纳米材料在糖组学中的应用

纳米材料在糖组学中的应用

摘要：本文简要介绍了糖组学作为一门学科研究的内容、诞生的历史、现状及发展的趋势；详细论述了糖组学在研究中的一些技术方法和一些纳米材料在糖组学中的研究与应用。

关键词：糖组学；研究方法；纳米材料；应用

糖组学(glycomics)是研究糖组结构与功能的科学，糖组学研究包括大小只有纳米尺寸的聚糖组(糖蛋白组、蛋白聚糖组和糖脂组)的分离与纯化、糖链组(糖蛋白糖链组、蛋白聚糖糖链组和糖脂糖链组)的分离、糖链的结构解析和定量及糖链性质和功能的研究[1]。早在20世纪60年代人们发现在细胞表面上密布有糖缀合物，推测这些糖缀合物糖链在生命过程中担负分子识别的功能。70年代由于物理化学测定方法的建立以及特异的内切和外切糖苷酶在结构测定中的应用，使结构测定成为可能，揭示出糖链惊人的复杂性和多样性。80年代末负责糖链合成的糖基转移酶的克隆，揭示糖链多样性是在基因水平和蛋白质水平上进行的。这些进展为糖链的结构功能研究的明确奠定了坚实的基础，并直接导致了在1990年首次发现糖链的生理功能。由此糖组学作为一门新兴的科学诞生[2]！目前糖组学在技术研究方面主要解决的问题是糖链结构分析和合成方法的建立。在糖链的分析上需要建立高分辨率、快速的序列测定和构象研究方法及模型；在合成上需要建立高效的糖链合成方法。在功能研究方面，主要是研究糖链合成与代谢途径和糖链在细胞内、细胞间的功能,其前沿领域为纳米尺寸的糖基化、蛋白质与糖链的相互作用及糖在微生物感染中的作用三个领域。糖组学的研究完全依赖于糖组学技术的发展，糖组学技术的发展，直接地促进了糖组学的发展。糖组学的应用主要依赖糖链功能的研究，对这些前沿领域的认识极大地促进糖组学在生命临床上应用。本文主要论述了塘组学研究中的一些技术方法和一些生物小分子纳米材料在糖组学中的应用。

1 糖组学研究的方法

糖组学的研究方法主要是在聚糖组的分离与纯化、糖链的分离及糖链的结构解析和定量研究过程中衍生出的一系列技术方法。

1.1 聚糖组的分离与纯化

1.1.1 糖蛋白组

纳米糖蛋白兼有多糖和蛋白质的性质，大多可溶于水、稀酸或稀碱溶液，大多根据需要用不同的溶剂进行提取分离。如利用糖蛋白特有的性质将糖蛋白与非糖蛋白进行分离。具体可采用Sevage 法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法和脱色素法等[3,4]。

从纳米糖蛋白中纯化特定类型的糖蛋白主要根据糖蛋白的性质来采用不同的方法。如要获取不含无机盐等小分子杂质的糖蛋白可用透析法；获取特定溶解度的糖蛋白可用乙醇、硫酸铵、丙酮进行分级分离的分步沉淀法；获取酸性和中性糖蛋白可用季胺盐沉淀法，如十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基吡啶沉淀法等；获取特定分子直径的糖蛋白可用滤膜超滤法；获取特定分子质量和等电点的糖蛋白可用区域电泳法等[5]。

1．1.2 蛋白聚糖组

纳米蛋白聚糖是一类特殊的糖蛋白，其分离纯化蛋白聚糖方法与糖蛋白的纯化方法基

［6］本一致，一般利用不同孔径的凝胶过滤层析来分离蛋白聚糖，如聚集蛋白聚糖(aggrecan)

和基底膜蛋白聚糖( perlecan)可用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500或S-1000、琼脂糖凝胶CL-2B来分离；核心蛋白聚糖(decorin)和双糖链蛋白聚糖(biglycan)，部分降解的蛋白聚糖等可

用Superose-6分离；此外，膜联蛋白(annexin)和半乳糖凝集素对糖胺聚糖有特异识别[9］，可用凝集素亲和色谱对含膜联蛋白糖胺聚糖进行分离[7-9]。

1．1.3 糖脂组

含鞘氨醇或甘油酯的纳米鞘糖脂因与人类生命活动及生物、医药关系较为密切，是真核生物糖脂研究的主要类型。从生物样品(如组织和体液)中提取含鞘氨醇或甘油酯的鞘糖脂，一般采用大孔吸附树脂柱层析法［10］、柱层析色谱法、薄层层析印迹法、高效液相色谱和逆流色谱［11］等进行。从糖脂中纯化特定类型的鞘糖脂，一般通过DEAE-Sephadex A-25、硅胶柱层析及薄层层析、基于支持液-液分离系统的逆流色谱、离心分配色谱和液滴逆流色谱等进行［12］。

1.2 糖链的分离

N-糖基化和O-糖基化是糖基化最常见的两种形式，也是糖组中研究的主要对象。对于N-糖链的分离，常用的方法有化学法和酶法等。对O-糖链的分离常用化学法。如内切α-N-乙酰半乳糖胺酶可识别O-糖链中乙酰半乳糖与半乳糖之间的连接［13］。化学法中肼解法和还原性β-消除法［14］，常分别用于N-糖链和O-糖链的释放。

糖链的富集方法主要根据所分析目标物的特点进行选择，同时可将多种糖链富集方法联合使用，以达到最好的富集效果。如用刀豆凝集素，荆豆凝集素和蓖麻凝集素3种凝集素对几种模式生物N-糖基化糖蛋白进行富集［15］；用石墨炭柱和石墨烯纤维素和琼脂糖对糖链进行有效富集［16,17］；使用弱阴离子交换-HPLC根据样品中唾液酸的含量，进行轻度去唾液而将糖链有效富集［18］等。

1.3糖链的结构解析和定量研究

1.3.1 结构解析

对于糖链结构解析的主要手段有生物质谱、核磁共振、色谱技术、凝集素芯片等。如将刀豆凝集素和雪莲花凝集素固定于环氧化修饰的玻片表面，用Cy3标记标准糖蛋白核糖核酸酶B，利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法，初步检测分析了正常肝细胞总蛋白中糖蛋白的糖链构成［19］；

1.3.2 定量研究

对糖链定量研究的方法主要是稳定同位素标记法[20-23]和代谢标记法[24]。如对糖链进行化学衍生后用稳定同位素标记，结合质谱对其进行相对定量分析。对不同样品糖链进行标记，再将其按比例混合进行质谱分析，相同的糖链因所带同位素质量不同而产生一对特征峰，对不同来源的同种糖链之间的丰度进行比对，从而达到相对定量；又如己糖合成中谷氨酰胺侧链氨基上的氮是GlcNAc、N-乙酰半乳糖糖胺(N-acetylgalac-tosamine，GalNAc)和唾液酸生物合成中唯一的氮源，在培养基中加入重氮标记的酰胺-[15N]-Gln便可在代谢过程中将15N标记到细胞中所有的氨基糖上，则N-和O-连接的聚糖、糖脂以及在细胞外基质的蛋白聚糖中的每个氨基糖均增加1U。通过对分别加入轻重两种谷氨酰胺培养基培养细胞的糖蛋白糖链质谱检测的同位素标记的对峰的信号强度进行比较即可对己糖进行定量。

上面论述的糖组学的研究方法主要是一些简单的物理化学反应方法，对于一些新型的研究方法的开发有待于分析技术的创新和相关仪器的改进。对研究方法的改进可极大地促进糖组学科的发展，这也是糖组学以后重要的发展趋势。

2 纳米材料在糖组学中的应用

纳米聚糖是糖组学的主要研究对象，其中研究内容包括结构和功能两方面，由于纳米聚糖往往和蛋白质相连，为了更好地与蛋白质组学相连,研究对象一般为纳米糖肽。糖组学研究的重点包括：(1)编码纳米糖蛋白的基因；(2)实际糖基化的位点；(3) 纳米聚糖结构；(4)糖基化作用[25]。对这些重点课题的研究都离不开对相关纳米材料的研究。

2.1 糖基化基因信息的应用研究

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程，其中在肽链合成的同时或合成后,在酶的催化下,糖链被接到肽链上特定的糖基化位点,该过程称为蛋白质糖基化[26]。蛋白质上连接的纳米聚糖可以影响蛋白质的结构和活性，许多病原性疾病, 如自身免疫疾病、病毒性疾病、糖尿病、恶性肿瘤、风湿性关节炎、动脉粥样硬化和多达到50种以上遗传疾病，都是由异常糖苷化或缺少糖苷化酶所引起[27]。由于糖不是基因的直接表达产物，却由基因编码的糖基转移酶和糖合成酶特异反应合成的产物，对编码糖蛋白的纳米尺寸基因进行研究与应用，是糖基化应用研究的第一步，有助于通过控制基因信息操作蛋白质上的纳米寡糖链，使之具有正常的生物学功能，对于疾病的治疗具有重要的意义。

2.2 糖基化位点的应用研究

基因组计划为人类提供基本的遗传信息,然而许多基因的功能仍需要进一步阐明。其中的关键的过程是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化是最主要的翻译后修饰之一[28]。细胞中的蛋白质即使经历相同的糖基化机制和分泌途径，也并非所有的潜在位点均可被糖基化，因为生物体内存在着某些因素控制着蛋白质的糖基化[29]。所以对纳米尺寸的糖基化位点进行研究与应用有助于准确地对这些蛋白质的翻译后修饰。

2.3 纳米糖链功能的研究

纳米糖链一般由相同或不同型的单糖聚合而成，可存在，也可与配基结合成更复杂的复合物。由于3个不同的氨基酸分子只有27种三肽排列方式(含重复使用)，而3个不同的单糖分子可组成数千种三糖结构，所以纳米糖结构的复杂性远远高于蛋白质和核酸[30]。尽管与DNA携带遗传信息或蛋白质进行酶催化反应不同，但纳米聚糖确实携带信息并具有重要的生理功能，在诸如细胞间通讯、蛋白折叠、细胞吸附和免疫识别等生物过程中都起核心作用，进而影响细胞发育、分化、形态、肿瘤转移、微生物感染等[31-33]。所以对纳米糖链功能进行研究与应用有助于控制这些生物过程。

2.3.1 标记功能

纳米糖链作为信号标记，在识别和被识别反应过程中起着独特的作用[34,35]。纳米糖链与配基的结合不仅指明配体的特征性(包括局部的组织、细胞或某类生物大分子等)，还在传递相应信号时具有协同配体的功能。纳米糖链与配基构成的分子内结构互补关系是许多含糖生物大分子生理活性所必需的。在糖蛋白中,纳米糖链结构可以直接影响肽链构象和由构象决定的所有功能。糖脂间的纳米糖链相互识别并互补性结合，引起细胞粘附[34]；对纳米糖链标记功能的研究与应用有助于了解这些识别、结合和粘附过程，并控制糖蛋白表达肽链构象和由构象决定的所有功能。

2.3.2 细胞免疫功能

免疫系统中许多识别与消除病原体的分子都是纳米糖蛋白、纳米寡糖结合到纳米糖蛋白上，通过纳米单糖残基与受体的多种相互作用来激发免疫功能[36]。目前已证明多种纳米寡糖对免疫功能都有促进作用，但具体的作用机理还需深入研究。所以对细胞免疫功能的

研究与应用有助于深入这些机理，可更好的消除病原体的分子。

2.3.3 血型抗原

所谓血型是指血红细胞膜上具有不同类型纳米寡糖链的纳米糖蛋白和纳米糖脂分子与相应的血清抗体所构成的识别体系。在ABO血型中，膜糖蛋白的肽链部分基本相同，纳米糖链也只有微小差异(纳米糖链非还原端一个单糖的差异)，但生理功能的差别极大。对血型抗原的应用研究有助于了解这些微小差异，控制表达不同生理功能的血液。

2.3.4 细胞恶化标记

纳米膜糖蛋白在信息的识别与传递方面独特的性能，通常是建立在精确、严格的糖链多样化结构的基础上，在基因本身或由环境因素诱导而发生遗传变异情况下，这种结构易被打破。对这些结构进行标记，有利于找到恶化细胞，提高清除恶化细胞的准确性。

2.3.5 水溶性

纳米糖分子的水溶性极高，与蛋白质或脂肪纳米大分子结合，可大大提高这类分子的亲水性能并改善分子的疏水-亲水平衡点，更重要的是有助于改善蛋白质的功能以及其他理化性能。对糖分子的水溶性的应用研究，有利于控制表达特异功能和物化性能的蛋白质。

2.3.6 保护性

纳米糖链分子上的酸性糖基(如唾液酸、糖醛酸等)对蛋白质具有保护其稳定、延长半衰期的作用，在一定范围内可降低或免除水解酶对纳米肽链的降解或阻止抗体的识别。所以对纳米糖链分子保护性能的应用研究，有利于生物体控制表达稳定、特异的蛋白质，在

不同层次上起到抗病、防病和愈合保护等作用。

2.3.7 修饰作用

修饰作用主要表现在:(1)纳米糖链直接参与蛋白质在内质网和高尔基体中的折叠过程；(2)增强蛋白质的免疫亲合力；(3)纳米糖链对生物大分子进行空间定位。所以对纳米糖链分子修饰作用的应用研究，有利于对生物体表达特异功能的蛋白质。

影响纳米糖链生物功能的因素有很多，深入研究这些因素对纳米糖链的作用规律，需进一步从分子生物学的水平上探讨纳米糖链的功效[37]。揭示糖对生物体的作用机理，可减少生物遗传疾病的发生，为人类的健康事业做出贡献。

2.4 纳米糖药物应用研究

许多常用药物就结构来说就属于纳米糖类化合物。但很长一段时间内，糖只是作为生物体内能量转化和结构组成的物质被认识。随着分子药理学的发展，发现临床上许多药物都是通过作用于分子糖而产生效用[39- 39]。所以对纳米糖药物的应用研究有利于准确、高效地合成药物。

3 总结与展望

总体来说，糖组学是一个刚刚诞生的学科，发展仍处于初级阶段，基础研究很不完善，研究方法还比较少，实际应用范围还比较窄，大多仍处于开发研究阶段。相信不久的将来，随着糖组学的深入发展、糖链分析技术的创新和相关仪器的发展，糖组学研究必将会有新的突破和进展，深入研究糖蛋白或糖链结构及其作用机制，对揭示复杂生命现象、预防及

治疗疾病及实际应用具有非常广泛的意义。

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