维普资讯 http://www.cqvip.com 动物医学进展。２００７，２８（９）：１１－１４ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 狂犬病病毒ＣＶＳ株Ｇ基因和ＩＦＮ一 基因的克隆及双基因真核表达载体的构建 李江涛 ，殷相平 ，柳纪省 ，李宝玉 ，李学瑞 ，杨 彬 ，兰 喜 ，胡永浩。 （１．中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室， 甘肃兰州７３００４６；２．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州７３００７０） 摘 要：从狂犬病病毒ＣＶＳ毒株致死的小鼠脑组织中提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ—ＰＣＲ获得Ｇ基因；以 ｐＭＤ１８一Ｔ—ｄ质粒为模板，ＰＣＲ扩增得到ＩＦＮ—ａ基因。两个基因和ｐＩＲＥＳ真核表达载体分别双酶切，连接构 建Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ，经ＰＣＲ、双酶切鉴定和测序证明载体构建成功。测得的Ｇ基因序列长１ ５７５ ｂｐ，与 ＣＶＳ株Ｇ基因氨基酸同源性为９８．５％；ＩＦＮ—ａ序列长为５７０ ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ中登录号为ＮＭ ００１０１７４１１的 ＩＦＮ—ａ基因氨基酸同源性为９１．６ 。 关键词：狂犬病病毒ＣＶＳ毒株；Ｇ基因；ａ干扰素；ｐＩＲＥＳ载体 中图分类号：Ｑ７８６；￥８５２．６５９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２００７）０９—００１１－０４ 狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）是由狂犬病病毒（Ｒａｂｉｅｓ 广泛分布于亚、非、欧、美等各大洲，严重威胁人畜的 ＶｌＹ￣Ｓ，ＲＶ）感染引起的高致死性人兽共患传染病， 健康Ⅲ。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒 收稿日期：２００７—０６－０４ 基金项目：国家高技术研究发展计划８６３项目（２００６ＡＡ１０Ａ２０４）；甘肃省科技攻关项目（２ＧＳＯＳ２一Ａ４１—００６—０２） 作者简介：李江涛（１９８１一）．男．甘肃岷县人，硕士研究生。主要从事动物传染病学与分子免疫学研究。＊通讯作者 ［９］ Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ Ａ Ｗ，Ｂａｕｍｌｅｒ Ａ Ｊ，Ｔｓｏｉｌｓ Ｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ，Ｍｕｌｔｉ－ ｈｏｓｔ—ｒａｎｇｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＲＫ２［Ｊ］．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９６，１７８（７）ｌ ２０８６— ｐｉｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏ－ ２０９３． ｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ！ｕｍ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，１９９８，６６（６）： ［１１］ Ｇｕｏ Ａ，Ｌａｓａｒｏ Ｍ Ａ，Ｓｉｒａｒｄ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｄｈｅｓｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２８０３—２８０８． ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ— ［１０］ Ｓｏｂｅｃｋｙ Ｐ Ａ，Ｅａｓｔｅｒ Ｃ Ｉ ，Ｂｅａｒ Ｐ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｍ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００７，１５３（４）：１０５９— ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏａｄ— １０６９． Ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｋ／ｓｏｋ—ｐａｒＤＥ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｆｉｍｂｒｉａｌ Ｇｅｎｅ ＹＡＮＧ Ｗｅｉ—ｈｏｎｇ ～，ＣＨＥＮ Ｙａｎｇ ～，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ—ｄｏｎｇ ～，ＳＵＮ Ｇｏｕ—ｚｈｏｎｇ 一， ＬＩＮＧ Ｊｉｅ—ｙｕ ～，ＴＵ Ｌｉｎｇ－ｌｉｎｇ 一，ＣＨＥＮ Ｈｕａｎ－ｃｈｕｎ ’ ，ＧＵＯ Ａｉ—ｚｈｅｎ ’ ’。 （１．ＴｈｅＳｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏＪ Ａｇｒｉｔ。ｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｔｕｒｅ ｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ，４３００７０，Ｃｈｉｎａ； ２．ＴｈｅＨｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏＪ。Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅｔＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ，４３００７０，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏＪ’ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉｔ４３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｋ／ｓｏｋ ａｎｄ ｐａｒＤＥ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ａｐｈＡ—ｈｏｋ— ｐａｒＤＥ）ｏｆ Ｒ１ ａｎｄ ＲＫ２ ｗａｓ ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＡＺ４４ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｐＡＺ４４一ｈ．Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｐＡＺ４４ ａｎｄ ｐＡＺ４４一ｈ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｐｉｃｋｅｄ ｕｐ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＬＢ ｂｒｏｔｈ．Ｆｏｒ ｅｖｅｒｙ １２ ｈ，１０ ｍｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａ ｎｅｗ ｆｌａｓｋ ｕｎｔｉｌ １ ４４ ｈ．Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ＬＢ ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ． Ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ，ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＡＺ４４ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｂｅｇａｎ ｔｏ ｌｏｓｓ ｐｌａｓｍｉｄ ａｔ ｔｈｅ １ ２ ｈ一２４ ｈ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｗｈｉｌｅ ｐＡＺ４４一ｈ ｄｉｄ ｎｏｔ ｌｏｓｅ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ １０ ｐａｓｓａｇｅｓ（ｏｒ １２０ｈ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ）．Ｉｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｐｈＡ—ｈｏｋ—ｐａｒＤＥ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｉｓ ｆｉｎｄｉｎｇ ｌａｉｄ ａ ｇｏｏｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｔｙｐｅ Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ｈｏｋ／ｓｏｋ；ｐａｒＤＥ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 维普资讯 http://www.cqvip.com １２ 动物医学进展２００７年第２８卷第９期（总第１６８期） 属，其基因组大小约为１２ ｋｂ，编码５种主要结构蛋 白，即核蛋白（ＮＰ）、衣壳基质蛋白（ＭＩＰ）、膜基质蛋 ＰＢＳ制成１：５的悬液，反复冻融。然后以 ７ ５００ ｒ／ｍｉｎ于４℃离心１０ ｍｉｎ，取上清液用于提取 ＲＮＡ。其他步骤按ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行。 获得的ＲＮＡ于一２Ｏ℃保存或直接用于反转录。 １．５ ＲＴ—ＰＣＲ扩增Ｇ基因 白（Ｍ２Ｐ）、糖蛋白（ＧＰ）和转录酶大蛋白（ＬＰ）［２］。 糖蛋白被认为是惟一诱导中和抗体的蛋白，也 能刺激细胞免疫应答，可抵抗狂犬病病毒外周和脑 内途径的攻击 ］，且具有众多的保护性抗原位 点 ］，故近年来，在ＲＶ重组基因工程疫苗的研究中 在０。５ ｍＬ管中依次加人下列各液并充分混 匀：５×ＡＭＶ缓冲液５ Ｌ，ｄＮＴＰ（各２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ） ３ Ｌ，ＲＮａｓｉｎ １ Ｌ，Ｇ１弓ｌ物１ Ｌ，模板ＲＮＡ 大都以糖蛋白ｅＤＮＡ作为目的基因，这些重组疫苗 可产生一定水平保护力，但总体上诱导产生的抗体 水平不够高，可能与没有其他结构蛋白的参与，针 对ＲＶ的免疫应答不充分有关［６］。 干扰素一ａ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ａ，ＩＦＮ—ａ）是一种具有广 谱抗病毒、抗肿瘤、调节免疫和促进细胞凋亡等多种 生物学活性的细胞因子 ］。本试验的目的是构建能 够同时表达狂犬病病毒ＣＶＳ毒株Ｇ基因和ＩＦＮ—ａ 基因的双基因真核表达载体，为进一步研究狂犬病 基因工程疫苗奠定基础。 １材料与方法 １．１毒株、菌株及载体 ＲＶ ＣＶＳ毒株、ＪＭｌＯ９菌株、ｐＭＤ１８一Ｔ～ａ质粒 和Ｐ ＩＲＥＳ载体由本实验室保存。 １。２ 工具酶和主要试剂 性内切酶Ｘｈｏ Ｉ、ｉＶｇｕ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ标准、 一ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉ— ｇｅｓｔ、ＲＮＡ提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试 剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品。其他试 剂均为分析纯试剂。 １。３ 引物 根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的狂犬病病毒序列和 ＩＦＮ—ａ序列，分别设计了针对Ｇ和ＩＦＮ—ａ的引物， 并根据ｐｌＲＥＳ载体ＭＣＳＡ和ＭＣＳＢ的序列，在Ｇ１ Ｇ２、ＩＦＮ—ａ１、ＩＦＮ—ａ２中分别加人Ｘｈｏ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、 Ｓａｌ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ酶切位点（下划线部分），黑体部分为 Ｋｏｚａｋ保守序列。引物由宝生物工程（大连）有限公 司合成。两对引物的序列分别为： Ｇ１： ５ 一ＧＣＡ（ ｒＣＧＡＧＡＯＣ ｒＧＧ ℃ＡＧＧＴ一 ｖ１、一３ Ｇ２：５ 一（ Ａ（ ＡＣＧＣＧ１ Ｉ℃ＡＣＡＧｌ１ ＴＧＡ ＣＴＣ一３ Ｉ ａ１：５ 一ＧＡＣ Ｇ１℃ＧＡＣ ＡＣＣ盯（ ＡＧＣ— Ｉ、（ 一３ Ｉ ： ５ 一ＧＡＧ０ Ｘ Ｏ ℃ＡＧ Ｔ］［ｖＩ１（ ℃一 ＣＩ ＡＡＡＣＴＧ３ １．４狂犬病病毒ＲＮＡ的提取 取狂犬病病毒ＣＶＳ株致死的小鼠１只，无菌解 剖取脑组织少许，加适量含抗生素的溶液研磨，用 １４ Ｌ，ＡＭＶ １ Ｌ，４２℃孵育６０ ｒａｉｎ，９５℃５ ｍｉｎ。 ＰＣＲ扩增采用５Ｏ Ｌ反应体系，含有２ ＩｕＬ ｅＤＮＡ 模板，Ｇ１、Ｇ２引物各１ Ｌ和Ｔａｑ ＤＮＡ预混酶 ２５ Ｌ，加无菌去离子水至５Ｏ Ｌ。反应参数：９５℃ ５ ｍｉｎ；９４℃１ ｍｉｎ，５４℃１ ｍｉｎ，７２℃２ ｍｉｎ，共３Ｏ 个循环；最后７２℃１０ ｍｉｎ。 １．６ ＰＣＲ扩增ＩＦＮ—ａ基因 扩增采用５Ｏ Ｌ体系，含有ｐＭＤ１８一Ｔ—ａ质粒、 ＩＦＮ－￣Ｉ和ＩＦＮ—ａ２引物各１ Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ预混酶 ２５ Ｌ，加无菌去离子水至５Ｏ Ｌ。反应参数：９４℃ ５ ｍｉｎ；９４℃５０ Ｓ，５０℃５０ Ｓ，７２℃１ ｍｉｎ，共３Ｏ个 循环；最后７２℃１０ ｍｉｎ。 １．７ ｐｌＲＥＳ￣Ｇ真核表达载体的构建 将Ｇ基因ＰＣＲ产物和ｐｌＲＥＳ载体经Ｘｈｏ Ｉ和 乱Ｉ ３７℃双酶切５ ｈ，酶切产物电泳鉴定并胶回收 （按照宝生物公司胶回收试剂盒说明书进行）。 １。７．１ ｐ ＩＲＥＳ—Ｇ的连接 将胶回收的Ｇ基因产 物６ Ｌ、ｐｌＲＥＳ ２ Ｌ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ和Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ各１ Ｌ １６℃连接５ ｈ。 １．７．２ ｐｌＲＥＳ—Ｇ质粒的鉴定ｐｌＲＥＳ—Ｇ连接产物 转化ＪＭｌＯ９感受态细胞后，按照宝生物公司质粒提 取试剂盒说明书进行质粒提取。后经ＰＣＲ、双酶切 和测序鉴定。 １．８ ｐｌＲＥＳ—Ｇ／ＩＦＮ—ａ真核表达载体的构建及鉴定 将ｐｌＲＥＳ—Ｇ和ＩＦＮ—ａ ＰＣＲ产物经Ｓａｌ Ｉ和 Ｎｏｔ Ｉ ３７℃双酶切５ ｈ，酶切产物胶回收后用Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ连接（体系同１。７．１），转化ＪＭ１０９感受 态细胞后提取质粒，经ＰＣＲ、双酶切和测序鉴定。 １．９序列分析 利用ＤＮＡ Ｓｔａｒ软件对Ｇ基因和ＩＦＮ－ａ基因序 列进行分析，比较核苷酸和氨基酸序列的同源性。 ２ 结果 ２．１ ＰＣＲ扩增产物电泳结果 扩增的ＩＦＮ—ａ基因和狂犬病病毒ＣＶＳ株Ｇ基 因电泳结果表明，获得了与预期大小一致的约 ５７０ ｂｐ和１ ５７５ ｂｐ的特异性条带（图１）。 维普资讯 http://www.cqvip.com 李江涛等：狂犬病病毒ＣＶＳ株Ｇ基因和ＩＦＮ—ａ基因的克隆及双基因真核表达载体的构建 １３ ２．２ 重组质粒ｐｌＲＥＳ—Ｇ的ＰＣＲ和双酶切鉴定 得到约１ ５７５ ｂｐ的目的带（图２），并经测序鉴定正 重组质粒ｐｌＲＥＳ—Ｇ经ＰＣＲ扩增和双酶切，均 确。 ２ Ｍ ２ ０００ ｂｐ １ ８８２ ｂｐ １ ０００ ｂｐ ７５０ ｂｐ Ｉ ４８９ ｂｐ ５００ ｂｐ Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ ２ ０００；１～２．ＩＦＮ—ａ基因ＰＣＲ产物； Ｍ． —ＥｃｏＴ１４ ｌ标准；；１．Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ的Ｇ基凼ＰＣＲ严物｝ ３～４．Ｇ基因ＰＣＲ产物 ２．ＰＩＲＥＳ－Ｇ的双酶切 Ｍ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００；卜２．ＩＦＮ—ａ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ； Ｍ． —ＥｃｏＴ１４ Ｉ Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ￣ ３—４．Ｇ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ２．Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｘｈｏ Ｉ＋ＭＺｕ Ｉ 图１ ＩＦＮ—Ｃｔ基因和ＣＶＳ株Ｇ基因的ＰＣＲ扩增 图２重组质粒Ｇ基因ＰＣＲ和酶切结果 Ｆｉｇ．１ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ—ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｇ ｇｅｎｅ ｏｆ ＣＶＳ ｓｔｒａｉｎ Ｆｉｇ．２ Ｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｇ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ ２．３ 重组质粒ｐｌＲＥＳ—Ｇ／ＩＦＮ—ｏｃ的ＰＣＲ和双酶切 的ＣＶＳ株Ｇ基因序列进行比较 核苷酸同源性为 鉴定 ９９．２ ９／５，氨基酸同源性为９８．５ 。与ＧｅｎＢａｎｋ中的 重组质粒ｐｌＲＥＳ—Ｇ／ＩＦＮ—ｏｃ经ＰＣＲ扩增和双酶 ＣＶＳ株Ｇ基因氨基酸序列相比，所测基因在１０４Ｒ、 切，均得到约５７０ ｂｐ的ＩＦＮ—ｏｃ目的基因（图３），并经 １４８Ｋ、１６６Ｅ、２１９Ａ、２６２Ｍ、３８２Ｉ、５２２Ｉ共７处发生了 测序鉴定正确。 变异，但关键的ＧⅡ、ＧⅢ抗原结合位点及３３３位关 ＭＩ Ｉ ２ ３ Ｍ２ 键的毒力位点未发生变异。 ２．４．２ ＩＦＮ—ａ基因序列 测序结果表明，被测的 ＩＦＮ—ｏｃ基因长为５７０ ｂｐ，编码１９０个氨基酸，将所测 序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号为ＮＭ ００１０１７４１１的 ＩＦＮ—ａ基因序列进行比较，核苷酸同源性为９４．６ ９／５， ２ ０００ ｂｐ 氨基酸同源性为９１．６ 。 １ ０００ ｂｐ ３讨论 ７５Ｏ ｂｐ ５００ ｂｐ 用于狂犬病预防的疫苗主要有灭活疫苗和减毒 活疫苗两种，灭活苗成本高，减毒活疫苗具有返祖的 可能，因而研制不含完整病毒颗粒的ＤＮＡ疫苗对狂 Ｍ１．ＤＮＡ标准ＤＬ ２ ０００；Ｍ２．Ｘ－ＥｃｏＴ１４ Ｉ标准；１～２．ｐＩＲＥＳ－Ｇ／ 犬病的预防有重要意义。 ＩＦＮ—ａ双酶切；３．Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ的ＩＦＮ—ａ基因ＰＣＲ产物 近年来，各国学者对狂犬病基因工程疫苗的研 Ｍ１．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００；Ｍ２． —Ｆ￣＇ｏＴ１４ Ｉ Ｍａｒｋｅｒ￣ｌ＿２．Ｐ 究主要集中在对糖蛋白的研究，据报道，用克隆了狂 ＩＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｓａｌ Ｉ＋Ｎｏｔ Ｉ；３．ＩＦＮ—ａ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ 犬病毒糖蛋白基因的质粒肌肉内接种免疫小鼠，能 ｏｆ Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ 图３重组质粒Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ的ＰＣＲ和酶切结果 诱导高水平的体液免疫与细胞免疫，并能保护８Ｏ Ｆｉｇ．３‘ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＩＦＮ—ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ 以上小鼠抵抗狂犬病病毒颅内的攻击［８］。ＩＦＮ—ａ由 ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ 于可同时起到免疫增强和抗病毒效应，故在病毒病 ２．４ Ｇ基因和ＩＦＮ—ｏｃ基因的序列分析 的治疗和预防中具有重要的作用，但当干扰素与 ２．４．１ Ｇ基因的序列及同源性分析 测序结果表 ＤＮＡ疫苗混合后再给动物肌肉注射，可能由于干扰 明，所测Ｇ基因全长１ ５７５ ｂｐ，编码５２５个氨基酸， 素与基因疫苗表达产物的局部微环境有显著差异， 将所测序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号为ＡＪ ５０６９９７ 使得干扰素不能显著增强ＤＮＡ疫苗的免疫原性［ｇ］。 维普资讯 http://www.cqvip.com 动物医学进展２００７年第２８卷第９期（总第１６８期） 社，１９９７：７７７—９５５． 本试验选用狂犬病毒标准毒株ＣＶＳ毒株的Ｇ 基因和ＩＦＮ—Ｇｔ基因作为目的基因Ｌ１。。，分别克隆人 ｐＩＲＥＳ载体的ＭＣＳＡ、ＭＣＳＢ位点处，载体构建成功 ［３］ Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒ Ａ，Ｈｅｂｌｏｉｓ Ｈ，Ｃｏｕｌｏｎ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１，６５：４１９８—９２０３． ［４１ Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ Ｂ，Ｗａｎｇ Ｈ Ｈ，Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ Ｃ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｒａｂｉｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｂｉｅｓ 后Ｇ基因和ＩＦＮ—ａ基因位于同一个质粒上，使ＩＦＮ— ａ对ＤＮＡ疫苗的免疫调节作用出现在同一个微环 境中。在重组载体中，Ｇ基因和ＩＦＮ—Ｇｔ基因之间是 ｖｉｒｕｓ ｒ．ｂｏｎｕｃ１ｅｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８７，８４： ９１６５－９１６９． ＩＲＥＳ序列，ＩＲＥＳ序列是来源于小ＲＮＡ病毒科 ［５３ Ｂｏｕｒｈｙ Ｈ，Ｋｉｓｓｉ Ｂ。Ｔｏｒｄｏ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙ— ｓｓａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｕｓ￣Ｊ３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｉ９９３，Ｉ９４（５）：７０—８１． ［６］ Ｓｃｒｉｍｇｅｏｕｒ Ｅ Ｍ，Ｍｅｈｔａ Ｆ Ｒ．Ｒａｂｉｅｓ ｉｎ Ｏｍａｎ：ｆａｉｌｅｄ ｐｏｓｔ ｅｘ— ｐｏｓｕｒｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｌａｃｔａｔｉｎｇ ｗｏｍａｎ ｂｉｔｔｅｎ ｂｙ ａ ｆｏｘ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００１，５（３）：１６０—１６２． ｍＲＮＡ ５ 端的一段非翻译区，具有内部核糖体进入 位点的功能。转录时，在上游启动子控制下，两个基 因及ＩＲＥＳ序列同时转录成一条单链ｍＲＮＡ，在翻 译时核糖体能同时进入并翻译ＩＲＥＳ的上游和下游 的两个转录子，上游ｍＲＮＡ的翻译起始遵循一般的 ［７］Ｄｅｃｋｅｒ Ｔ Ｍ，Ｌｌｅｒ Ｍ，Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ Ｓ．Ｔｈｅ Ｙｉｎ ａｎｄ Ｙａｎｇ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕ— ｎｏｌ，２００５，５（９）：６７５－６８７． 真核基因翻译起始规律，ＩＲＥＳ下游的ｍＲＮＡ的翻 译起始由核糖体直接进入ＩＲＥＳ位点进行翻译［１ ， 保证了Ｇ基因和ＩＦＮ一０ｔ基因各自的表达。 本试验成功构建了共表达狂犬病病毒ＣＶＳ毒 株ＧＰ基因和ＩＦＮ—Ｇｔ基因的真核表达载体，为进一 步研究狂犬病毒Ｇ基因和ＩＦＮ—ａ基因编码蛋白的生 物学活性及研制狂犬病基因疫苗奠定了基础。 参考文献： ［１］Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔｉ Ｃ Ｅ，Ｈａｎｌｏｎ Ｃ Ａ，Ｈｅｍａｃｈｕｄｈａ Ｔ．Ｒａｂｉｅｓ ｒｅｅｘａｍ— ［８３ Ｒａｉ Ｎ，Ｋａｕｓｈｉｋ Ｐ，Ｒａｉ Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｂｉｅｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ。２００５，４９：２０７— ２１０． ［９］孙树汉．核酸疫苗［Ｍ］．上海：第二军医大学出版社，２０００：１４９— １８０． ［１０３ Ｋｕｒｉｌｌａ Ｍ Ｇ，Ｇａｂｒｉｄｉｌｌａ Ｃ Ｄ，Ｈｏｌｌｏｗａｙ Ｂ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｌｅａｄｅｒ ＲＮＡ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１ ９８４，５０：７７３—７７８． ［１１］吴海涛，胡云龙，陈松，等．重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中 高效表达的影响因素［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００４，（８）；１２５． ｉｎｅｄ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００２，２：３２７—３４３． ［２］殷震，刘景华．动物病毒学（第２版）［Ｍ］．北京：科学出版 Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＶ ＣＶＳ Ｓｔｒａｉｎ Ｇｅｎｅ ａｎｄ ＩＦＮ－ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ一 ＬＩ Ｊｉａｎｇ—ｔａｏ ’ ，ＹＩＮ Ｘｉａｎｇ—ｐｉｎｇ ，ＬＩＵ Ｊｉ—ｘｉｎｇ ，ＬＩ Ｂａｏ—ｙｕ ， ＬＩ Ｘｕｅ—ｒｕｉ ，ＹＡＮＧ Ｂｉｎ ，ＬＡＮ Ｘｉ ，ＨＵ Ｙｏｎｇ—ｈａｏ。 （１．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｙ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｇａｎｓｕ，Ｌａｎｚｈｏｕ，７３００４６，Ｃｈｉｎａｌ ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ。７３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ＣＶＳ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ １ ５７５ ｂｐ、ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ，ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｇ ｇｅｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＶ ＣＶＳ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ＡＪ ５０６９９７ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ ｉｓ ９８．５ ．ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ＩＦＮ—ａ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＩＦＮ一０ｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ＮＭ ００１０１７４１１ ｆｒｏｍ Ｇｅｎｂａｎｋ ｉｓ ９１６ ．Ｇ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｘｈｏ Ｉ ａｎｄ Ｍｌｕ Ｉ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ．Ｐ ＩＲＥＳ，ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｔｈｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｐ ＩＲＥＳ－Ｇ．ＩＦＮ—ａ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓａｌ Ｉ ａｎｄ Ｎｏｔ Ｉ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐ ＩＲＥＳ—Ｇ，ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｔｈｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｐｌＲＥＳ－Ｇ／ＩＦＮ—ａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ＣＶＳ ｓｔｒａｉｎ；Ｇ ｇｅｎｅ；ＩＦＮ一０ｔ；ｐｌＲＥＳ ｖｅｃｔｏｒ
