Rasfonin抑制骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移

JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY! HEALTH SCIENCES) V〇1.51 No. 2 Apr. 2019

•论著.

北京大学学报（医学版）

Rasfonin抑制骨肉瘤细胞143B的增殖和迀移

张帆!’2,燕太强1!，郭卫1

(1.北京大学人民医院骨肿瘤科，北京100044 # 2.郑州大学附属肿瘤医院骨软组织科，郑州450008)

[摘要]目的：研究真菌次级代谢产物msfonin对骨肉瘤143B细胞增殖与迁移能力的影响。方法！以骨肉瘤细胞

系143B为模型，利用3-(4,5-二甲基）-5-(3-羧甲基苯环）-2-(4-硫基苯）-2H-四唑盐复合物检测法[3-(4,5-dim-

thylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt，MTS]观察 rasfonin 对细胞

活性的影响，以二甲基亚砜（dimethyl =lfoxide，DMSO)组为对照，采用ra=onin (3 \"mol/L和6 \"mol/L)处理12或

24h，观察143B细胞活性的变化;采用克隆形成实验检测mSonrn对细胞集落形成能力的影响，以DMSO组为对照，

采用mSonrn (3 \"m〇l/L)处理1周，对比两组克隆形成数目。划痕实验及侵袭实验检测mSonrn对细胞侵袭迁移能 力的影响，以DMSO组为对照，采用m=〇nin (3 \"m〇l/L)处理24 h，对比两组的伤痕愈合率及侵袭细胞数。以DMSO 组为对照，透射电子显微镜观察m=〇mn(3 \"m〇l/L)处理4 h后细胞内自噬体含量的变化。蛋白免疫印迹的方法检 测 rasfonin 对 p62 蛋白（sequestosome 1 )&微管相关蛋白 1 轻链 3 融合蛋白（microtubule associated protein 1 light chain

3 fusion protein，LC3)及聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly (ADP-ribo=) polymeras-1，PARP-1]表达的影响。结果：

在12和24 h，随着Dfonm浓度的升高，骨肉瘤143B细胞的细胞活性均逐渐降低，3组间差异有统计学意义（12 h:

6 = 31.36, ！ <0.01; 24 h: 6=67.07, ！ <0.01)，任意两组间比较差异也均有统计学意义（！<0.01)。3 \"m〇l/L

的Dfonin可以显著抑制143B细胞的集落形成能力（！<0.01)。Rasonin处理后，143B细胞在24 h内的伤痕愈合 比率明显低于DMSO对照组（33.91% ±0.83% $ 65.11% ±0.94%，！<0. 01);同样24 h内穿过覆盖有Matrigel 的基底膜的细胞数明显低于DMSO对照组[(21.33±1.45)个$(49.33 ±2.40)个，！<0.01]。Ra=Onm处理4h 后骨肉瘤143B细胞中自噬体增多，p62水平降低，LC3-II累积，自噬抑制剂氯喹存在条件下LC3-II累积更为明显， 并且随着Dfonin浓度的提高PARP-1的切割增多。结论^asonin既可以抑制骨肉瘤143B细胞的增殖迁移，还可 以引起细胞的自噬与凋亡，这些结果为msomn作为骨肉瘤新的治疗药物提供了初步的实验基础。

[关键词]骨肉瘤;增殖;迁移；自噬[中图分类号]R738.1

[文献标志码]A

[文章编号]1671-167X(2019)02-0234-05

doi：10.19723/j. issn. 1671-167X. 2019.02.006

Ras fonin inhilbits proliferation and migration of o s t eos a rcoma 143 B cell s

ZHANGFan1’2，YAN Tai-qiang1A，GUOWei1(1. Musculoskeletal Tumor Center，Peking University People( s Hospital，Beijing 100044，China; 2. Department of Bone and Soft Tissue，Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450008，China)ABSTRACT Objective : T investigate the effects of rasfonin，a fungal secondary metabolite，on the pro­

liferation and migration of osteosarcoma 143B ceHs. Methods:3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-car- boxymethoxyphenyl)-2-(4-sul:fophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt (MTS) asay was performed to exa­mine 143B ceH viability following treatment of rasfonin. Using dimethyl sulfoxide ( DMSO) group as con­trol， cell viability was detected when 143 B cells were treated with rasfonin (3 \"mol/for 12 or 24 hours. The effect of rasfonin on colony forming ability was detected by clone format143Bcells treated with DMSO or rasfonin (3 \"mol/L) for one week，and the numbethe two groups was counted. Wound healing and transwell assay were employed to analyze cell invasionand migration upon rasfonin challenge. The DMSO group was used as control while rasfonwas used for 24 hours. The wound healing rate and the number of invasive cells were compared betweenthe two groups. The intracellular autophagosomes were monitored by transmission electron microscopy when 143 Bcells were treated with DMSO or rasfonin (3 \"molL) for 4 hours. The expression of p62， microtubule-associated protein 1 light chain 3 fusion protein ( LC3 ) and poly ( ADP-ribose) polymerase- 1(PARP-1) in responss to rasfonin were detected by immunoblotting assay. Results: Rasfonin reducedthe viability of 143 Bcells in a dose-dependent manner (12 h: 6 = 31.36，！<0.01; 24 h: 6 = 67.07， ! <0.01). Rasfonin (3 \"mo/L) completely inhibited the clonal formation of 14The wound healing result revealed that rasfonin significantly decreased migratory ability of 143 B cells

基金项目：国家自然科学基金（81272381) Supported by the National Natural Science Foundation of China(81272381)

A Corresponding author’s e-mail，yantqzh@163.com

网络出版时间 #2018-12-17 13:20:02 网络出版地址：http://kns. cnki. neakCms/deai1/11• 4691 R. 20181213. 1612.005.html

张帆，等

Rasfonin抑制骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移• 235 -

(33.91% ±0.83% $ 65. 11% ±0.94%，！ <0.01 )，whereas its treatment significantly reduced the number of 143 B cells penetrating through Matrigel-containing basement membrane (21.33±1.45$. 49.33 ±2.40，！<0.01) . Compared with the control group，rasfonin markedly increased the number of autophagic vacuoles. The immunoblotting results revealed that rasfonin increased LC3-H accumulation and decreased p62 levels. Choloroquine ( CQ)，an often used autophagic inhibitor，furtlier accumulated rasfonin-induced LC3 - H • In addition，rasfonin appeared to cause the cleavage of PARP-^. Conclusion ； Rasfonin induced autophagy and activated caspase-dependent apoptosis in 143 B cells concurring with suppressing the proliferation and migration of the cells; these results provide an experimental basis for rasfonin as a potential therapeutic agent for osteosarcoma.KEY WORDS Osteosarcoma; Proliferation ； Migration ； Autophagy

骨肉瘤是起源于间叶组织，以肿瘤细胞直接产 light chain 3 fusion protein， LC3 )抗体（L7543，

生骨或骨样组织为特点的恶性肿瘤，是临床最常见 的一种原发性恶性骨肿瘤，70%以上发生于儿童及 青少年，恶性程度高，易发生转移，预后极差[1]。目 前的治疗方法主要是术前化疗、手术、术后化疗相结 合。为了进一步提高诊疗效果，研究者们正积极开 发新的靶向治疗药物[2]。Rasfonin是由日本千叶大 学和东京大学科学家从真菌的固体发酵提取物中分 离出来的新的化合物，可以显著抑制依赖的小 鼠B细胞系Ba/F3-V12细胞的生存[3];而近年来研 究发现，rasfonin在体内外对胰腺癌细胞Panc-1均 有抑制作用[4]，还可以在肾癌细胞中通过诱导自嗟 与凋亡发挥抗肿瘤细胞的活性[5]。

细胞凋亡、自嗟、程序性坏死是程序性细胞死亡 的3种主要方式[6]。细胞凋亡是程序性细胞死亡的 主要形式，诱导细胞凋亡的途径主要为死亡受体途 径和线粒体途径。细胞自嗟是对细胞内损坏或衰老 的蛋白质或细胞器进行降解并回收再利用的过 程[7]。细胞自嗟有助于维持细胞在恶劣环境中的 生存，但过度的自嗟使细胞内关键蛋白和细胞器消 耗过度而导致死亡[8]。程序性坏死则是以细胞器 的肿胀、胞膜的破坏为特点。尽管三者经历不同的 生理过程，但三者间关系十分密切，在恶劣环境下细 胞中还可以出现多种死亡方式共存[9]。

目前rasfonin在骨肉瘤中的作用还未见报道， 本研究旨在明确rasfonin对骨肉瘤细胞143B的增 殖和迁移是否存在抑制作用，并探讨raSfonin对骨 肉瘤细胞凋亡及自嗟的影响，希望为rasfonin用于 骨肉瘤的治疗提供初步的实验依据。1

材料与方法

1.1药品和抗体

RaSf〇nin由中国人民军事医学科学院毒 物药物研究所车永胜研究员提供。氯喹（ChlOTo-

quine diphosphate salt，CQ，C6628)和微管相关蛋白

1 轻链 3 融合蛋白（microtubule associated protein 1

1 : 1 000 )购自美国 Sigma Aldrch 公司，p62 ( seques-

tosome1)抗体（sc-28359，1 : 1 000)购自美国 Santa Cruz公司，聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly(ADP- ribose) polymerase-1，PARP-1]抗体（9542，1 : 1 000)

购自美国 Cell Signaling Technology 公司，Actin 抗体 (TA-09, 1 : 2 000)购自北京中杉金桥公司。1.2试剂耗材

DMEM培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公

司，Transwell侵袭小室购自美国Coming公司，聚偏 二氟乙烯膜（polyvinylidene Ouoede，PVDF)膜及发 光液购自美国Millipoe公司。1.3细胞培养

骨肉瘤143B细胞采用DMEM培养基[含10% (质量分数）胎牛血清和1% (质量分数）青链霉素 双抗]，于37 °C、5% C〇2 (体积分数）细胞培养箱中 进行培养。当细胞密度达到80%左右时，用胰酶消 化贴壁细胞，离心后使用新鲜培养基重悬，将细胞分

到六孔板内，待细胞生长至60% ~ 70%密度，进行 加药处理。

1.4 MTS检测细胞存活率

取对数生长期细胞，每孔5 000 ~ 10 000个细胞 均匀接种于96孔板中，体积为100 \"L，培养过夜后 更换不含酚红的DMEM(含10%胎牛血清）培养基。 每组设置3个复孔，以二甲基亚砜（dimethyl sulfo­

xide， DMSO) 为对照，加人指定浓度的 msfonin，继续

培养指定的时间。而后每孔加入3-(4,5-二甲基）- 5-(3-羧甲基苯环）-2-(4-硫基苯）-2H-四唑盐复合物 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-comoxymethoxy-

phenyl ) -2-( 4-sulfophenyl ) -2H-tetrazoli um， inner salt，MTS ]和吩辕硫酸甲醋（phenazine mehosulfate， PMS)(20 : 1)混合溶液20 \"L，使用酶标仪（波长

492 nm)测定各孔光密度值。1.5克隆形成实验

将143B细胞按照1 000个/盘接种到6 cm培 养皿中，加入3 \"mol/L的rasfonin处理，每组重复3

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定量的细胞裂解液，进行总蛋白的提取。将等量样

品经8F或13. 5F的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel

electrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白，而后将胶内蛋

北京大学学报（医学版）

次。37 °C、5FCO#细胞培养箱中培养1周。弃培养 基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS )洗 1次，加人2 mL吉姆萨染液，室温过夜孵育。去除 染液，清水洗1次，室温干燥后拍照。

1.划痕实验

将143B细胞接种到6孔板中，当细胞密度达到 80F左右时用200 \"L头划一条直线。PBS洗去 脱落细胞，加入新鲜培养基与3 \"mol/L的rasfonin， 于0、24h分别拍照。1.7

侵袭实验

将143B细胞消化后重悬在不含血清的DMEM 培养基中，以1 x 105个/200 \"L的量接种于覆盖有 基质胶的Transwell小室的上室中，以DMSO为对 照，加入3 \"nol/L的rasfonin，下室中加入含10F胎 牛血清的DMEM培养基600 \"L。37 C培养24 h后 取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，然后使用甲醇 固定20 min，结晶紫染色20 min，显微镜下拍照并计 数。

1.透射电镜观察

将143B细胞接种于10 cm培养皿中，待细胞密 度达到70F左右。换新鲜培养基，按3 \"m〇l/L的 浓度加入rasfonin或DMSO处理4 h。然后胰酶消化 细胞，4 C、1 000 x

f

白质电转至PVDF膜上。将PVDF膜用5F脱脂奶 粉室温封闭1 h，一抗4 C孵育过夜，三羟甲基氨基 甲烷缓冲盐水（triethanolamine buffered saline solu­

tion tween，TBST) 洗膜后用相应二抗室温孵育 1 h，

经适当漂洗后，化学发光试剂盒显色。1.10统计学分析

实验数据以均数±标准差的方式表示，均数间

的比较采用£检验，MTS实验结果以单因素方 差分析和 Student-Newman-Keuls (S-N-K)法两两比 较分析，！<0.05认为差异有统计学意义。2 结果

2 1 Rasfonin抑制骨肉瘤143B细胞的增殖

以DMSO为对照，采用不同浓度的rasfonin (3、6 \"mol/L)处理 143B 细胞 12h 或 24h。MTS 结 果显示，随着msfonin浓度的升高，骨肉瘤143B细 胞的细胞活性均逐渐降低，3组间差异有统计学意 义（图 1A，12 h: 6=31.36, ！<0. 01# 24 h: 6 = 67. 07，！ < 0. 01 )，之后使用SNK法两两比较发现， 任意两组间比较差异也均有统计学意义。克隆形成 实验显示，3 \"mol/L的rasfonin可以显著抑制143B 细胞的集落形成能力（图1B)。

离心5 min，冷的PBS洗两遍。

加入1.5F的戊二醛溶液，4 C固定过夜后送检。1. 免疫印迹实验(Western blot)

细胞经药物处理后，用冷PBS洗1遍，加入一

□ DMSO

I I Rasfonin(3 (Jimol/L) Rasfonin(6 (Jimol/L)

%o

>

oI4003M2

8 6

DMSO Rasfonin

12h

Group

24h

A，143Bcel1s were treated with rasfonin !3 \"mol/L and 6 \"mol/L) for to 24 h，cellviabilitywasanalyzedby3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-

carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny1)-2H-tetrazolium，inner salt ( W )assay ;B，colony growth assays were performed in 143B cells with rasfonin!3 \"mol/L) <0. 01，$ DMSOgroup. DMSO，dimethyl sulfoxide.

图1 Rasfonin抑制 肉瘤143B细胞的增殖 Figure 1 Rasfonin inhi.cell viability of 143 B cells

2.2 Rasfonin抑制骨肉瘤143B细胞的侵袭迁移

划痕实验表明，在3 \"mol/L的rasfonin存在条 件下，143 B细胞的迁移愈合能力明显减弱，rasfonin 处理组的伤痕愈合比率（33.91F ±0.83F)明显低 于 DMSO 组（65.11F ±0.94F，！<0.01，图 2A)%

同样，Transwell 结果显示，3 \"mol/L 的 rasfonin 使 143B细胞的侵袭能力也明显减弱，rasfonin处理组 有（21.33±1.45)个细胞穿过覆盖有Matrigel的基 底膜，明显低于DMSO组的（49. 33 ± 2. 40)个（！ < 0.01，图2已）。

张帆，等抑制骨肉瘤细胞

143B的增殖和迁移

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DMSO Rasfonin

0SMISV

/-

(图3A) % LC3是自噬的标志蛋白，当自噬发生时，

LC3- I脂化形成LC3- %，而；62是自噬的特异性底

物，在自噬体内被降解；而氯喹是自噬晚期的抑制

剂，可以抑制LC3- %的降解。Rasfonin使143B细胞 中p62蛋白表达减少，LC3-II的量明显增多（图 3B)，而且在氯喹存在的情况下rasfonin引起的

LC3 - %继续增多（图3 C $，这说明rasfonin可以引起

A and B，wound healing assay and transwell assay were performed

+143B cells in the present of DMSO or rasfonin (3 \"mol/L) ; B，stained with crystal violet，X 100. DMSO，dimethyl sulfoxide.

图2 Rasfonin抑制骨肉瘤143 B细胞的侵袭迁移

Figure 2 Rasfonin inhibits migratory and invasive abilities of 143B cells

2.3 Rasfonin诱导143B细胞的自噬与凋亡

透射电镜观察发现3 \"mol/L的rasfonin处理 143 B细胞4 h后，细胞中自噬体的数量明显增多

143B细胞的自噬。PARP-1是一种脱氧核糖核酸

(deoxyribonucleic acid，DNA)修复酶，也是细胞凋亡

核心成员半胱天冬酶-3 ( caspase-3 $的切割底物，

PARP-1的切割可以作为capae-3依赖的细胞凋亡

的标志。采用msfonin处理143B细胞，PARP-1的 切割随着msfonin浓度的升高而增强（图3D)，说明

rasfonin可以诱导143B细胞的凋亡。

A，electron microscopy was performed in 143Bcells after exposed to rasfonin (3 \"mol/L) for 4 h，X 9 900; B and C，following treatment of rasfonin(B: 3 \"mol/L and 6 \"mol/L，C :3 \"mol/L) for 4 h with or without Choloroquine ( CQ)，143B cells were lysed and analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies. Actin was used as a loading control; D，expression of poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1 ) was analyzed by immunoblot- ting after treated by rasfoninfor4 h%Vctin was used as a loading control. DMSO，dimetliyl sulfoxide； CQ，choloroquine；Ltein 1 light chain 3 fusion protein； PARP，poly (ADP-ribose) polymerase.

图3 Rasfonin增强143B细胞的自噬与凋亡

Figure 3 Rasfonin increases autophagy and apoptosis of 143 B cells

3

讨论

新辅助化疗出现以来，骨肉瘤患者的D年生存 率已由原来的20F提高到70F，且与过去的截肢手 术相比，患者大多可以进行保肢手术，提高了患者术 后的生活质量[10]。然而，对于化疗耐药或者发生肺 转移的患者，治疗效果依然没有取得很大的进展，预 后依然较差，死亡率较高，因此开发新的对骨肉瘤的 生长与转移具有抑制作用的治疗药物对骨肉瘤患者 具有重要意义。

真菌次级代谢产物rafonin是一种具有肿瘤抑 制活性的化合物，研究表明，msfonin对胰腺癌细胞

Panc-1的增殖、迁移均具有抑制作用，并且使丝裂原

MAPK)通路的活性显著降低，说明rafonin有可能

通过该通路发挥抗肿瘤作用[4]。在肾癌细胞ACHN 中，rsfonin可以抑制细胞活性并诱导其凋亡，对信 号通路检测发现，rasfonin导致了蛋白激酶B ( pro­

tein kinase B，AKT) 活性的升高及哺乳动物雷帕霉

素祀蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR )下 游核糖体蛋白 S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase

beta-1，S6K1)和真核翻译起始因子-E结合蛋白1

(eukarotic translation initiation factor 4E binding pro­

tein 1，4E-BP1)活性的降低[D]，还使活性氧簇（reac­tive oxygen species ， ROS) /c-Jun 氣基末端激酶（c- Jun N-terminal kinase，JNK)通路的活性升高[11]，表

明rasfonin可能通过多种不同的信号通路发挥抗肿 瘤作用，这些结果均表明rasfonin具有临床治疗恶

活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，

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JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY! HEALTH SCIENCES) Vol.51 No. 2 Apr. 2019

北京大学学报（医学版）

[4 ] Xiao Z，Li L，Li Y，et al. Rasfoni

induces ras-mutated Panc-1 pancreatic tumor cell death in nude mice[J]. Cell Death Dis，2014，5(5): e1241.

果，它不仅可以降低143B细胞的活性及克隆形成

[5 ] Lu Q， Yan S， Sun H， et al. Akt inhibition )tenuates rasfonin-

能力，还减弱了细胞的迁移与侵袭能力，并且诱导了 induced autophagy and apoptosis through the glycolytic pathway in caspase依赖的细胞凋亡，下一步可进行体内实验进 renal cancer cells[ J]. Cell Deatli Dis，2015，6(12) ： e2005.

[6 ] Ouyang L，Shi Z，Zhao S，et al. Programmed cell death pathways 一步验证rasfonin对骨肉瘤的作用。

in cancer： a review of apoptosis，autophagy and programmed nec-

过度的自嗟可以导致细胞的死亡，自嗟是不同

rosis[ J]. Cell Prolif，2012, 45(6) ： 487 -498.

于细胞凋亡的第二类程序性细胞死亡，12-。通过药 [7 ] Hale AN，Ledbetter DJ，Gawriluk TR，et 物诱导自嗟性死亡对肿瘤的治疗具有积极作用，如 tion and role in development [ J ]. Autophagy， 2013，9(7)： 替莫哩胺! temozolomide)、姜黄素！ curcumin)均可以 951 -972.

性肿瘤的潜在价值。与这些研究相一致的是，本研 究发现rasfonin对骨肉瘤细胞也具有显著的抑制效

诱导恶性胶质瘤细胞的自嗟性死亡[13 _14];舒尼替尼

(snitinib)诱导的肾癌细胞的自嗟增强了其对肾癌

细胞的杀伤作用[!5]。在肾癌细胞中，Dfonin可以

诱导细胞的自嗟，抑制其自嗟可以挽救rasfonin引 起的细胞活性降低与凋亡，这表明自嗟可能是rarfo- nin引起细胞死亡的方式之一[5]。本研究表明，ras­

fonin 也可以诱导骨肉瘤细胞的自嗟， 自嗟在 rasfo­

nin 的抗瘤效果中可能也起到重要作用 ，这其中的具

体机制有待进一步阐明。综上所述，本实验证明了 rasfonin在体外对骨 肉瘤细胞143B的抑制作用，rasfonin有望成为一种 临床治疗骨肉瘤的新药物。

(志谢:感谢中国人民军事医学科学院毒物药物

研究所车永胜研究员对rasfonin的提供）

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(本文编辑:刘淑萍）