但该方法在某些方面还是存 后盐酸酒精脱色，最后浸入自来水中返蓝，同样方 在不足。本文将介绍一种贴壁培养细胞制片方法， 法吸去制片非细胞区水分，置玻璃片上于显微镜 将对基础实验室细胞生物学研究、教学提供一定 下观察并拍照。 的帮助。 ２ 结果 １ 材料与方法 经过熔割的培养细胞孑Ｌ底板制片呈圆形。直 １．１ 材料 小牛血清、ＲＭＰＩ一１６４０和２４孔细胞 径约１．５ Ｏ１１＇１，由于背面标数字，正面附着细胞，从 培养板均购于ＧＩＢＣＯ公司。手术刀、酒精灯、甲 正面看，数字是反写的（图１，本文附图见封三）。 醇、镊子均购于杭州华东医药器材公司，苏木素染 显微镜下图片饱满，层次分明，细胞大小均匀，分 色液（１ ｇ苏木素＋１０ ｍＬ无水乙醇＋２０ ｇ硫酸铝 布自然，界限明确，形态完整，没有皱缩现象。 钾＋０．５ ｇ氧化汞＋２００ ｍＬ蒸馏水）和１％盐酸酒精 Ｌ９２９细胞大部分为梭形，少部分接近圆形，与染 ｆ１份浓盐酸＋９９份７０％酒精１为本实验室自配。 色前细胞大小形状相同。细胞质浅蓝色，核呈现深 １．２ 方法 蓝，位于部位，占细胞的大部分（图２）。 １．２．１ 细胞制片操作 参照文献…，小鼠成纤维 ３讨论 细胞株Ｌ９２９．２×１０ｓ接种于６孔细胞培养板中，常 本文的贴壁培养细胞制片方法，是建立在以 规培养于含１０％的小牛血清（经５６℃水浴３０ ｍｉｎ 前工作基础之上的…，贴壁细胞简便染色方法可 灭活）的ＲＭＰＩ一１６４０培养液中，此完全培养基内 以拓宽使用．比如用工具取下制片后的有机玻璃 含１００ Ｕ／ｍＬ的青、链霉素，在３７℃、５％ＣＯ２浓度 培养孑Ｌ底板．成为一个传统意义上的细胞涂片。以 及饱和湿度条件下进行培养。２４ ｈ后，取出培养 满足其他不同要求的细胞处理。笔者在实践过程 板尽量弃去培养液，１ ２００ ｒｐｍ离心５ ｍｉｎ后，立 中，发现了本文的方法，首先，的细胞制片染 即用吸管吸弃６孑Ｌ板中分布在边缘的残余液体， 色效果与传统玻片相媲美（图２），也可以用于进 然后加人数滴甲醇固定３ ｍｉｎ。点燃酒精灯，加热 一步的细胞染色操作。比如免疫组化的反复洗涤 手术刀片，在细胞培养孔背面标上数字，然后继续 吸去非细胞区水分。简单方便。还有显微镜物镜的 加热刀片前１／３左右至红热，从背面细胞培养孔 多视野观察．物镜头可以到达细胞制片的任一地 边缘熔割，再加热、熔割，一般重复３次，就可以 方进行观察等。该方法也优于商品化的培养皿中 ￥浙江省科技厅分析测试科技计划项目资助（２００８Ｆ７００４５） 通讯作者 ２０１０年第４５卷第９期 生物学通报 ５１ 植物组织培养实验步骤的简化及其在探究性学习中的应用 李天一 杨 帆 （１中国人民大学附属中学 北京 １０００８０ ２教育部考试中心 北京 １０００８４） 摘要 用盆栽普通烟草幼苗为材料，以简化的植物组织培养实验步骤为基础，设计不同的 培养条件，探究了温度和光照对试管苗生长的影响，发现光温适宜的培养室中培养的再生植株 高度较低，叶片绿色；而高温弱光下培养的再生植株较高，叶片黄绿色。试管苗的这些生长差异 明显与温度的高低和光照的强弱有关 本文介绍的实验方法也可以用于探究ｐＨ、植物激素、培 养基的类型等对试管苗生长的影响。 关键词 烟草 组织培养 实验步骤 探究性学习 中国图书分类号：Ｇ６３３．９１ 文献标识码：Ｂ 植物组织培养在高中生物学课程中是一个重 和０．６５％琼脂，ｐＨ５．６～５．８。按照高中教材介绍的 要的内容，笔者利用暑假，以简化的植物组织培养 方法配制培养基母液、培养基及其高温灭菌。所用 实验步骤为基础，设计不同的培养条件，探究了温 的用具为高压蒸气灭菌锅、超净工作台、酒精灯和 度和光照对试管苗生长的影响，期望为利用植物 接种工具等等。具体操作如下： 组织培养进行探究性学习的学生提供一些切实可 取烟草幼叶，自来水冲洗后晾干。在超净工作 行的参考。 台上，用镊子将叶片放入无菌烧杯中，先用７０％ １ 实验原理 乙醇浸泡３０ ｓ，再用１Ｏ％次氯酸钠溶液表面消毒 植物的根茎叶细胞一般都具有全能性．在一 ６ ｒａｉｎ，然后用无菌水清洗３次。把消毒后的叶片 定的营养和激素条件下，可以脱分化形成愈伤组 放在无菌培养皿中，剪成０．５ ｃｍ 大小，接种到脱 织。将愈伤组织培养在含有不同激素成分的培养 分化和再分化ＭＳ培养基上，每个三角瓶中放置４ 基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽（不 个叶外植体。将接种后的三角瓶分成２组，一组放 定芽），进而培养形成完整的小植株。 在实验室中［温度（２５￣１）℃，光照１６ ｈ，光照强度 ２实验材料、用具和方法 ４ ０００ ｌｘ１，为光温适宜的培养条件；另一组放在夏季 实验材料为普通烟草（Ｎｉｅｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）品 自然环境的室内（温度３０ｃｃ左右，光照约１ ０００ ｌｘ）， 种Ｋ３２６盆栽幼苗。脱分化和再分化培养基为ＭＳ 为高温弱光的培养条件。定期观察记录实验结果。 基本培养基，添加０．２ ｍｇ／Ｌ ６一苄氨基嘌呤ｆ６一ＢＡ）、 当再生的试管苗生长到３ ｃｍ左右高时，从茎基部 ０．０２ ｍｇ／Ｌ一萘乙酸（ＮＡＡ）、３％蔗糖和０．６５％琼脂， 切离试管苗，将其转移到生根培养基中诱导生根， ｐＨ ５．６～５．８；生根培养基为１／２ＭＳ基本培养基（大 培养条件同上。 量元素浓度减半）。添加０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、１％蔗糖 ３实验结果和分析 置玻璃片的办法。仅是普通细胞培养板的简单加 在通风良好的环境中操作。 工，不需要付费：２４孔细胞培养板所用的试剂要 主要参考文献 少于商品化的培养皿，每个细胞制片均可以数字 １ 陈功星．贴壁培养细胞简便染色方法．生物学通报，２００７，４２ 标记（图１），可以根据折光性、数字的正反区别细 （１２）：４５． 胞附着面，这些对于着重于教学，培养学生动手能 ２李影林．中华医学检验全书．第１版．北京：人民卫生出版社． 力方面很有帮助。不过需要提醒一下，由于该方法 １９９６，５５９． 涉及到塑料加热，会有少量的难闻气体产生．尽量 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｘ＠ｈｚｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ） ２４孔细胞培养板制片 “一苏木素染色的Ｌ９２９细胞（×３２０） 种贴壁培养细胞制片方法”一文附图 图１示未安装金属铁丝屏蔽网的鼠笼（实验组）和安装屏蔽网的鼠笼（对照组）叠加放置在ｌ乜磁炉上。为防ｉＩ：实验ＩＩＩ 金属丝屏蔽网发热，安装金属丝屏蔽网的鼠笼被放置在对照组的Ｌ方。 图２图示实验过程巾，埘ｊｉｃ｛组小鼠任 笼中活动的情况。阁下方足电磁辐射强度检测仪（ 号ＬＺＴ一１ １５ｏ）￣示的辐射强度为１５３ Ｖ／ｍ “电磁炉电磁波辐射暴露对小鼠体重和血液免疫细胞数目的影响”一文附图 螋料滴管做成的漏斗 “一在发生渗透作用 渗透作用完成 种易推广的‘渗透作用’实验方法＂一文附图
