一株纤维素酶产生菌的酶学特性研究

不同纤维素降解微生物具有不同的纤维素酶系，其内外切酶的含量、种类比例和活性大小都有很大的差别。在纤维素酶中一个酶系往往会有多个在结构、功能和活性上不同的组分，而每一组分又可能分成不同的亚组分。同一微生物，也可能因为不同的地区来源和不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别，这也是纤维素酶多形性的表现。

细菌纤维素酶是多酶复合体系, 根据各酶的功能可分为三大类:( 1) 内切葡聚糖酶( 1,4- D- glueanohydrolase 或endo-1,4- β- D- glucanase, EC 3.2.1.4) , 简称Cen。作用于纤维素内部的非结晶区, 随机水解β- 1,4- 糖苷键, 将长链纤维素分子截短, 产生大量非还原性末端的小分子纤维素, 其分子量大小约为23- 146KD。( 2) 外切葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4- β- D- glucan cellobio- hydrolase 或exo- 1,4- β- Dglucanase,EC3. 2.1.91), 简称Cex。作用于纤维素线状分子末端, 水解β- 1, 4- D- 14 糖苷键, 依次切下一个纤维二糖分子,故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase), 分子量约38- 118 KD。( 3) β- 葡萄糖苷酶( β- 1,4- glucosidase,EC3.2.1.21) 简称BG 或称纤维二糖酶。这类酶一般将纤维二糖或可溶性的纤维糊精水解成葡萄糖分子, 其分子量约为76KD。

不同微生物产生的纤维素酶分子量差异很大，即使同一酶系中的酶也有较大差异。一般β一葡萄糖普酶的分子量最大，常大于70kDa，有的甚至达400kDa。外切纤维素酶的分子量一般在50kDa-60kDa左右。内切0一葡萄糖昔酶一般低于50kDa，文献报道中，最小的内切纤维素酶分子量为5. 3kDa

纤维素酶的最适温度范围一般在40C- 60C，纤维素酶各组分的热稳定性差别较大，一般地，内切酶热稳定性好，外切酶和β一葡萄糖昔酶较差。

芽抱杆菌属的某些种，可以产生在碱性条件下保持较高活性的纤维素酶。

1、供试菌株：从柞蚕肠道筛选的产纤维素酶菌株，经鉴定为芽孢杆菌，斜面培养基保存于4℃冰箱。

2、牛肉膏蛋白胨培养基（NA）： 蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g琼脂18.0g，水1000 mL。

筛选培养基 ： 羧甲基纤维素钠培养基( CMC平板) : NaCl 5g ,MgSO4 ·7H2O 0.1g , KH2PO4 0.5g ,CaCl2 0.1g ,CMC-Na 15g ,酵母粉1.0g ,蒸馏水1000mL ,pH7.0，固体培养基加18g琼脂。

种子培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL

产酶发酵培养基：NaCl 5g ,MgSO4 ·7H2O 0.1g , KH2PO4 0.5g ,CaCl2 0.1g，CMC-Na 10g，蛋白胨 1g，酵母粉 1g。

3、酶活测定 发酵液经5000r/min 离心10min ,上清液作为粗酶液。取0. 5mL 稀释液加入试管中,加入1. 0mL 1 % CMC - Na （pH7.0磷酸盐缓冲液配制）底物溶液,50 ℃水浴保温30min ,加入DNS 试剂1mL ,沸水浴5min ,冷却后加入4mL 蒸馏水,振荡摇匀,在540nm 波长下用分光光度计测OD 值。等量失活酶液同样处理作对照,以扣除酶液中的还原糖。

葡萄糖标准曲线的制备 取标准葡萄糖溶液（10mg／mL)10mL，定容至100mL，得溶液(1mg／mL)，配制不同葡萄糖含量的溶液，具体见表1。将配制的混合液(5mL)于沸水浴中煮沸5min，流动水冷却后，加水10mL，摇匀，520nm处测定光密度。

表1 标准葡萄糖溶液的配制

Tab1 The normal glucose-solution’s preparation

葡萄糖标准液/ml 相当于葡萄糖/mg 蒸馏水/ml DNS试剂/ml 1 0.2 0.2 1.8 1.5 2 0.4 0.4 1.6 1.5 3 0.6 0.6 1.4 1.5 4 0.8 0.8 1.2 1.5 5 1.0 1.0 1.0 1.5 6 1.2 1.2 0.8 1.5 7 1.4 1.4 0.6 1.5 0 0.0 0.0 2.0 1.5

将以上各管溶液混匀后，在紫外可见分光光度计（540nm）进行比色测定，用空白管溶液调零，记录光密度值。

50℃，pH7.0条件下，每分钟水解CMC产生相当于1μg还原糖所需的酶量，定义为一个酶活单位，以U/ml表示。

C酶活力U/ml=葡萄糖含量（μg）*稀释倍数/（30min*0.5ml）

葡萄糖标准曲线 以葡萄糖含量（mg）为横坐标，OD520nm值为纵坐标，绘制出标准曲线。如图7

1.61.41.2y = 0.9482x + 0.051R2 = 0.9908OD520nm10.80.60.40.2000.5Glu含量mg11.5

图7 葡萄糖标准曲线 Tab7 The normal curve of Glucose

4、酶学特性研究 温度 30 40 50 60 70

PH 5 6 7 8 9 10 发酵时间 10 20 30 40 50

5、蛋白质含量测定 考马斯亮蓝比色 与纯培养液对照

6、SDS-PAGE电泳

7、酶的分离纯化 粗酶液制备 硫酸铵沉淀 透析脱盐 脱水浓缩

Sephadex G 凝胶层析

2.2.7 纤维素酶的分离纯化

纤维素酶发酵过程中除了纤维素酶之外，还存在部分的杂蛋白。根据微生物本身独特的物理特性(溶解度、不同界面的吸附性等)，可以从含有不同酶或生化物质的多成分混合物中将特定酶分离出来。酶的提取和分离纯化是指将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程。本实验选用盐析、凝胶过滤等方法对纤维素酶进行分离纯化。纯化在4℃下完成。首先，将66.5℃培养24小时的培养液10000r/min离心30min去菌体，得到上清液，然后再进行盐析、透析脱盐、层析、浓缩。 2.2.7.1盐析法操作步骤 (1)确定盐析时饱和度范围

A将得到的去菌体发酵液分装至8支离心管中，每管4m1.

B加硫酸钱，至8支离心管中的硫酸钱饱和度分别为20%,3 0%,4 0%,5 0%，60% , 7 0% , 8 0%和90%。在加硫酸按时需缓慢的加入，同时不断的摇晃离心管 使 硫 酸 钱 完全溶解。 C 4 ℃ 静 置 于过 夜。

D离 心 ， 分 别 取各离心管中的上清，测量上清液中剩余纤维素酶的活性。然后 比 较 测量结果，找到使得上清中剩余纤维素酶活性降低幅度最大的硫酸按饱和度区间Xl%^-X2%, (2)盐析

A在 5 0m L离 心 去菌体后的上清中缓慢加入硫酸按至X1%饱和度; B4 ℃ 过 夜 ;

C1 00 00 r/m in 离心30min弃沉淀，取上清液，测上清液体积; D在上清中继续缓慢加硫酸铰至X2%饱和度; E4 ℃ 过 夜 ;

F 10000 r/ mi n离心30min弃上清液，沉淀溶于5mL O.lmol/L柠檬酸一Na2 HP O;缓 冲 液 ( pH7 .0) 中。 2.2.7.2透析脱盐 (1 )透析袋的预处理

A将 透 析 袋剪成合适的长度。

B在 一 只 250mL的玻璃烧杯中加入200mL的2%碳酸氢钠和0.00 028的EDTA. C将 透 析 袋装入其中，煮沸10m ina D用 蒸 馏 水彻底洗涤。 E蒸 馏 水 中煮10m ina

F冷 却 后 4℃存放，存放过程中透析袋应完全放入水中。 G使 用 前 用蒸馏水清洗透析袋内外，操作时用镊子或戴手套。 (2 )操作

A取 一 1 000mL烧杯，加去离子水，放入一枚磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上中速搅拌: B将 盐 析 得到的酶液装入透析袋中，袋两端用棉线扎紧封好;

C将 透 析 袋悬挂放入烧杯，浸没于去离子水中，注意不要碰到搅拌子。 D每 隔 两 小时换一次水，直到氯化钡溶液滴入烧杯中不形成白色浑浊。 2.2.7.3凝胶过滤操作方法

(1) 根据 S ephadexG- 100溶胀系数为15mL/g-2 0mL/g干凝胶，柱体积为20cm3,称取lg Sephadex G-100凝胶干粉。

(2) 在 室 温下，500mL的0.lm ol/L柠檬酸一Na,HPO。缓冲液(pH7.0) 中，溶涨48小时;然后缓缓将缓冲液用吸管吸出后重新加入相同缓冲液。

(3) 将 浓 胶状的凝胶缓慢倾入柱中，直到凝胶沉集稳定，凝胶柱不能有气泡产生，否

则必须重装柱。

(4) 用 2 -3倍床体积的缓冲液过柱。

(5) 用 0 .1% 的澳酚蓝溶液过柱，色带均匀下降。如色带没有呈均匀下降，则需要重新装柱直至达到要求。

(6) 用 吸 管缓缓将样品滴加到凝胶表面，吸管不能碰到柱壁，样品体积1mLe (7 )以 20mL/h速度洗脱分离，直至洗脱体积为1倍柱体积时停止洗脱。 (8) 每 管 收集1mL.2 80nm下检测光密度值，测定各收集管酶活性。 (9) 洗 脱 完毕后用2倍柱体积去离子水过柱，即可重新再使用。

(10 ) 较 长时间不使用凝胶柱，为防止发霉或生长细菌，用1倍柱体积0.002%的NaN,过柱后保存。

2.2.7.4 透析浓缩方法 (1) 透析袋的准备同脱盐操作;

(2) 将每次在酶活峰值处的收集液合并装入透析袋中，棉线封口; (3 )将透析袋埋入聚乙二醇一10000中浓缩为5mL的酶液。

2,2.8聚丙烯酞胺凝胶电泳

2.2.8.1 SDS-PAGE聚丙烯酞胺凝胶电泳 (1)电泳准备:

将电泳槽擦洗干净，将存放聚丙烯酞胺凝胶的槽清洗、擦拭干净。用2%琼脂将电泳槽三个侧面封好。 (2)分离胶的制备:

选用 10 %的分离胶胶浓度，配制体积为IOmL分离胶。 A在 2 0m L试管中首先加入4.Om L双蒸水; B加 入 3 0%丙烯酞胺贮液3.3m L;

C加 入 1 .5mo1/LT ris-HC1缓冲液(PH8.8 )2 .5m L; D加 入 1 0%SDS(十二烷基苯磺酸钠)0.1m L; E加 入 1 0%过硫酸按0.1M L ;

F加 入 T EMED( N,N ,N ',N ’一四甲基乙二胺)0.00 4mL，然后将试管轻微震荡2s-3s;

G将 配 制 好分离胶小心的注入电泳槽中并用水进行液封以隔绝氧气; H置 室 温 30分钟以上即可聚合，再等待30分钟即可配置浓缩胶。

在操作丙烯酞胺和过硫酸钱及TEMED时须非常小心在通风橱中，且要戴好口罩、手套。 (3)浓缩胶的制备:

A将己制备好的分离胶上的液封用水小心倒出，然后用去离子水清洗几遍，倒出后用滤纸条吸干余水。

B配 制 5 %浓缩胶2mL:

a在 2 0m L试 管 中首先加入1.4m L双蒸水; b加 入 3 0% 丙 烯酞胺贮液0.3 1mL;

c加 入 1 .O mo 1/LT ris-HCI缓冲液(pH6.8) 0 .25 mL; d加 入 1 0% SDS (十二烷基磺酸钠)0.02 mL; e加 入 1 0% 过 硫酸钱0.02 mL;