分离提取 ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１６．０６．０１１ 食品研究与并发 Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１６年３月 第３７卷第６期 ４３ 腰果蛋白的提取及功能特性研究 叶婧 ，曾育蒙 ， ·。李建平 （１．广西高校食品安全与检测重点实验室桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林５４１００４； ２．深圳爱康生物科技有限公司，广东深圳５１８１３１） 摘要：以腰果为材料，以碱提酸沉法提取腰果中的蛋白，确定最优的提取参数，并探讨了腰果蛋白的功能性质。通过 正交试验结果可知，提取腰果蛋白影响因素重要性依次为：料液比＞提取时间＞提取液ｐＨ＞温度；最佳提取工艺条件：提 取时间２ｈ，提取液ｐＨ８．５，料液比１：１５（ｇ／ｍＬ），温度５５℃，腰果蛋白提取率为８５．２５％。对腰果蛋白功能性质的研究表 明，腰果蛋白的等电点ｐＩ为４．６；温度在５５℃时，蛋白质的溶解度达到最大；在浓度为０—０．９ ｍｏＹＬ的ＮａＣ１溶液中，腰果 蛋白出现盐溶现象，ＮａＣ１溶液浓度达到１．５ ｍｏ／／Ｌ时，则产生盐析现象；３０℃时，腰果蛋白持水力为３．３４ ，随着温度的 升高，腰果蛋白持水力逐渐下降；随着ＮａＣ１浓度的增加，腰果蛋白持水力先增大后减小，ＮａＣ１浓度为０．９ ｍｏｌ／Ｌ腰果蛋 白持水力最大达到３．６６ｇ／ｇ；腰果蛋白在温度３０。ｃ时持油力为１．３０ ，随着温度的升高腰果蛋白的持油性逐渐降低。 关键词：腰果；提取；优化；腰果蛋白；功能性质 Ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｃａｓｈｅｗ Ｎｕｔ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ＹＥ Ｊｉｎｇ ，ＺＥＮＧ Ｙｕ－ｍｅｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｘｉｕ－ｔｉ ’，ＬＩ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ （１．Ｇｕａｎｇｘｉ Ｃｏｌｌｅｇｅｓ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｉｋａｎｇ Ｍｅｄｔｅｃｈ ＣＯ．， ＬＴＤ．，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８１３１，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｔ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｃａｌｌｅｄ ａｌｋａｌｉ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃ－ ｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ＷａＳ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｓｏｌｉｄ—ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ＞ｔｉｍｅ＞ｐＨ＞ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗａｓ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ５５ ｏＣ ｆｏｒ ２ ｈ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １：１ ５（ｇ／ｍＬ）， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ８．５．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏ— ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｐＩ＝４．６，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ５５ ｏＣ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｓｏｌｖａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ．Ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎ－ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＣ１ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ０－０．９ｍｏｌ／Ｌ，ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｐｐｅａｒｅｄ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｏｆ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｂｌｅ，ｗｈｅｎ ＮａＣ１ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ １．５ｍｏｌ／Ｌ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ．Ａｔ ３０ ｏＣ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ—ｒｅｔａｉｎ－ ｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｗａｓ ３．３４ ｇ／ｇ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ－ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｇｒａｄｕ— ａｌｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ．Ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ－ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｉｒｓｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎ— ｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＣ１ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＣ１ ａｔ ０．９ ｍｏｌ／Ｌ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ—ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐａｃ— ｉｔｙ ｗａｓ ３．６６ ｇ／ｇ．Ａｔ ３０℃ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｉｌ—ｈｏｌｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｗａｓ １．３０ ｇ／ｇ．ａｓ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｉｓｅｓ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｉｌ－ｈｏｌｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ 腰果（ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔｓ）是一种肾形坚果，属多年生热 基金项目：广西高校食品安全与检测重点实验室资助项目；广西自然 科学基金资助项目（２０１５ＧＸＮＳＦＡＡ１３９０９４） 作者简介：叶婧（１９９５一），女（汉），在读本科，生物工程专业。 带常绿乔木果树ｌｌｌ，生于热带亚热带，是世界著名四大 坚果之一『２Ｊ，具有非常高的营养药用和保健价值网。腰 果是果实的种子，腰果含有较高的热量，其热量来源 主要是脂肪，其次是碳水化合物和蛋白质，其中蛋白 质含量可高达２１％。ＡＲＥＳ ＤＪ等『４１指出腰果蛋白质含 通信作者：（１９６４一），女（汉），高级工程师，硕士生导师，学 士，主要从事应用生物技术方向研究。 量是一般谷类作物的２倍之多，氨基酸的种类与其他 叶婧，等：腰果蛋白的提取及功能特性研究 分离提取 —＝＝＝４４ 谷类作物的氨基酸种类互补，是一种具有高营养价值 的食物。ＲＩＢＥＩＲＯ ＶＧＰ等 晰究认为浓缩腰果蛋白可 作为食品添加剂添加入食品，还可以作为功能性食 品，蛋白质的功能性质影响着食品的感官品质，对食 品在加工、贮存或运输过程中的性质保持起主要作 用。钟俊桢等同研究腰果蛋白提取条件优化。然而国内 外对腰果蛋白的等电点、水溶性、持水性及持油性的 研究较少。本研究对腰果中蛋白质进行提取，并对其 等电点、水溶性、持水性及持油性等功能进行研究。 １材料与方法 １．１试剂与仪器 １．１．１原料 腰果：市购；试剂：石油醚、盐酸、氢氧化钠、二水磷 酸氢二钠、十二水磷酸二氢钠、氯化钠、牛血清蛋白、考 马斯亮蓝Ｇ一２５０：均为分析纯。 １．１．２仪器 ＦＷ１００型高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公 司；ＺＸＲＤ—Ｂ５１１０型干燥箱；３－３０Ｋ型高速冷冻离心 机：德国ＳＩＧＭＡ公司；ＵＶ一７６０一ＣＲＴ型紫外可见分光 光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；ＰＢ一１０型标 准酸度计：德国赛多利斯科学仪器有限公司；ＦＤ一１Ｂ一 ５０型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司； ＢＳ１１０Ｓ型电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公 司；ＨＨ—Ｓ型恒温水浴锅：江苏省金坛市医疗仪器厂； ８５—２型恒温磁力搅拌器、ＳＨＢ—ＩＩＩＳ型循环水真空泵： 郑州长城科工贸有限公司；索氏提取器：上海精密仪 器仪表有限公司。 １．２试验方法 １．２．１腰果蛋白提取率的测定 １．２．１．１牛血清蛋白标准曲线的绘制 以牛血清蛋白为标准品，用蒸馏水配成０．１ ｍｇ／ｍＬ 标准溶液，按表１加入各反应试剂后，于２ ｍｉｎ～１０ ｍｉｎ 内测定５９５ ｎｍ波长处吸光度，牛血清蛋白浓度为横坐 标，Ａ 为纵坐标，绘制标准曲线。取待测样品稀释相 应倍数，取稀释后样品１ ｍＬ，加入５ ｍＬ考马斯亮蓝 Ｇ一２５０，于２ ｍｉｎ一１０ ａｒｉｎ内测定５９５ ｎｍ波长处吸光度 （以表中１号管为空白对照）。根据标准曲线方程计算 样品中蛋白含量，进而求蛋白提取率［７１。 １．２．１．２腰果蛋白提取率的计算 腰果蛋白提取率／％：Ｃ× ×稀释倍数×１００ ．） 式中：ｃ为腰果蛋白浓度，ｍｇ／ｍＬ；２５０为腰果蛋白 表１牛血清蛋白标准曲线制作加样表 Ｔａｂｌｅ １ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｎｉ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｓａｍｐｌｅ ｌｉｓｔ 体积，ｍＬ；５２５为２．５ｇ腰果粉中腰果蛋白总含量，ｍｇ。 １．２．２碱提酸沉法提取腰果蛋白 参考高兴等［８１的研究，做出调整。用高速粉碎机将 腰果粉碎，过８０目筛。精确称取２．５ ｇ腰果粉放人索氏 提取器中，脱脂６ ｈ一８ ｈ，脱脂后的腰果粉低温烘干待 用。取以上烘干的腰果粉加入适当ｐＨ，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷 酸盐缓冲液在恒温磁力搅拌器下搅拌浸提一定时间 后，倒出上清液，沉积物以相同条件进行二次提取。合 并两次提取液，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取上清液定 容至２５０ ｍＬ，用考马斯亮蓝法测上清液蛋白含量。离 心后的上清液，用适当浓度ＨＣ１调至腰果蛋白等电 点，静置３０ ｍｉｎ。对上述溶液进行抽滤，收集沉淀进行 冷冻干燥，最后得到腰果蛋白。 １．２－３腰果蛋白提取工艺优化 １．２．３．１温度对腰果蛋白提取率的影响 准确称取２．５ ｇ腰果粉，经过脱脂烘干后，加入 ５０ ｍＬ ｐＨ７．５的磷酸缓冲液中，分别在温度４０、４５、５０、 ５５、６０℃条件下，提取１ ｈ收集提取液，沉淀以相同条 件进行二次提取，合并提取液，于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ２０ ｍｉｎ，上清液定容至２５０ ｍＬ，按照１．２．１．１和１．２．１．２ 方法测定腰果蛋白提取率。 １．２．３．２ ｐＨ对腰果蛋白提取率的影响 准确称取２．５ ｇ腰果粉，经过脱脂烘干后，在５０℃ 条件下，分别加入５０ ｍＬ ｐＨ７．０、７．５、８．０、８．５、９．０的磷 酸盐缓冲液，提取１ ｈ收集提取液，沉淀以相同条件进 行二次提取，合并提取液，于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ， 上清液定容至２５０ ｍＬ，按照１．２．１．１和１．２．１．２方法测 定腰果蛋白提取率。 １．２．３．３料液比对腰果蛋白提取率的影响 准确称取２．５ ｇ腰果粉，经过脱脂烘干后，在５０℃ 条件下，分别以料液比１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１： ３０（ｇ／ｍＬ）￣ＪＩＩＡ ｐＨ７．５的磷酸盐缓冲液，提取１ ｈ收集 提取液，沉淀以相同条件进行二次提取，合并提取液， 分离提取 叶婧，等：腰果蛋白的提取及功能特性研究 于１２０００ ｒ／ａｒｉｎ离心２０ｒａｉｎ，上清液定容至２５０ｍＬ，按 照１．２．１．１和１．２．１．２方法测定腰果蛋白提取率。 １．２．３．４时间对腰果蛋白提取率的影响 准确称取２．５ ｇ腰果粉，经过脱脂烘干后，在５０℃ 条件下，加入５０ ｍＬ ｐＨ７．５的磷酸缓冲液中提取时间 分别为Ｏ．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｈ，重复二次，合并提取液， 于１２ ０００ ｒ／ａｒｉｎ离心２０ ａｒｉｎ，上清液定容至２５０ ｍＬ，按 照１．２．１．１和１．２．１．２方法测定腰果蛋白提取率 。 １．２．３．５正交试验 在单因素试验基础上，参考郭兴峰等㈣的研究进 行四因素三水平正交试验，试验水平见表２。 表２因素水平表 Ｔａｂｌｅ ２ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔａｂｌｅ １．２．４腰果蛋白等电点的测定 取７份腰果提取液每份２０ ｍＬ，用适当浓度盐酸 调ｐＨ分别为４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８使蛋白质沉 淀静置３０ ａｒｉｎ，４ ０００ ｒ／ａｒｉｎ离心１０ ａｒｉｎ后取上清液按 照１．２．１方法测定，并参考王姝等＿ｌｌ１的研究，Ａ５９５最小 值对应的ｐＨ即为腰果蛋白等电点。 １．２．５腰果蛋白的水溶性 １．２．５．１温度对腰果蛋白的水溶性的影响 准确称取腰果蛋白０．０３ ｇ，在３０、４０、５０、６０、７０℃ 条件下加入蒸馏水中振荡溶解２０ ｒａｉｎ，４ ０００ ｒ／ａｒｉｎ离 心１０ ａｒｉｎ，在５９５ ｎｍ波长下，测上清液吸光度，吸光度 大的，相应溶解度就大。 １．２．５．２ ｐＨ对腰果蛋白的水溶性的影响 准确称取腰果蛋白０．０３ ｇ，在３０ ｑＣ条件下，分别 加入ｐＨ为２．０、４．０、５．０、６．０、７．０的２０ ｍＬ水溶液中，振 荡溶解２０ ａｒｉｎ，４ ０００ ｒ／ａｒｉｎ离心１０ ａｒｉｎ，在５９５ ｎｍ波长 下，测上清液吸光度，吸光度大的，相应溶解度就大。 １．２．５．３ ＮａＣ１浓度对腰果蛋白的水溶性的影响 准确称取腰果蛋白０．０３ ｇ，在３０℃条件下，分别加 入ＮａＣ１浓度为０－３、０．６、０．９、１．２、１．５ ｍｏｌ／Ｌ的盐溶液中， 振荡溶解２０ｒａｉｎ，４０００ ｒ／ａｒｉｎ离心ｌＯｍｉｎ，在５９５ｎｍ波长 下，测上清液吸光度，吸光度值大的，相应溶解度就大。 １．２．６腰果蛋白持水力的测定 准确称取Ｍｏ（ｇ）腰果蛋白，置于原重量Ｍ。（ｇ）的干 燥５ＯｍＬ刻度离心管中，加入３０ｍＬ蒸馏水，搅匀１ｒａｉｎ， 在４０℃的恒温水浴锅静置３０ｒａｉｎ，然后经过４０００ｒ／ａｒｉｎ 离心１０ ｒａｉｎ，弃去上清液，称取离心管总重量 （ｇ）， ４５＝＝．Ｉ 则腰果蛋白持水力Ｍ３（ｇ／ｇ）： 慨＝ １．２．６．１温度对腰果蛋白持水性的影响 试验步骤同１．２．６，控制温度分别在３０、５Ｏ、６０、７０、 ８０℃的条件下。 １．２．６．２ ｐＨ对腰果蛋白持水性的影响 试验步骤同１．２．６，控制ｐＨ分别在３．０、４．０、５．０、 ６．０、７．０的条件下。 １．２．６．３盐浓度对腰果蛋白持水性的影响 试验步骤同１．２．６，控制盐浓度分别在０．３、０．６、 ０．９、１．２、１．５ ｍｏｌ／Ｌ的条件下。 １．２．７腰果蛋白持油力的测定 准确称取ｇｏ（ｇ）腰果蛋白，置于原重量Ｍ （ｇ）的 干燥１０ ｍＬ刻度离心管中，加入５ ｍＬ植物油，搅匀 １ ｒａｉｎ，分别在３０、４Ｏ、５Ｏ、６０、７０、８０℃的恒温水浴锅静 置３０ｒａｉｎ，然后经过４０００ ｒ／ａｒｉｎ离心１０ｒａｉｎ，弃去上层 植物油，称取离心管总重量 （ｇ），则腰果蛋白持油力 Ｍ３（ｇ／ｇ）： ＝ 鲁 ２结果与分析 ２．１牛血清蛋白标准曲线的绘制 牛血清蛋白加样管试验结果见表３，牛血清标准 物的回归方程及其参数见表４。 表３牛血清蛋白加样管试验结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｌ＇ｌｌｌｎ ａｌｂｕｍｉｎ 表４牛血清标准物的回归方程及其参数 Ｔａｂｌｅ ４ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎｔｉｔｈｅｓｉｓ ｂｏｖｉＲｅ Ｓｅｌｔ＇ｌｌｌｍ ａｌｂｕｍｉｎ ２．２碱提酸沉法提取腰果蛋白 ２．２．１单因素试验 ２．２．１．１温度对腰果蛋白提取率的影响 测定温度对腰果蛋白提取率的影响结果见图１。 叶婧，等：腰果蛋白的提取及功能特性研究 分离提取 －＝＝＝４６ 图１温度对腰果蛋自提取翠的影响 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 由图１可知，当其他提取条件相同时，随着温度的 升高，腰果蛋白的提取率也逐渐增加。当温度为５５℃的 时候，腰果蛋白的溶解度最大，提取率最高为７６．２５％。 温度再继续升高，腰果蛋白的提取率则下降，这可能 是温度过高使蛋白质变性，从而容易沉降下来。 ２．２．１．２ ｐＨ对腰果蛋白提取率的影响 测定ｐＨ对腰果蛋白提取率的影响结果见图２。 瓣 图２ ｐＨ对腰果蛋白提取率的影响 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｐＨ ｏｎ ｈｔｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 由图２可知，由于腰果蛋白的等电点ｐＩ为４．６，当 提取液ｐＨ高于等电点，蛋白质的稳定性加强，蛋白质 比较难沉淀，所以提取液中溶解了比较多的蛋白质。 碱性提取液的浓度逐渐增加，ｐＨ上升，蛋白质的稳定 性进一步加强，提取液中蛋白质含量也越高，故提取 率升高，当提取液ｐＨ为８．５，提取率最高达到８０．８３％。 但当碱性缓冲液ｐＨ＞８．５时，提取率反而呈现下降趋 势，这可能是因为随着碱性加强，提取液易糊化造成 分离困难，蛋白质发生变性沉淀，故蛋白提取率反而 降低。 ２．２．１．３料液比对腰果蛋白提取率的影响 测定料液比对腰果蛋白提取率的影响结果见图３。 由图３可以看出，随着水量的逐渐增加，腰果蛋白 提取率也随之逐渐增高，料液比１：１５（ｇ／ｍＬ）时，腰果 蛋白提取率为７２．８７％，但是料液比高于１：１５（ｇ／ｍＬ） 后，提取率反而呈现下降趋势。可能是水量太多搅拌 提取的过程中产生气泡，不利于蛋白质的溶解。 蒋 料液比／（ｇ／ｍＥ） 图３料液比对腰果蛋白提取率的影响 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｈｔｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ２．２．１．４时间对腰果蛋白提取率的影响 测定时间对腰果蛋白提取率的影响结果见图４。 旃 时间／ｈ 图４时间对腰果蛋白提取率的影响 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 由图４可知，随着提取时间的增长，蛋白提取率逐 渐增加，但是增加速度很缓慢，当提取时间为２ ｈ左 右，蛋白提取率最高，达到７７．４５％。当提取时间继续 提高，蛋白提取率下降的比较大，这可能是因为提取 时间的增长，导致提取液的挥发，蛋白的溶解量下降， 而且随着提取时间的增长，蛋白也容易变性而沉淀下 来，蛋白提取率减少。 ２．２．２提取工艺的正交试验 正交试验结果见表５。 表５正交试验Ｌ （３ ）结果 Ｔａｂｌｅ ５ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅ￣ｍｅｎｔ Ｌ９（３ ） 试验号 腰果蛋白提取率／％ ７１．５４ ７９．０５ ７５．９８ ７４．３４ ６４．７８ ７７．９９ ７１．７２ ８３．５９ ８１．７２ ７５．５２ ７７．７ｌ ７２．６８ ７２．３７ ７８３７ ７６．２５ ７９．０１ ７０．８３ ７７．９７ ６．６４ ７．５４ ５．２９ 分离提取 叶婧，等：腰果蛋白的提取及功能特性研究 通过正交试验和数据处理，得出最佳提取条件。 影响腰果蛋白提取率的因素主次顺序为Ｃ＞Ａ＞Ｂ＞Ｄ。从 极差分析可知，提取工艺条件Ａ，Ｂ，Ｃ２Ｄ 最好，即提取 时间２ ｈ，提取液ｐＨ８．５，料液比为１：１５（ｇ／ｍＬ），提取 温度５５℃。按最佳工艺条件提取腰果３次，腰果蛋白 提取率为８５．２５％。 ２．３腰果蛋白功能性质 ２．３．１腰果蛋白等电点的测定 测定腰果蛋白的等电点。结果见图５。 图５不同ｐＨ下蛋白质上清液的吸光度 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ Ａ￣ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐＨ 由图５可知：腰果蛋白在ｐＨ为４．６时，离心后的 上清液蛋白含量最低，即蛋白质在该ｐＨ下沉降下来 的量最多，所以腰果蛋白的等电点ｐＩ为４．６。 ２．３．２腰果蛋白的水溶性 ２．３．２．１温度对腰果蛋白水溶性的影响 测定温度对腰果蛋白水溶性的影响结果见图６。 ０．６ Ｏ．５ Ｏ．４ Ｏ．３ Ｏ．２ Ｏ．１ Ｏ 温度，℃ 图６温度对腰果蛋白水溶性的影响 Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ 从图６可以看出，温度的增高，蛋白质的溶解度也 相应增加，在温度５５℃左右溶解度达到最大，超过此 温度，溶解度随温度的升高而降低。这是因为温度较 低时，水分子与蛋白质分子的相互作用较小，当温度 适当增加时，腰果蛋白的分子构象发生变化，分子的 立体结构舒展开来，有利于腰果蛋白分子和水分子相 互作用，温度的升高，蛋白质溶解的越多。当温度继续 升高，超过蛋白质的变性温度时，蛋白质过分变性，其 空间构象中的弱健断裂，破坏了肽键的结构，原来包 ４７＝＝＝一 在分子内部的疏水集团暴露，分子间相互结合凝结沉 淀，从而降低了蛋白质的溶解度。 ２．３．２．２ ｐＨ对腰果蛋白水溶性的影响 测定ｐＨ对腰果蛋白水溶性的影响结果见图７。 ｐＨ 图７ ｐＨ对腰果蛋白水溶性的影响 Ｆｉｇ．７ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｈｔｅ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ 由图７可知，腰果蛋白在不同ｐＨ条件下，溶解性 不同，在ｐＨ为５左右溶解度最小，而在偏离ｐＨ的酸 性和碱性条件下，溶解度较高，由此可知大部分蛋白 质的等电点在ｐＨ为５左右，因为腰果蛋白是两性分 子，在偏离等电点的环境中，蛋白质既带有正电荷，也 带有负电荷，电荷相互作用，分子分散性好。此外，蛋 白质分子表面的极性基团与水分子之间的吸引力，使 蛋白质分子在水中高度水化，溶液ｐＨ离蛋白质的等 电点越远，水化作用越弱，则蛋白质分子分散性越好， 溶解度越大。这与其它蛋白质的性质一样。 ２．３．２．３盐浓度对腰果蛋白水溶性的影响 测定盐浓度对腰果蛋白水溶性的影响结果见图８。 图８ ＮａＣＩ浓度对腰果蛋白水溶性的影响 Ｆｉｇ．８ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＣｉ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ 由图８可知，在０－０．９ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１溶液中，腰果蛋 白的溶解度随盐浓度的增大而提高，当盐浓度超过 ０．９ ｍｏｌ／Ｌ时，腰果蛋白的溶解度下降。这是因为：当盐 浓度较低时，盐离子与蛋白质分子带相反电荷的基团 相互作用而形成双电层，降低了蛋白质分子间的静电 作用，蛋白质分子游离开来，蛋白质溶解量则增大，当 盐浓度超过此范围时，离子中和了蛋白质的电荷，破 叶婧，等：腰果蛋白的提取及功能特性研究 分离提取 ８ 坏了双电层的水化膜，蛋白质分子间聚集沉淀析出。 ２．３－３腰果蛋白的持水性 ２．３．３．１温度对腰果蛋白持水性的影响 测定温度对腰果蛋白持水性的影响结果见图９。 ＊ 姑 图９温度对腰果蛋白持水性的影响 Ｆｉｇ．９ Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｃａｓｈｅｗｎｕｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｔｅｒ－ ｅｒｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ 由图９可知，当温度为３０℃，腰果蛋白持水力为 ３．３４ ｇ／ｇ，随着温度的升高，腰果蛋白持水力呈下降趋 势，这是因为温度升高，蛋白质发生变性，蛋白质分子 内的非极性基团大量暴露，而使持水力减小。 ２．３．３．２ ｐＨ对腰果蛋白持水性的影响 测定ｐＨ对腰果蛋白持水性的影响结果见图１０。 ＊ 地 ｐＨ 图１０ ｐＨ对腰果蛋白持水性的影响 Ｆｉｇ．１０ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｔｈｅ ｃａｓｈｅｗｎｕｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｔｅｒ－ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ 由图１０可知，ｐＨ为５时，腰果蛋白的持水力为 ２．７６ ｇ／ｇ。当ｐＨ接近等电点时，蛋白质的持水性最小， 这主要是因为在等电点时，蛋白质带静电荷量小，水 化层变小，持水性也相应变小。 ２．３．３．３盐浓度对腰果蛋白持水性的影响 测定盐浓度对腰果蛋白持水性的影响结果见 图１１。 由图１１可知，在０￣０．９ ｍｏｌ／ＬＮａＣ１溶液浓度范围 内，随着浓度的提高，腰果蛋白的持水力有所增加， ０．９ ｍｏ１／ＬＮａＣ１溶液中腰果蛋白的持水力为３．６６ ｇ／ｇ；在 ０．９ ｍｏ１／Ｌ～１．５ ｍｏｌ／Ｌ的范围内，随着浓度的提高，蛋白 质的持水力减小。因为盐和蛋白质分子之间会产生水 Ｒ ＊ 姑 ＮａＣ１浓度／（ｔｏｏｌ／Ｌ） 图１１ ＮａＣＩ浓度对腰果蛋白持水性的影响 Ｆｉｇｌｌ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｆｉｏｎ ｏｆ ＮａＣＩ ｏｎ ｔｈｅ Ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｔｅｒ—ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ 化层的竞争性结合，低盐浓度时，蛋白质水化增加；高 盐浓度时，水盐相互作用超过了水蛋白质的相互作 用，因而破坏了蛋白质分子的水化层，产生盐析现象。 ２．３．４腰果蛋白持油性 测定温度对腰果蛋白持油性的影响结果见图１２。 靶 图１２温度对腰果蛋自持油性的影响 Ｆｉｇ．１２ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｉｌ— ｈｏｌｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ 由图１２可知，当温度为３０℃时，腰果蛋白的持油 力为１．３Ｏ ｇ，ｇ，在３０ ｃＣ ７０ ｏｃ范围内，温度的升高，腰果 蛋白的吸油性逐渐变少，这是因为温度的升高，植物 油的黏度降低，流动性增强，从而与蛋白质分子的结 合减弱了。此外图１２表明，４０ ｃｃ后蛋白质吸油性下降 的很缓慢，由此可见腰果蛋白的吸油性受温度变化的 影响较小。 ３结论 １）本文采用碱提酸沉法提取腰果中蛋白质，通过 正交试验优化得到最佳工艺条件为提取时间２ ｈ，提取 液ｐＨ８．５，料液比１：１５（ｇ／ｍＬ），温度５５℃，腰果蛋白提 取率为８５．２５％；影响腰果蛋白提取率的因素主次顺 序为：料液比＞提取时间＞提取液ｐＨ＞温度。 ２）通过对腰果蛋白功能性质的试验研究得到：腰 果蛋白的等电点ｐＩ为４．６；温度在５５ ｑＣ时，蛋白质的 分离提取 叶婧，等：腰果蛋白的提取及功能特性研究 ４９＝＝＝一 溶解度达到最大；在浓度为０～０．９ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１溶液 ４１—４６． ７ ７ 中，腰果蛋白出现盐溶现象，ＮａＣ１溶液浓度达到 【４】 ＳＯＡＲＥＳ Ｄ Ｊ，ＭＥＮＥＺＥＤ Ｄ Ｖ，ＰＥＤＲＯ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｖａｌｅｎｔ ｆａｔｔｙ １．５ ｍｏｌ／Ｌ时，则产生盐析现象；温度为３０℃时，腰果 ａｃｉｄｓ ｉｎ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｅｕｈｉ－ 蛋白持水力为３．３４ ｇ／ｇ，随着温度的升高，腰果蛋白持 ｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈ— ｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（２）：２６５—２７０ 水力逐渐下降；ｐＨ为５．０时，蛋白质持水力为２．７６ ｇ／ｇ； ［５］ＲＩＢＥＩＲＯ Ｖ Ｇ Ｐ，ＢＡＲＲＥＴＯ Ａ Ｃ Ｈ，ＤＥＮＡＲＤＩＮ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｍａｇ－ 随着ＮａＣ１浓度的增加，腰果蛋白持水力先增大后减小， ｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎａｃａｒｄｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｓｈｅｗ ＮａＣ１浓度为０．９ ｍｏｌ／Ｌ腰果蛋白持水力达到３．６６ ｇ／ｇ； ｎｕｔ ｓｈｅｌｌ ｌｉｑｕｉｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉｌａｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，４８（２２）：７８７５－ 腰果蛋白在温度３０ ｃ【＝时持油力为１．３０ ｇ／ｇ，随着温度 ７８８２ 的升高腰果蛋白的持油性逐渐降低。 【６ 钟俊桢，６Ｊ顿儒艳，黄宗兰，等．腰果蛋白的提取工艺条件优化『Ｊ］．食 ３）由于腰果的蛋白的功能性研究获得突破，相信 品科学，２０１４。３５（１６）：１８—２２ ［７］中华人民共和国卫生部．ＧＢ ５００９．５—２０１０食品安全国家标准食 在不久的将来可以为蛋白质的工业生产提供理论依 品中蛋白质的测定［ｓ】．北京：中国标准出版社，２０１０ 据和技术支持。那么对于如何利用这种新兴蛋白资源 【８］高兴，李桂娟．碱提酸沉法提取燕麦蛋白的工艺研究【Ｊ１＿中国西部 则将成为新的难点和热点。 科技，２０１０，９（３ １）：３２—３３ ｆ９】钟立人．食品科学与工艺原理［Ｍ】．北京：中国轻工业出版社， 参考文献： １９９９：１７７—１８０ ［１】黄海杰，黄伟坚，张中润，等．７个国外腰果品种株型多样性分析 ［１Ｏ］郭兴峰，陈计峦，林燕，等．热榨和冷榨核桃饼粕中蛋白质提取及 ［Ｊ１＿广东农业科学，２０１０，１０（１）：７１—７４ 其性质研究【Ｊｊ．农业工程学报，２０１２，２８（１８）：２８７—２９２ 【２］黄敏，操庆国．腰果产业具有良好的发展前景［Ｊ］＿食品工程，２００９ 【１１】王姝，王昌涛，于国萍．羽扇豆蛋白的提取及性质研究【Ｊ】．食品科 （１）：２７－２９ 技，２０１２，３７（５）：２３０－２３５ ［３】赵丽，黄海杰．我国腰果研究概况［Ｊ】．中国南方果树，２０１２，４ｌ（２）： 收稿日期：２０１５—０１—１２ （上接第４２页） 绿色，造成蕨菜中锌含量增加，且易超过标准限量。故 ｌ５ 在蕨菜复绿过程中，不应单单依靠复绿后色泽的变化 ［４］万新，李发建．蕨菜快速护绿保脆与保鲜试验［Ｊ】．湖北农业科学 来判断是否为复绿剂最佳添加浓度，应结合腌制工艺 学报，２００３ｆ４）：６７—６９ 中的氧化程度、蕨菜本身含锌量及复绿后锌含量共同 ［５】 肖敏，周广嵘．常见元素锌铜铁钙镁的临床检验意义仁【ＪＪ．微量元 确定工艺最优组合。 素与健康研究，１９９７，１４（１）：６１ ［６ 张帆，６］罗水忠，高保药．蕨菜的化学成分研究［Ｊ］．天然产物研究与 开发，２００４，１６（２）：１２１－１２３ ４结论 ［７］任健敏，彭珊珊，张霖霖，等．火焰原子吸收法测定大豆和豆制品 通过色差仪对于色泽的测定和火焰原子吸收分 中铁、锌、铜、铬和镍［Ｊ］．光谱实验室，２００６，２３（２）：３１４—３１５ 光光度计对于锌元素含量的测定，可综合看出氯化锌 ［８】李宝树，于斌．采用两种方法评估中国蔬莱营养价值的结果及意 复绿剂对于腌制蕨菜有复绿效果，且复绿之后对于蕨 见『ＪＩ．吉林蔬莱，１９９９￣）：４—６ 菜的含锌量虽有影响，但基本上是在林业行业标准规 ［９］董然，刘松，富力，等．三种野菜罐制品氨基酸和无机元素的分析 定的范围之内的。当复绿剂选用氯化锌时，腌制蕨菜 『Ｊ】．吉林农业大学学报，１９９３，１５（３）：７４—７６ 复绿过程的最优工艺参数为：烫漂温度９５℃、烫漂时 ［１Ｏ】骆仲义，杜进民，陈杰，等．袋装蔬菜护绿方法的研究【Ｊ】．食品科学， 间４ ｍｉｎ、复绿剂浓度４００￣ｇ／ｍＬ，复绿后锌元素含量 １９９４（８）：１２－１４ ［１１】中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会．ＧＢ／Ｔ 为２１．８４ Ｉ￣ｇ／ｇ，较复绿前增加１４５．７％。 ５００９．１４—２００３食品中锌的测定［ｓ】．北京：中国标准出版社，２００３： １０８－ｌ１０ 参考文献： ［１２】白雪松，宋春梅，杜鹃，等．火焰原子吸收光谱法测定黄花菜中微 ［１】孙冬梅，王琦，王凤彬．保鲜山野菜生产企业状况调查报告【ＪＪ．中 量元素含量［Ｊ】＿安徽农业科学，２０１２，４０（８）：４８５２—４８５３ 国饮食卫生与健康，２００５，３（２）：２２—２３ ｆｌ３】白雪松，杜鹃，刘新迪．火焰原子吸收光谱法测定黄花菜根中微量 ［２】王超颖．蕨莱的栽培与加工技术 ．黑龙江科技信息，２０１ ｌ（１６）： 元素含量［Ｊ】．广东微量元素科学，２０１ ｌ，１８（１ １）：４２—４５ ２１７—２１７ 【３】余虹．蕨菜的栽培与加工技术【Ｊ】．农村经济与科技，２００２，１３（８）：１５一 收稿日期：２０１５—０１—１４
