金山区柯萨奇病毒A组6型基因特征分析

·疾病控制·2017—2018年金山区柯萨奇病毒A组6型基因特征分析董兆鹏，孙箐爽，臧昊，王唐，蔡光，宋灿磊，李淑华

上海市金山区疾病预防控制中心，上海

201599

摘要：目的分析上海市金山区2017—2018年分离的柯萨奇病毒A组6型（CoxA6）VP1基因特征和氨基酸位点突变，为手足口病防控提供依据。方法

对金山区2017—2018年采集并分离到16株CoxA6分离株VP1全长基因进行扩增、

测序、序列比对，构建系统发生树，分析核苷酸和氨基酸同源性以及氨基酸位点突变。结果金山区16株CoxA6分离株均属于E2亚型同一个进化分支，16株间VP1基因核苷酸同源性为92.3%～97.7%，氨基酸同源性为和98.4%～100.0%。与金山区16株分离株同源性最高的是2018年山东分离株MK357081/CHN/SD/JN/2018，核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7%～99.3%和98.7%～99.7%。13株CoxA6分离株VP1氨基酸序列存在氨基酸位点变异，涉及8个氨基酸变异位点，但在抗原表位重要位点201D、243H、245R、247Y、248M和249R均未检测到抗原漂移。结论流行的主导基因型，金山区CoxA6VP1存在氨基酸突变位点但未涉及关键的抗原表位。关键词：柯萨奇病毒A组6型；VP1基因；系统发育分析；同源性分析；抗原表位中图分类号：R373.23

文献标识码：A

文章编号：2096-5087（2019）11-1136-04

16株

CoxA6分离株核苷酸和氨基酸序列高度同源且位于E2亚型同一进化分支；CoxA6E2亚型可能是金山区2017—2018年

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见传染病，患者多为5岁及以下儿童［1-2］。自2008年芬兰出现柯萨奇病毒A组6型（CoxsackievirusA6，CoxA6）手足口病暴发以来，CoxA6已成为世界范围内手足口病的主要病原体之一

［3-4］实时荧光定量PCR法检出16例CoxA6阳性标本。1.2方法1.2.1

核酸提取

16例CoxA6阳性标本经RD细胞

培养2代后，收集细胞培养上清液并提取病毒核酸备用。按照QIAampViralRNAminiKit试剂盒（QIAGEN，52904）说明书手动提取病毒核酸，提取RNA溶解于30滋L无RNA酶的水中，冻存于-80℃冰箱备用。1.2.2

VP1基因全长序列PCR检测

以上述提取的

病毒核酸为模板，采用两步法扩增VP1片段全长。实时荧光定量反转录PCR检测采用AppliedBiosystemsTM7500FastRT-PCR仪。反转录采用商业化反转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit（PerfectRealTime）（TaKaRa，RR037A），引物为试剂盒自带的6碱基随机引物，反转录条件：42℃45min，85℃5s，4℃保存。PCR体系采用本实验室自配25滋L反应体系：2×EsTaqMasterMix（Dye）（CWBIO，CW0690M）12.5滋L，上游引物CV-A6-F（25滋M）0.625滋L，下游引物CV-A6-R（25滋M）0.625滋L，cDNA2滋L，RNase-Free水9.25滋L；反应条件：预变性95℃3min；变性95℃30s，退火54℃30s，延伸72℃2min，循环32次；72℃10min延伸，4℃保存。PCR引物参考文献［11］：上游引物CoxA6-F：5'-TCCGTCGACAAATGAATGATCCCAT-

，广泛流行于西太平洋地

区，包括中国［5］、新加坡［6］和日本［7］等地。我国局部地区CoxA6型手足口病呈暴发式流行，其发病率和死亡率逐年升高

［8-9］。有研究显示，自

2013年起，CoxA6已取代肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）和CoxA16成为上海市手足口病的主要病原体［10］。本研究对金山区2017—2018年分离的16株CoxA6分离株的VP1基因特征、与国内外其他地区分离株的遗传进化关系及抗原表位漂移情况进行分析，为CoxA6的遗传进化情况和手足口病防控提供参考。现将结果报道如下。1材料与方法1.1

材料

金山区2017—2018年传染病疫情监测过

程中采集193例手足口病患者的肛拭子或咽拭子，经

DOI：10.19485/j.cnki.issn2096-5087.2019.11.014基金项目：上海市卫生计生委科研课题（20184Y0023）

作者简介：董兆鹏，硕士，医师，主要从事肠道病毒分子流行病学研究

工作

通信作者：李淑华，E-mail：hsli167@163.com

预防医学2019年11月第31卷第11期PrevMed，Nov.2019，Vol.31，No.11

1137窑窑TACAAATG-3'；下游引物CoxA6-R：5'-GCACT-CGAGCTATTAAGATGTCCTTTGTGGGTTTG-3'。PCR产物经基因测序后，通过美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）在线的基本局部对齐搜索工具（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）对PCR产物再次进行鉴定。16株CoxA6分离株VP1基因全长序列均已上传GenBank数据库，GenBank登记号分别为MN233821-MN233836。1.2.3

CoxA6VP1测序和系统发育分析

CoxA6VP1

全长序列通过一代测序获得。将获得的金山区CoxA6VP1片段和从GenBank下载的国内外其他地区CoxA6代表株VP1全长序列构建数据库（n=88），采用MEGA-X软件进行序列比对；通过IQ-TREEv1.6.11ModelFinder［12］确定最佳的核苷酸替代模型为一般时间可逆（generaltimereversible，GTR）+I+Gamma模型，采用该模型构建金山区16株CoxA6分离株与国内外其他地区分离株的最大似然（maximumlikelihood，ML）系统发育树，分析金山区与国内外其他地区CoxA6分离株的遗传进化关系及核苷酸和氨基酸同源性，Bootstrap值设为1000。1.2.4

氨基酸变异位点分析

采用MEGA-X软件将

比对后的VP1全长基因核苷酸序列翻译为氨基酸序列，通过变异位点查询功能检索氨基酸序列变异位点，并与已确认的CoxA6关键抗原表位201D、243H、245R、247Y、248M和249R进行比较，确定金山区CoxA6分离株的抗原漂移情况。2结果

2.1

CoxA6分离株VP1基因序列和系统发育分析

16株CoxA6阳性标本测序后手动补齐两端因测序缺失的少数碱基，默认两侧缺失的碱基序列未发生变化。测得的VP1序列通过BLAST搜索显示16株分离株均为CoxA6。16株分离株间VP1基因的核苷酸同源性为92.3%～97.7%，氨基酸同源性为98.4%～100.0%。

系统发育分析显示，金山区16株CoxA6分离株位于同一进化分支，与引起全球首次关注CoxA6感染的2008年芬兰分离株同被划分为E2亚型。2013年以后的中国分离株绝大多数被划分为E2亚型，其中包括4株2014—2015年上海市非金山区分离株。2008—2011年中国分离株构成了D基因型的主体，其中包括1株2011年上海分离株。1992年和1996年山东分离株JQ3886/CHN/SD/1992和

JQ3887/CHN/SD/1996则因更远的亲缘关系分别被划分为B和C基因型。见图1。

注：●代表上海金山分离株，■代表上海非金山分离株，○代表引起全球首次COXA6暴发的芬兰分离株，▲代表与金山分离株亲缘关系最近的2018年山东分离株，◆代表COXA6原型株。

图1基于CoxA6VP1全长核苷酸序列的系统发生树（ML法）

1138窑窑预防医学2019年11月第31卷第11期PrevMed，Nov.2019，Vol.31，No.11

2.2CoxA6VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分析

金山区CoxA6分离株与E2亚型内其他分离株、E1亚型分离株核苷酸同源性分别为92.3%～99.3%和.2%～92.9%，氨基酸同源性分别为97.0%～100.0%和96.7%～99.7%；与A～D基因型分离株型间核苷酸同源性均低于91%，与D基因型氨基酸同源性较高，最高为99.0%，而与C基因型氨基酸同源性均低于95.0%。配对同源性分析显示，金山区分离株与2018年山东分离株MK357081/CHN/SD/JN/2018亲缘关系最近，核苷酸同源性为95.7%～99.3%，氨基酸同源性为和98.7%～99.7%；与同属E2亚型的2014—2015年上海市非金山区分离株核苷酸同源性为92.8%～97.9%，氨基酸同源性为97.0%～99.3%。见表1。

表1金山区16株CoxA6分离株与其他代表株VP1基因核

苷酸和氨基酸同源性

（%）基因型核苷酸同源性氨基酸同源性

A82.8～83.795.1～96.4B82.7～83.795.7～97.0C83.2～85.493.1～94.8D86.6～90.496.1～99.0E1.2～92.996.7～99.7E292.3～99.397.0～100.0E2上海株

92.8～97.9

97.0～99.3

2.3氨基酸变异位点分析对包含金山区16株

CoxA6分离株在内的48株E2亚型VP1基因氨基酸序列进行比对分析。通过检索发现金山区13株Cox-A6分离株VP1氨基酸序列存在氨基酸位点变异，其中MN233830/CHN/SH/Jinshan172存在4个变异位点，MN233831/CHN/SH/Jinshan148存在3个变异位点，MN233834/CHN/SH/Jinshan43、MN233825/CHN/SH/Jin-shan139、MN233835/CHN/SH/Jinshan185、MN233836/CHN/SH/Jinshan188各存在2个变异位点，MN233833/CHN/SH/Jinshan70、MN233824/CHN/SH/Jinshan116、MN233829/CHN/SH/Jinshan141、MN233823/CHN/SH/Jinshan170、MN233821/CHN/SH/Jinshan173、MN233828/CHN/SH/Jinshan178和MN233832/CHN/SH/Jinshan179各存在1个变异位点。金山区CoxA6分离株VP1氨基酸序列共涉及8个氨基酸变异位点，其中第29位5株为V、1株为L，第174位3株为I，第283位7株为A。金山区分离株VP1氨基酸序列未检测到抗原表位201D、243H、245R、247Y、248M和249R存在抗原漂移。见表2。

表2CoxA6VP1氨基酸变异位点分析

代表株

变异位点

2976137174270283287291MH111055/CHW/AUS/2017AVNVNTSTKX0308/CHN/SH/2015........MF991295/CHN/JS/Nanjing/2013..SI....KX595286/CHN/GD/Shenzhen/2014..S.....KT779413/CHN/JL/Changchun/2013........MH539787/IND/2016..S.....MH049748/HK/2015

...I....KX752785/CHN/SD/Weifang/2014........KX430800/VNM/2014.....A..MH111054/AUS/CHW/2017........KY126092/CHN/SD/weihai/2015...I.A..KX595285/CHN/GD/Shenzhen/2014...I....KX0293/CHN/SH/2014........KX1194/CHN/GD/2013...I....MF578380/VNM/2013T.......KM114057/FIN/2008..S.....CHN/SH/Jinshan173.....A..CHN/SH/Jinshan176........CHN/SH/Jinshan170.I......CHN/SH/Jinshan116.....A..CHN/SH/Jinshan139.....A.RCHN/SH/Jinshan78........CHN/SH/Jinshan151........CHN/SH/Jinshan178V.......CHN/SH/Jinshan141L.......CHN/SH/Jinshan172V.S..A.ACHN/SH/Jinshan148V...TA..CHN/SH/Jinshan179V.......CHN/SH/Jinshan70V.......CHN/SH/Jinshan43...I..N.CHN/SH/Jinshan185...I.A..CHN/SH/Jinshan188

.

.

.

I

.

A

.

.

注：“.”表示与首行分离株氨基酸序列一致。

3讨论

肠道病毒VP1基因编码病毒VP1蛋白，VP1蛋白位于病毒衣壳表面，既是肠道病毒抗原决定簇所在部位，也是病毒与宿主受体结合的部位，VP1编码区是肠道病毒基因型别划分的主要依据［13］。国内外目前尚无公认的CoxA6家系划分标准，本研究参考BIAN等［14］家系划分方法，将CoxA6划分为A～E5个基因型。金山区16株CoxA6分离株均位于E2亚型同一进化分支，提示CoxA6E2亚型是引起2017—2018年金山区手足口病的优势流行株，与WANG等［10］对2013—2016年上海市CoxA6分离株的分子流行病学研究结果基本一致，且具有一定的延续性，在未来很长时间内E2亚型可能是上海市CoxA6的主导基因型。

预防医学2019年11月第31卷第11期PrevMed，Nov.2019，Vol.31，No.11

1139窑窑CoxA6VP1核苷酸和氨基酸同源性分析显示，这16株CoxA6分离株在与A～C基因型核苷酸同源性均低于86.0%的情况下，氨基酸同源性达93.1%～97.0%；与D基因型核苷酸同源性低于90.5%的情况下，氨基酸同源性达96.1%～99.0%，D基因型氨基酸序列与属于E2亚型的金山区分离株高度同源，表明CoxA6VP1区存在较多同义突变。通过检索VP1氨基酸突变位点并与已确认的CoxA6关键抗原表位进行比较，发现金山区分离株VP1基因仅存在不涉及抗原表位的氨基酸位点突变，但值得注意的是金山区分离株7株283位为A，5株29位为V，具有一定的地域进化特征。

综上所述，金山区CoxA6感染以E2亚型为主导基因型，分离的这16株CoxA6与2018年山东分离株MK357081/CHN/SD/JN/2018亲缘关系最近；金山区CoxA6VP1存在氨基酸突变位点但未涉及关键的抗原表位。本研究初步掌握了金山区2017—2018年CoxA6分离株VP1片段的遗传进化特征及氨基酸位点变异情况，为金山区CoxA6遗传进化和流行规律积累了基础数据，并为金山区手足口病防控提供了参考依据。本研究仅针对CoxA6VP1全长基因进行分析，缺乏本地CoxA6分离株全基因组序列信息；样本量较小，获得的CoxA6分离株遗传进化特征不能完全代表2017—2018年金山区流行的所有CoxA6的特征，未来仍需持续加强手足口病病原谱监测，进一步扩大样本量并结合全基因组信息进行分析。

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收稿日期：2019-08-02修回日期：2019-09-03本文编辑：徐文璐

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