氧化应激心肌细胞PrOhibitin表达与分布变化及其生物学意义
目的分析应激心肌细胞prohibitin被氧化过程中的表达与分布变化，及其生物学意义。方法用过氧化氢对进行体外培养的大鼠心肌细胞干扰，将其作为应急心肌细胞氧化的模型；并用科学方法检查细胞培养溶液中乳酸脱氢酶的活跃性以及运用MTY实验来证实大鼠心肌细胞的受损情况；并利用蛋白质印迹技术来检查心肌细胞prohibitin在被氧化应激时，蛋白质的表达和分布变化情况，通过ATPase实验类测定线粒体的活性从而推断出线粒体氧化磷酸化的作用；最后运用流式细胞技术来判定线粒体的跨膜电势。结果氧化后乳酸脱氢酶的活跃『生明显高于对照组，但研究组细胞的成活几率远远小于对照组；通过ATPase实验类测定线粒体的活性下降了大约60个百分点；线粒体prohibitin的表达情况优于对照组。结论应激心肌细胞prohibitin被氧化后表达水平生物体的自我调节能力加强，并且开始慢慢向线粒体移动，氧化应激使心肌细胞线粒体受损，从而功能出现问题。
标签：氧化应激；心肌细胞；prohibitin；表达；分布变化
[文献标识码]A
当生物体受到损伤时，细胞内的代谢产物会增多，或者在细胞的抗氧化能力不足时，也会造成细胞内的活性氧堆积。这种情况会毒害细胞，造成细胞损伤。这种不平衡现象叫做氧化应激。经过医学界多年研究，统计得知，激烈运动，缺血，缺氧等都会造成袭击细胞损伤，从而产生氧化应激反应。通过仔细研究，发现线粒体是氧化应激的主要攻击目标，细胞内的氧份不平衡会使线粒体的结构和功能受损，目前医学界还不能确定损伤原理。该研究主要对大鼠的心肌细胞核线粒体做了严谨的实验，发现慢性束缚应激大鼠心肌细胞线粒体prohibitin表达水平明显升高，从而分析应激心肌细胞prohibitin被氧化过程中的表达与分布变化，及其生物学意义。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
本实验动物采用Wistar大鼠，体重约为11—15g，实验共用50只大鼠，乳酸脱氢酶试剂盒从上海科华东菱诊断用品有限公司选购。prohibitin单克隆抗体从上海新肽生物科技有限公司购进，兔抗人环氧化物酶一2单克隆抗体从上海亿欣生物科技有限公司购进，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗则从上海史瑞可生物科技有限公司购进，其他实验材料全部从美国Sigma公司购进。
1.2方法
①心肌细胞的培养。首先将大鼠心脏取出，并磨碎，用浓度为0.25的胰酶消化液来讲心肌细胞分离，并将细胞放于浓度为10的胎牛血清MEM培养液中
培养，经混合液放于温度为37℃，C02浓度为5的环境中进行培养。最后选取自律性搏动>100b/min的心肌细胞用于实验。 ②细胞死亡检查方法。将心肌细胞放置于含有浓度为0.1%的多聚赖氨酸的玻璃板上，按照上述建立模型的方法对细胞进行处理。并将其中加入浓度为锄的多聚甲醛固定液，并放置30rain，然后将固定液清除，振荡15min。加入Hoechst33258染色液，并再次振荡15min。最后放在显微镜下观察。并记录细胞死亡的数量，计算死亡率。 ③乳酸脱氢酶活跃性检测。采用先进的试验方法，按照采买的乳酸脱氢酶试剂盒的要求进行检测。将体积为1mL的实验液和200μL的心肌细胞培养溶液按照规格加入1cm的光程比色杯中，并搅拌均匀。并将其放置在温度为37℃的环境下3s，记录初始时期的吸光度，在防止1分，2分，3分时分别记录吸光度，并以每分钟为单位计算出吸光度的变化程度。 ④心肌细胞活力检测。运用MTT实验来检测心肌细胞的活力。首先将大鼠心肌细胞放置于96孔板之上，并根据研究的实际情况来确定培养时间。将原来的培养溶液换成没有血清MEN培养基，并在96孔板的每个孔中加入MTY溶液，将其放置在温度为37℃，CO2密度为5%的环境下4h，停止培养，将孔内的培养液上层溶液消息提取出来，再向每个孔中加入150μL的DM-SO，充分振荡，时间为10min，使后加入的液体充分溶解，并用专业仪器检测各孔的吸光度，并将其记录。
⑤通过ATPase实验类测定线粒体的活性从而推断出线粒体氧化磷酸化的作用。 ⑥最后运用流式细胞技术来判定线粒体的跨膜电势。 ⑦利用蛋白质印迹试验检测氧化应激心肌细胞及线粒体中prohibitin表达变化情况，并做好记录。
1.3统计方法 使用SPSPSSll.0软件对所得数据进行统计，计量资料以（x±s）表示，进行t检验，计数资料进行x2检验。
2结果
2.1氧化应激致心肌细胞损伤情况 研究组与对照组相比，乳酸脱氢酶的含量明显升高且经统计学原理检测，结果差异有统计学意义（P＜0.05），且通过实验可知当过氧化氢浓度为200μmol/L时，对心肌细胞的损伤最大；MTY实验研究则显示用过氧化氢处理过的研究组的心肌细胞的活力明显小于对照组。而Hoechst染色实验则显示，未经处理的对照组细胞核均为蓝色，且细胞质没有聚合现象。而过氧化氢研究组的细胞核则被染色，且细胞质聚积，有的已经碎裂，细胞已经呈现死亡状态，细胞的死亡率较对照组而言，明显升高。
2.2线粒体情况
为方便读者阅读，特将线粒体情况整理成统计学格式，如图1。氢处理后的3h以后，有显著提高。随着过氧化氢处理时间的延长，prohibitin表达下降到普通水平，线粒体中的PI-IB含量在心肌细胞被过氧化氢处理后的变化并不显而易见，处理6h以后，PHB在线粒体中的容量才有所上升，随着时间的增长，持续较高水平，并且开始向线粒体缓慢移动。
3讨论 通过本实验可知，过氧化氢会引起心肌细胞损伤，并释放出大量的
LDH，严重时，心肌细胞甚至会死亡，通过MTT实验可知，线粒体情况与琥珀酸脱氢酶活性的多少成正比。琥珀酸脱氢酶是一种催化酶，存在于线粒体膜内部，这种酶会促进生成FADH2，FADH2又会联合其他物质形成腺嘌呤核苷三磷酸，应激氧化的损伤导致线粒体损伤，将导致呼吸链复合体失活，降低线粒体形成腺嘌呤核苷三磷酸的能力，腺嘌呤核苷三磷酸合成减少，线粒体能量代谢会被抑制。线粒体跨膜电位降低是线粒体结构功能损伤的早期反映指标。氧化应激心肌细胞线粒体膜电位降低，使得心肌细胞发生死亡，使得其功能发生不可逆转的损伤。本次试验表明，应激心肌细胞prohibitin被氧化后表达水平生物体的自我调节能力加强，并且开始慢慢向线粒体移动，氧化应激使心肌细胞线粒体受损，从而功能出现问题。
