水的大肠菌群检测方法
Hessen was revised in January 2021
4．1 在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL。 4．2 在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。 4．3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。
4．4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。 5 证实试验 5．1 平板分离
自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5．2 复发酵试验
挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。
5．3 凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的阳性管数，查最大可能数（MPN）检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。 总大肠菌群（MPN）检索表
二、大肠菌群膜法测定 1 定义
大肠菌群（coliform bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。 2 仪器 2．1 滤器
2．2 滤膜，孔径0．45μm。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。 2．3 抽滤设备 2．4 无齿镊子
2．5 其它仪器见《GB/T ××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第3章。 3 培养基
3．1 品红亚硫酸钠培养基 3．1．1 成分：蛋白胨 10g 酵母浸膏 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 琼脂 10～20g
磷酸氢二钾 3．5g 无水亚硫酸钠 5g
5％碱性品红乙醇溶液 20mL 蒸馏水 1000mL
3．1．2 储备培养基的制备
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900mL蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值到7．2～7．4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000mL，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。 3．1．3 平皿培养基的制备
将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基按1∶50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按1∶200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 3．2 乳糖蛋白胨培养液
见《游泳池中大肠菌群多管发酵测定法》 4 操作步骤
4．1 滤膜灭菌：将滤膜放入含蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。
4．2 滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
4．3 水样过滤：用无菌镊子夹灭菌滤膜边缘部分，将滤膜粗糙面向上，贴放在滤床上。固定好滤器，打开滤器阀门，在－0．5大气压下抽滤。
4．4 培养：水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。用灭菌镊子夹滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后将平皿倒置，放入36±1℃恒温箱内培养18～24h。
4．5 挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。 紫红色，具有金属光泽的菌落； 深红色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡红色，中心色较深的菌落。
4．6 将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中，于36±1℃培养48h。产酸产气者证实为大肠菌群阳性。 5 检验结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以10即为每1000mL水样中的大肠菌群数。
