重组人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的制备

第４５卷第３期　２Ｏ１３年９月　东北师大学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｖｏ１．４５　ＮＯ．３　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１３　［文章编号３１０００—１８３２（２０１３）０３—０１２６—０４　ｄｏｉ：１０．１ｌ６７２／ｄｂｓｄｚｋ２Ｏ１３—０３—０２６　重组人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）单克隆抗体的制备　徐多多，李思静，李芳芊，潘鹏涛，吴　靖，王　丽　（东北师范大学遗传与细胞研究所，吉林长春１３００２４）　［摘　要］　为制备人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）单克隆抗体，制备并纯化了ＶＥＧＦ蛋白，通过　免疫、细胞融合、筛选等方法获得了能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株；采用小鼠腹腔接种法　制备腹水，并用Ｇ蛋白（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ）亲和层析柱对抗体进行了纯化；采用间接ＥＩ　ＩＳＡ及　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实验分别对纯化后的抗体进行了效价测定和特异性验证．结果表明：此方法可成　功筛选出能稳定分泌ＶＥＧＦ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化后腹水抗体效价为１：１　０２４；　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检验证实制备的单克隆抗体能特异性识别ＶＥＧＦ蛋白．　［关键词］ＶＥＧＦ；单克隆抗体；ＥＬＩＳＡ　［中图分类号］Ｑ　８１３．２　［学科代码］１８０・７１２０　［ＳＺ献标志码］Ａ　血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）是一种诱导血管生成及增加血管透性的重要蛋白质，最早是在１９８９年　由Ｌｅｕｎｑ等人在牛的垂体星状细胞培养液中提纯出来的ｌ＿１］，是一种重要的促血管生成因子．研究证明它　是一种同源二聚体糖蛋白　］，由两个相同多肽链通过二硫键构成．细胞在生长过程中需要这种生长因子　的促进作用，尤其是肿瘤细胞在生长和转移过程中更离不开ＶＥＧＦ的作用．近年来许多学者的研究发　现，肿瘤患者血清中ＶＥＧＦ蛋白含量明显高于健康人Ｉ３　；此外，血管的生成及细胞增生程度也与　ＶＥＧＦ的表达水平有着密切关系［６］，且其过度表达影响肿瘤的转移和侵袭．基于以上理论基础，本文应　用杂交瘤技术制备了ＶＥＧＦ单克隆抗体，以为开发检测ＶＥＧＦ的试剂奠定基础．　１材料与方法　１．１　材料　雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，购于吉林大学公共卫生基础医学院实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）、　重组质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＶＥＧＦ、大肠杆菌ＤＨ５ａ、ＢＬ２１由本实验室保存；Ｎｉ—ＮＴＡ琼脂糖凝胶购自德国　ＱＩＡＧＥＮ公司；ＩＰＴＧ购自鼎国生物有限公司；尿素、Ｎａ。ＨＰＯ　・１２Ｈ　Ｏ、ＮａＨ：ＰＯ　・２Ｈ　０、咪唑、　ＰＥＧ４０００购自上海生工；羊抗鼠ＩｇＧ—ＨＲＰ二抗购自北京中杉金桥生物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完　全佐剂、ＨＡＴ培养基（５Ｏ×）、ＨＴ培养基（５Ｏ×）购自美国Ｓｉｇｍａ公司．　１．２　ＶＥＧＦ蛋白的诱导表达及纯化　将ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＶＥＧＦ表达质粒转化至大肠杆菌，挑取单菌落，接种至Ｉ　Ｂ培养基中，３７℃，　１００　ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜．第２天，接种新的ＬＢ培养基，２００　ｒ／ｍｉｎ扩大培养４　ｈ后，加入ＩＰＴＧ（终浓度　１　ｍｍｏｌ／Ｌ），３７℃，２００　ｒ／ｍｉｎ诱导表达４　ｈ，离心收集菌体并进行超声破碎，８　ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解沉淀，４℃　过夜，离心，弃沉淀留上清．将含有目的蛋白的上清液上镍柱，分别用浓度为２０，４０，１００，２００，５００　ｍｍｏｌ／Ｉ　的咪唑（用８　ｍｏｌ／Ｉ　尿素溶液配制，ｐＨ＝７．４）洗脱，收集各个浓度的洗脱液，电泳分析，选出条带比较单　［收稿日期］　２ｏ１３一Ｏ３—２２　［基金项目］长春市科技发展计划项目（长科技合２０１００５８号）；国家自然科学基金资助项目（８１０２８０１０）．　［作者简介］徐多多（１９８８一），女，硕士研究生；通讯作者：王丽（１９５７一），女，博士，教授，博士研究生导师，主要从事肿瘤分子生物　学研究．　第３期　徐多多，等：重组人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）单克隆抗体的制备　１２７　一的样品收集并纯化．　１．３免疫动物　小鼠免疫按常规方法进行，初次免疫用３０　ｇ的ＶＥＧＦ蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化后　免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠．以后每隔２周，采用ＶＥＧＦ蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行免疫，共免　疫３次．　１．４杂交瘤细胞融合　提前两周复苏ＳＰ２／０骨髓瘤细胞，融合前一天取ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞制备饲养细胞．加强　免疫３　ｄ后进行细胞融合，将ＳＰ２／０细胞与脾细胞按１：１０的比例（体积比）于５ｏ　ｍＬ离心管中混合，　１　ｒａｉｎ内缓慢滴入１　ｍＩ　预热的５０　９／６　ＰＥＧ４０００，３７℃水浴中静置５　ｒａｉｎ，用无血清ＲＰＭＩ一１６４０培养基终　止作用，离心收集细胞．首先将细胞悬于含ＨＡＴ的选择培养基中，接种于９６孔细胞培养板中，每孔加　１～２滴细胞悬液使得接种细胞密度为１～２个／孔，培养１０　ｄ后更换ＨＴ培养基，两周后，改用一般培　养基．　１．５杂交瘤细胞筛选及克隆化　待杂交瘤细胞生长至孔底面积１／１０以上时，用ＶＥＧＦ（０．５　ｆｆｇ／ｍＬ）包被ＥＬＩＳＡ板，用ＥＬＩＳＡ方　法筛选阳性克隆孔．同时设ＳＰ２／０骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照．Ｄ（４５０）值大于或等于阴性孔的２．１　倍即为阳性孔．选取Ｄ（４５０）值相对较高的培养孔进行克隆，采用有限稀释法进行４次亚克隆，获得能够　稳定分泌ＶＥＧＦ单克隆抗体的杂交瘤细胞株．　１．６腹水的制备、纯化、效价测定及特异性验证　１．６．１　腹水制备　按常规方法将０．５　ｍＬ无菌液体石蜡注射到小鼠腹腔，一周后，再将０．５　ｍＬ杂交瘤细胞（（２～５）×　ｌ０　个／ｍＬ）悬液注射到小鼠腹腔．同时用ＳＰ２／０细胞制备阴性腹水．１０～２０　ｄ后，当观察到小鼠腹部明　显膨隆、波动感明显且小鼠状态较差时，收集腹水．　１．６．２腹水纯化　采用Ｇ蛋白（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ）亲和层析法对腹水抗体进行纯化．将磷酸钠盐结合缓冲液装入５　ｍＬ注射　器中，用１０　ｍＬ结合缓冲液洗柱，流速为１　ｍＬ／ｍｉｎ；将腹水与结合缓冲液按照１：２（体积比）稀释，上　样，流速１　ｍＩ　／ｍｉｎ，然后用１０　ｍＬ结合缓冲液洗柱；用Ｂｒａｄｆｏｒｄ试剂检测，直到流出液中没有蛋白为　止．用洗脱缓冲液洗柱，收集样品，一４０￣Ｃ保存．　１．６．３　效价测定　采用间接ＥＬＩＳＡ方法测定纯化的ＶＥＧＦ单克隆抗体效价．用制备的ＶＥＧＦ蛋白包被ＥＬＩＳＡ板，　浓度为０．５　ｆｆｇ／ｍＩ　，每孔１００　ｆｆＬ，４￣Ｃ过夜；３７￣Ｃ封闭１　ｈ，拍干后加入倍比稀释的抗体１００　ｆｆＬ，另用骨髓　瘤细胞制备的腹水作为阴性对照，用抗体稀释液作为空白对照，３７￣Ｃ孵育１　ｈ；洗涤后加入羊抗鼠　ＩｇＧ—ＨＲＰ，３７℃反应４５　ｍｉｎ，加底物显色，最后用２　ｍｏｌ／Ｉ　的硫酸终止反应．用酶标仪测定波长４５０　ｎｍ　处样品（Ｐ）、阴性对照孔（Ｎ）及空白对照（Ｂ）的Ｄ（４５０）值，计算Ｐ／Ｎ比值，并选定Ｐ／Ｎ≥２．１为阳性，　其中Ｐ／Ｎ≥２．１时阳性血清的最大稀释倍数即为抗体效价．　１．６．４单克隆抗体特异性验证　用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法对ＶＥＧＦ单克隆抗体的特异性进行鉴定．首先将ＶＥＧＦ蛋白进行　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，然后将其电转至ＰＶＤＦ膜上，用封闭液进行封闭，洗涤后将纯化的单克隆抗体作为一抗，羊　抗鼠ＩｇＧ—ＨＲＰ作为二抗，最后用ＡＥＣ底物显色．　２　结果　２．１　ＶＥＧＦ蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析　目的蛋白经过ＮＴＡ—Ｎｉ　亲和层析及咪唑梯度洗脱后，在相对分子质量２０　０００～３１　０００之间出现　了一条单一的目的带（见图１），纯度达到９Ｏ　以上，满足实验要求．纯化后的ＶＥＧＦ蛋白再经过　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ进行分离，将凝胶上的纯化蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上，利用商品化ＶＥＧＦ单克隆抗体进行特　异性分析，结果表明，纯化后的ＶＥＧＦ蛋白在对应位置出现了明显的单一杂交条带（见图１），证实制备　第３期　徐多多，等：重组人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）单克隆抗体的制备　１２９　细胞融合后，首先使用ＨＡＴ培养基进行筛选，杂交瘤细胞生长的同时阻断其他融合细胞或未融合　细胞的生长与繁殖．本实验主要采用间接ＥＩ　ＩＳＡ的方法进行筛选，并获得了特异性及灵敏性较高的细　胞株．细胞融合后选择适合的检测时间也是很重要的，过早会因阳性细胞少而出现假阳性，过晚可能会　使检测细胞株中混有不分泌抗体的阴性克隆细胞，而这些细胞具有代谢上的优势，它会与阳性细胞竞争　营养成分，进而导致阳性细胞死亡．本研究是在融合后的第１０天，观察到部分杂交瘤细胞生长至孑Ｌ底面　积的１／１０时，开始对其进行检测．为避免阳性细胞株转变成阴性，应该在筛选出阳性孔后尽快进行亚克　隆．另外，由于初次筛选出的杂交瘤细胞中的染色体极不稳定，易丢失，从而丧失分泌抗体的能力，所以，　一般要经过３～４次的克隆、亚克隆才能筛选出能够稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞．　本研究以高纯度的ＶＥＧＦ作为抗原反复免疫小鼠，按常规单克隆抗体制备技术筛选出１株可分泌　ＶＥＧＦ抗体的杂交瘤细胞，并通过制备腹水的方法成功获得了高纯度的ＶＥＧＦ单克隆抗体．经ＥＬＩＳＡ　和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测，抗体具有高特异性，效价达到１：１　０２４，为下一步开发基于血清ＶＥＧＦ蛋白的检　测试剂奠定了基础．　［参　考　文　献］　［１］　ＬＥＰＥＩ　Ｉ　ＥＴＩＥＲ　Ｙ，ＣＡＭＡＲＡ—ＣＩ　ＡＹＥＴＴＥ　Ｖ，ＪＩＮ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｎｔｌｅ　ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｔｕｍｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｂｙ　ｒｏｕｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｏｗａｒｄ　ｌｙｓｏｓｏｍａｌ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００７，６７（３）：１１４５一ｌ１５４．　　Ｗ．Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｃｒｅｔ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｈｅｐｒｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　１－２３　ＦＥＲＲＡＲＡ　Ｎ，ＨＥＮＺＥＩｃｅｌｌｓ　ＥＪ］．Ｂｉｏｅｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　ＣＯＭＭＵＮ，１９８９，１６１：８５１　８５８．　　Ｍ，ＫＯＮＤ（）Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒａ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　［－３３　ＹＡＭＡＭ（）Ｔ（）Ｙ，ＴＯＩａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｌ－Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９６，２（５）：８２１—８２６．　　Ｓ，ＯＫＵＤＥＲＡ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｌｅｖｅｌ　ａｓ　ｆｌ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｏｆ　－１４］　ＨＡＳＥＧＡＷＡ　Ｙ，ＴＡＫＡＮＡＳＨＩｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｎ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　１－Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ，２００５，４４（１）：２６　３４．　　ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｅｓｏｐｈａｇｃａｌ　Ｅｓ］　ＳＨＩＭＡＤＡ　Ｈ，ＴＡＫＥＤＡ　Ａ，ＮＡＢＥＹＡ　Ｙ，ｅｔｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＥＪ］．Ｃａｎｃｅｒ，２００１，９２（３）：６６３—６８９．　－１６］　ＰＡＵＩ　ＯＶＩＣＨ　Ａ　Ｇ，ＨＡＲＴＷＥＩ　Ｉ　Ｉ　Ｈ．Ａ　ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｉｎ　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９５，８２（５）：８４ｌ一８４７．　－１７］　ＫＯＨＩ　ＥＲ　Ｇ，ＭＩＩ　ＳＴＥＩＮ　Ｃ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｆｕｓｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７５　（２５６）：４９５—４９７．　－１８］王彦敏．血管生因子ＶＥＧＦ研究进展＿Ｊ］．河北医药，２０１０，３２：１４５６—１４５８．　［９］石琦，单冰，高晨，等．血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）单克隆抗的制备及鉴定［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００８，２４（２）：１４２—１４６　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｘｕ　Ｄｕｏ—ｄｕｏ，Ｉ．Ｉ　Ｓｉ—ｊｉｎｇ，ＬＩ　Ｆａｎｇ—ｑｉａｎ，ＰＡＮ　Ｐｅｎｇ—ｔａｏ，ＷＵ　Ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｌｉ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１　３００２４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ＶＥＧＦ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌ１　ｌｉｎｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＶＥＧＦ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａＩ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＶＥＧＦ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｗａｓ　ｌ：１　０２４．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＶＥＧＦ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ　ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＬＩＳＡ　（责任编辑：方林）