维普资讯 http://www.cqvip.com ※基础研究 食品蕾斗学 ２００２．Ｖｌ０』．２３．Ｎｏ．１１ ２９ 多酶协同作用生产大豆多肽的研究 刘通讯摘朱小乔杨晓泉华南理工大学食品与生物工程学院广州 ５１０６４１ 要 以大豆多肽饮料的研制为着眼点，根据单酶水解大豆分离蛋白的研究，从中选择合适的酶复配组合成多酶， 然后在多酶水解的基础上，分别采取分步加酶和同时加酶方式，对比Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ和Ｋｏｊｉｚｙｍｅ这两种复合蛋白酶水解大 豆分离蛋白的特点，最终确定了大豆分离蛋白用于多肽生产时的酶解工艺条件。 关键词大豆分离蛋白（ＳＰＩ） 有限酶解多肽 ／ｋｌ￣ｔｒａｅｔ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｏｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｉｎｋ ｍａｄｅ ｂｙ ＳＰＩ ａｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅ ｔｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ＳＰＩ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ｍｕｌｔｉ——ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆｍｕｌｔｉ—ｅｎｚｙｍｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．，ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＳＰＩ ｂｙ Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ Ｋｏｊｉｚｙｍｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍａｎｎｅｒｓ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｉｎ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｒ ｉｎ ｕｎｉｓｏｎ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉ－ ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＰ１ ｗｅｒｅ ｄｅｃｉｄｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｏｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｅ（ＳＰＩ）Ｌｉｍｉｔｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ｓｏｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ 大豆多肽是由大豆蛋白经蛋白酶解作用后，再经 酶（德国Ｆｅｒｋ．ｃｏｒｎ提供）。 特殊处理而得到的蛋白质水解产物。它由许多种链长 １．２ 主要仪器与设备 不等的低分子肽组成，此外还含有少量游离氨基酸等成 ８００型离心机；ＪＢ一３型定时恒温磁力搅拌器； 分。随着对大豆蛋白酶解研究的不断深入，研究者们通 ＰＨＳ一３Ｃ型精密ｐＨ计；ＪＪ２００电子天平；７２１Ｂ型分光 过选用不同的蛋白酶系或采用不同的分离方法，获得了 光度计；ＫＷＳ数显温度调节仪。 加工性能和营养性能更为广泛和优越的大豆多肽，这使 １．３ 分析方法 得大豆多肽在食品工业中尤其在速溶饮品或高蛋白食 １．３．１ 水解度（ＤｅｇｒｅｅｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ＤＨ）的测定—— 品的生产中具有十分广泛的用途和开发前景。 ｐＨ—Ｓｔａｔ法… 用大豆分离蛋白制备大豆多肽时，有两点需要注 １．３．２ 蛋白质浓度的测定——双缩脲法 意：一是正确选择蛋白酶，确定适宜的酶解条件，以提 １．３．３ 多肽的测定 取水解液ｌＯｍｌ，加入１０％的三氯乙酸溶液ｌＯｍｌ 高多肽浓度，降低氨基酸浓度为目的；二是要减少苦味 肽的形成。 与之混合反应，放置３０ｍｉｎ后，在４０００ｒ／ｍｉｎ下离心 ｎ。用双缩脲法测定上清液中可溶性蛋白质浓度， 由于酶对底物具有一定的特异性作用，因而采用 １５ｍｉ 混合酶法对大豆分离蛋白进行改性以得到大豆多肽是 即可计算出多肽浓度。１．３．４ 游离氨基酸的测定——甲醛滴定法［３１（单指 今后的发展方向之一。 １ 材料与方法 １．１ 实验材料 示剂） １．３．５ 平均肽键长度（ＡＰＬＬ）的测定：ＡＰＬＬ＝１／ ＤＨ×可溶性蛋白质百分比 大豆分离蛋白：哈尔滨高科大豆食品公司；甲醛： １．３．６ 粗蛋白质含量的测定——凯氏定氮法Ｈ 汕头市光华化学厂；酒石酸钾钠：广州市东红化工厂； １．３．７ 蛋白酶活力的测定——紫外分光光度法 ＣｕＳＯ，．・５Ｈ Ｏ：汕头市光华化学厂；三氯乙酸：汕头市 光华化学厂；Ｎａ ：ＳＯ，：汕头市光华化学厂（以上均为分 析纯） ２ 结果与讨论 ２．１ 大豆分离蛋白的预处理 实验表明，浓度５％～８％的大豆分离蛋白在８５～ 实验所用的蛋白酶：Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ，Ｋｏｊｉｚｙｍｅ，Ｐｒｏ－ ｎ，可使大豆蛋白致密的立体结 ｔａｍｅｘ，Ｎｅｕｔｔｒａｓｅ，Ａｌｃａｌａｓｅ，（均为ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ提供）；胰 ９０％的温度下水浴ｌＯｍｉ广东省攻关项目资助（编号Ａ２０３０１） 维普资讯 http://www.cqvip.com ３０ ２００２，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．¨ 食品蘑斗学 ※基础研究 构变得松散易于与蛋白酶结合，但加热的时间过长或 度则较相近。由于Ａｌｃａｌａｓｅ和Ｎｅｕｔｒａｓｅ有利于多肽的 温度过高时，蛋白质分子会通过疏水作用和二硫键作 生成，而游离氨基酸浓度又较低，因此选择它们作为多 用形成网状聚合物，反而会降低蛋白酶的酶解作用。 这些共价键将对促进酶解速率、提高水解度有一定帮 酶水解研究的组分。 另外大豆蛋白中含有较多的二硫键，若预先破坏 ２．２．２ 多酶水解大豆分离蛋白的研究 由于不同的酶在底物上的作用位点不同，因而多 助。在预备实验中研究了Ｂ一巯基乙醇、亚硫酸钠、半 种酶水解时往往产生“协同增效”作用。在酶总量（均 胱氨酸等对水解度的影响，确定亚硫酸钠为还原剂，对 为６０００Ｕ）不变的前提下，分别按照Ａｌｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕｔｒａｓｅ 大豆分离蛋白酶解前均先经过１００×１０～Ｎａ：ＳＯ，、９０￣Ｃ 水浴ｌＯｍｉｎ的预处理。 ２．２ 内肽酶水解大豆分离蛋白的研究 ２．２．１ 单酶的选择 Ｐｒｏｔａｍｅｘ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ和胰酶均是内切蛋白 ＝１：１、Ａｌｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝２：１和Ａｌｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕ． ｔｒａｓｅＡ：Ｎ＝１：２的比例混合成多酶，对大豆分离蛋白 进行水解，期望进一步提高产物中多肽的浓度，实验 结果如表２。 由表２可见，水解能力由强到弱的搭配依次为 酶，实验测得这四种酶在４０００Ｕ、６０００Ｕ、８０００Ｕ水平下 Ａｌｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝１：２、Ａｌｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝２：１和 ｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝１：１。Ａｌｃａｌａｓｅ和Ｎｅｕｔｒａｓｅ按照１： 对大豆分离蛋白水解８ｈ后，产物中多肽浓度和氨基酸 Ａｌ浓度，如表１。 表１ 酶解ＳＰＩ８ｈ后所得的氨基酸和多肽浓度 ２混合成的多酶在水解能力和多肽生成率上都高于其 他两种搭配，虽然游离氨基酸浓度略高出一些，但仍选 择这一比例进行下一步研究。 ２．２．３ 复合酶与多酶共同水解大豆分离蛋白的研究 Ｋｏｊｉｚｙｍｅ酶和Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶是含有内肽酶和端 解酶的两种复合酶。内肽酶从蛋白质分子内部切断肽 键，生成分子量较小的月示、胨和多肽等中间产物；端解 酶则从游离的羧基末端和氨基末端逐一切断肽键，水 解成氨基酸。由于端解酶能够不同程度地脱除低水解 度产物——苦味蛋白水解液的苦味，增进和改善水解 液的风味。因此在多酶水解的基础上加入复合酶不仅 能发挥其中内肽酶的作用，还能利用端解酶来改善水 解液的苦味。 ２．２．３．１ 酶解方式对大豆多肽浓度的影响 为了对照分步加酶和同时加酶这两种加酶方式对 大豆分离蛋白水解效果的影响，在实验中样品１采用 分布加酶方式，即：先用６０００Ｕ多酶水解（Ａｌｃａｌａｓｅ： Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝１：２）２ｈ后，再加入３６ＬＡＰＵ的复合酶继续水 解；样品２则是同时加酶：把多酶与３６ＬＡＰＵ的复合酶 由表１可见，相同酶量下，按所得多肽浓度由高到 同时加入大豆分离蛋白溶液中进行水解；样品３仅用 ｃａｌａｓｅ：Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝１：２）水解，为对照组。实验结 低依次为：Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、Ｐｒｏｔａｍｅｘ、胰酶；胰酶水 多酶（Ａｌ表４。 解产物中氨基酸浓度最高而其他酶解产物中氨基酸浓 果如表３、表２ 多酶水解对ＳＰＩ水解度和产物浓度的影晌 维普资讯 http://www.cqvip.com ※基础研究 恿品蔫斗学 ２００２，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１１ ３１ ５ ５ ５ 表４ Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶的加入方式对水解度和多肽浓度的影响 ｌ ｌ ４ ／ ３ ／ ３ ／ ３ ５ ５ ６ Ｏ ９ Ｏ １２ Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ ３６ ６０ ０／０ ０／０ ０／０ ５．２／３６．７ ５ ７／３７．０ ５．８／３７．２ ５．７／３８．０ ６．３／３８．１ ７．２／３８．２ ５．９／３９．１ ７．２／３９．９ ８．０／３９．２ ７．６／５０．０ ｌ０．２／４９．８ ｌ２．３／５０．２ ９．２ ｌ１．１ ｌ２．６ ｌ２ ０／０ ０／０ ０／０ ５．１／３３．９ ５．９／３３．７ ６．２／３３．６ ５．８／３４．０ ６．８／３３．９ ７．６／３２．８ ６．１／３３．６ ８．１／３２．７ ９．７／３４．１ ６．３／３３．２ ９．７／３４．０ ｌ３．５／３４．０ ｌ１．４／３５．１ ２３．３／４０．２ ３０．０／４５．９ ｌ２．０ ２０．６ ２５．５ Ｋｏｊｉｚｙｍｅ ３６ ６０ 由表３可知，加入Ｋｏｊｉｚｙｍｅ酶，最终产物中多肽的 方式进行实验，结果如表５。由表５可知，相同酶量下，虽然Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶 浓度都比对照有不同程度的提高。分步加入Ｋｏｊｉｚｙｍｅ ｚｙｍｅ酶，但多肽浓度 酶后，多肽的浓度开始逐渐下降，到６ｈ为最低，以后又 解产物的水解度明显低于Ｋｏｊｉａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶解大豆分离蛋 逐渐上升，水解２４ｈ后多肽浓度为三者中最高。同时加 却高出许多。分步加入Ｆｌ酶过程中，多肽的浓度没有明显的波动而处于一种动 白２４ｈ后，产物中多肽浓度均达到５０％左右，比同 ｉｚｙｍｅ酶至少要高出近５％，并且游离氨 态平衡。由于分步加酶能更有效地发挥Ｋｏｊｉｚｙｍｅ酶的 条件下的Ｋｏｊｉｚｙｍｅ酶。酶量的增加对提高 酶解能力，有利于多肽的生成，因此选择此方式进行该 基酸浓度又远低于Ｋｏｊ酶的下一步实验。 Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶解产物中多肽浓度没有促进作用，这 一由表４可知，不论以何种方式加入Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶 点与Ｋｏｊｉｚｙｍｅ酶相反。因此最终选择多酶与 ａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶采用分步加酶方式作为研制大豆多肽 都能提高大豆多肽的浓度，但分步加入方式所得的多 Ｆｌ 肽浓度上升更快，远远高出同时加入方式，也超出分步 饮料的酶解条件。加入Ｋｏｊｉｚｙｍｅ酶方式９％以上。Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶的加入 对提高产物的水解度和游离氨基酸含量远不如Ｋｏ— ３ 结论 对大豆分离蛋白进行性分步酶解的步骤为： ｉｉｚｙｍｅ显著。分步加入Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶使产物在低的水 ３．１ｃａｌａｓｅ： 解度下有最高的多肽浓度，因此也选择此方式进行该 ６％的大豆分离蛋白溶液用６０００Ｕ的多酶（Ａｌ酶的下一步实验。 Ｎｅｕｔｒａｓｅ＝１：２）水解２ｈ后，再加入１２ＬＡＰＵ的 ２．２．３．２ 复合酶种类和浓度的确定 Ｆｌａｖｏｕｒｚｙ１ＴＩｅ继续水解，总计水解时问为２４ｈ。最终产物 这 酶浓度的提高能加快酶促反应的速度，为了进一 中多肽浓度可达５０％左右，游离氨基酸浓度为９．２％， 步提高多肽的浓度，分别取１２Ｌ ＡＰＵ、３６Ｌ ＡＰＵ、６０Ｌ 比同时加酶方式所得多肽浓度要高出约１２％。ａｖｏｕｒｚｙｍｅ复合酶可以脱除低水解度产物的苦 ＡＰＵ的Ｋｏｊｉｚ￣ｒｍｅ酶和Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ酶按照分步加酶的 ３．２ Ｆｌ维普资讯 http://www.cqvip.com ３２ ２００２，ｖｏ１．２３．Ｎｏ．１ｌ 食品科学 ．※基础研究 味，增进和改善水解液的风味Ｉ １。经品尝对比，由上法得 到的水解液其苦味仅比多酶水解的产物明显减轻。 参考文献 １ Ｎ０Ｖ０ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｂｏｄ Ｇｒａｄｅ Ａｌｃａｌａｓｅ ｏｒ Ｎｅｕｔｒａｓｅ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｅｃｈ— ｎｉｃａ，ＮＯＶＯ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，１ ９８９． ２ 张树政编著．酶制剂工业．北京：科学出版社，１９８４． ３ 六校合编．食品分析．北京：中国轻工业出版社，１９９５． ４食品分析组编著．食品分析试验．广州：华南理工大学，２０００． ５ 资料来源于丹麦诺和诺德酶制剂部． 曾新安摘要李国基 于淑娟 华南理工大学食品与生物工程学院广州 ５１０６４０ 本文研究了国产酱油原沉淀、一次沉淀及二次沉淀的成分组成和氨基酸组成情况，提出高蛋白质和多糖是造 酱油沉淀二次沉淀 成酱油沉淀的主要原因，高盐份不会促进沉淀产生。文章中对糖类和蛋白质的来源作出了分析。 关键词Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ３ ｋｉｎｄｓ ｏｆｓｏｙ ｓａｕｃｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ：ｒａｗ ｓｏｙ ｓａｕｃｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔ ，ｉｒｓｔｆ ｓｅｄｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａ ｄｅ ｉｎ ａｌｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｑｕｉｔｅ ｈｉｇｈ，ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｍａｄｅ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｌｖｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｓｏｙ ｓａｕｃｅ Ｓｅｄｉｍｅｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔ 酱油在生产和储存的各个阶段都可能产生沉淀， 混浊物，经２６００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ后得到，然后将沉淀 从酿造塔中放出来未经灭菌的酱油叫做原酱油，这种 物装入透析袋，流动水透析２４ｈ后，用聚乙二醇（分子 酱油产生的沉淀称为原酱油沉淀，经加热处理自然存 量２００００）浓缩，反复透袭和浓缩，直到基本没有色素 放一段时间后生成酱油沉淀称为一次沉淀；成品酱油 再透出为止，透析后的样品冷冻干燥器中保存。 在储藏或货架销售过程中产生的酱油沉淀为二次沉 １．２．２ 一次沉淀的收集 淀。二次沉淀的产生是当今我国酱油行业普遍存在的 收集生产中经过杀菌后慢慢沉积在贮罐底部的沉 尚未解决的一大难题，二次沉淀的存在虽然对消费者 淀物，然后按上述方法离心、透析、干燥得一次沉淀。的口感影响不大，但它严重影响了产品的外观，从而影 １．２．３ 二次沉淀的收集 响酱油的销售和出口。１３本在２０世纪中后期，特别是 加热杀菌后的酱油自然曾放１０ｄ，取上清夜再静 ６０—７０年代对酱油的沉淀问题研究较多，并且已较成 置７ｄ以上，小心顷出，并且滤纸过滤，刮取滤纸上的沉 功地解决了这一问题。目前，市场上的日本酱油澄清、 淀，合并瓶底沉淀，按上述方法离心、透析和干燥的二 透明，外观上明显优于我国产品，但其价格昂贵，是我 次沉淀。国酱油的８～ｌ０倍，已基本垄断了欧美市场。由此看 １．３ 检测方法 来，解决我国酱油久放沉淀的难题，具有重要的经济价 １．３．１ 总氮值Ｉ ３１。 凯氏定氮法 索氏提取法 １．３．２ 脂肪１ 材料与方法 １．３．３ 盐分度折光仪测定 将酱油样品精确稀释２～５倍后用盐 马福炉烧恒重法 烘箱１０５￣Ｃ干燥恒重法 先用盐酸水解，然后用兰一埃农法测定 １．１ 酱油从广州某酱油厂取样。 １．３．４ 灰分１．３．５ 水分１．３．６ 总糖１．２沉淀取样方法 １．２．１ 原沉淀的收集 ｅｒｓ高效液相色谱ＰＩ— 在生产现场收集到的未经灭菌的原酱油容器底部 １．３．７ 氨基酸 用美国Ｗａｔ广Ｉ州市重大科技攻关资助项目（２ｏ０ｌ—ｚ—ｌ０８—０１）
