河南农业科学，２０１７，４６（１１）：９３．９７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｏｉ：１０．１５９３３／ｊ．ｃｎｋｉ．１００４—３２６８．２０１７．１ １．０１６ 应用ＤＰＯ技术检测番茄斑萎病毒方法的建立 刘忠梅 ，罗 佳。，潘仲乐 ，刘洪义 ，李丹丹 ，韩政坤 ，魏冬旭 ，马 微 （１．黑龙江出人境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江哈尔滨１５０００１；２．辽宁出人境检验检疫局， 辽宁大连１１６００１；３．海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南海口５７０１２５； ４．东宁出入境检验检疫局，黑龙江东宁１５７２９９） 摘要：为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒（ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ，ＴｓｗＶ），利用双启动寡核苷酸 引物（ＤＰＯ）技术，以ＴｓＷＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因为靶基因，设计了一对ＤＰＯ引物，对ＰＣＲ反应体系 中的引物、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶用量进行优化，建立了ＴＳｗＶ的ＤＰＯ—ＰＣＲ检测方法，并对其灵 敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明，应用ＤＰＯ引物建立的ＰＣＲ技术能够成 功地扩增出ＴｓｗＶ的２０８ ｂｐ特异性条带，与预期目标相符。经过优化后，ＤＰＯ—ＰＣＲ反应体系 （２５ Ｌ）为：ＤＮＡ模板１ Ｌ，１０ Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ“）２．５ Ｌ，ｄＮＴＰｓ（每种２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．Ｏ Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ Ｕ／ Ｌ）Ｏ．２ Ｌ，上、下游ＤＰＯ引物（２０ ｔｘｍｏｌ／Ｌ）各１．０ ｐ．Ｌ，以去离子水补充至 ２５ Ｌ。利用该检测方法，在４９．８～７０．０℃的退火温度范围内，均可实现目标基因片段的高效扩 增，说明其对退火温度不敏感；利用病毒ＲＮＡ进行检测，该方法的灵敏度为７．５ ｎｇ；通过对ＴｓｗＶ、 番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明，仅ＴｓｗＶ呈现阳性反应，说明该方法特 异性强。所建立的ＤＰＯ—ＰＣＲ检测方法能够准确、高效地检测ＴＳｗｖ，可用于进出境种苗检疫筛查 及田间病害诊断。 ＤＰＯ—ＰＣＲ：检测 关键词：番茄斑萎病毒；双启动寡核苷酸引物； 中图分类号：￥４３２．４ １ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４—３２６８（２０１７）１１—００９３—０５ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＤＰＯ—ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｏｍａｔｏ Ｓｐｏｔｔｅｄ Ｗｉｌｔ Ｖｉｒｕｓ ＬＩＵ Ｚｈｏｎｇｍｅｉ ，ＬＵＯ Ｊｉａ ，ＰＡＮ Ｚｈｏｎｇｌｅ ，ＬＩＵ Ｈｏｎｇｙｉ ，ＬＩ Ｄａｎｄａｎ ， ＨＡＮ Ｚｈｅｎｇｋｕｎ ，ＷＥＩ Ｄｏｎｇｘｕ ，ＭＡ Ｗｅｉ （１．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｅｎｔｒｙ—ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｅｎｔｙ—ｒｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｄａｌｉａｎ １ １６００１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｈａｉｎａｎ Ｅｎｔｒｙ・ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｈａｉｋｏｕ ５７０１２５，Ｃｈｉｎａ；４．Ｄｏｎｇｎｉｎｇ Ｅｎｔｙ—ｅｘｉｔｒ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｄｏｎｇｎｉｎｇ １５７２９９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ａｎｄ ｅｆｉｃｉｆｅｎｔｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ（ＴＳＷＶ），ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｄｕａｌ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ）ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＴＳＷＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＰ）ｇｅｎｅ ｂｙ ＤＰＯ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ， ｄＮＴＰｓ ａｎｄ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ａ ＤＰＯ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＴＳＷＶ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｉｔｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ。 ｓｐｅｃｉｉｃｉｆｔｙ ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ２０８ ｂｐ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＤＰＯ—ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＤＰＯ・ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ （２５ ｔｚＬ）ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ＤＮＡ １ ｔｘＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ“Ｐｌｕｓ）２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒ ｅａｃｈ） ２．０ ＩｘＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／ｐ￣Ｌ）０．２ ｐ．Ｌ，ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ（２０￣ｍｏｌ／Ｌ）１．０ Ｌ，ｗｉｔｈ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ｔｏ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＤＰＯ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｎｅａ一 收稿日期：２０１７—０５—１３ 基金项目：哈尔滨市科技创新人才研究专项（２０１２ＲＦＱＱＮ０２９）；国家质检总局科技计划项目（２０１３ＩＫ０５１） 作者简介：刘忠梅（１９７６一），女，山东莱州人，高级农艺师，博士，主要从事植物检疫工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｚｈｍｅｉ＠１６３．ｅｏｍ ９４ ｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｎｇｅ ｆｒｏｍ ４９．８℃河南农业科学 第４６卷 ｔｏ ７０．０℃．ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ７．５ ｎｇ ｗｈｅｎ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ． ＴＳＷＶ．ｔｏｍａｔｏ ｒｉｎｇｓｏｐｔ ｖｉｒｕｓ，ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｏｍａｔｏ ｂｌａｃｋ ｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｗｅｒｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅ— ｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ．ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｐｐｅａｒｅｄ ｏｎｌｙ ｆｏｒ ＴＳＷＶ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ＴＳＷＶ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ．ａｎｄ ｔｈｕｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｅｘｉｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ；ｄｕａｌ—ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＤＰＯ—ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 番茄斑萎病是１９１５年在澳洲番茄上首次发现 Ｋｏｍｍｅｄａｌ等¨ 在人类临床标本细菌１６Ｓ ｒＲＮＡ研 究中，通过试验证实ＤＰＯ的设计可以防止ＤＮＡ的 交叉反应所产生的假阳性和假阴性。刘梅等 将 该技术应用于马铃薯病毒的检测，表明其特异性强 和敏感度高。徐义刚等 将该技术应用于食源性 致病菌大肠杆菌０１５７：Ｈ７的检测，可以有效阻断非 特异性扩增从而避免了假阳性的检测结果，显示出 其特异性强。本研究拟采用ＤＰＯ技术，建立特异性 检测ＴｓｗＶ的ＤＰＯ—ＰＣＲ方法，为进出境种苗检疫 的，其病原于１９３０年被命名为番茄斑萎病毒（ｔｏｍａ— ｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ，ＴｓｗＶ） 。该病毒为世界性分 布，特别是热带、温带和亚热带地区比较常见 。 其寄主范围广，可侵染８０科１ ０００多种植物，其中 包括番茄、烤烟、辣椒、花生等作物，也包括非洲紫罗 兰、万寿菊等多种观赏植物 。ＴｓｗＶ在全世界范 围内都导致了重大的农业经济损失 。据报道，该 病毒曾造成澳大利亚花生产量损失高达９０％，印度 花生产量损失达８０％ ；也曾造成夏威夷生菜和番 茄产量亏损５０％～９０％ ；而在法国和西班牙等欧 筛查及田间病害诊断提供良好的检测手段。 洲地区，随着传播介体蓟马的定殖与扩散，该病毒能 够对番茄、辣椒等造成毁灭性危害，损失最高可达 １００％ 。因此，ＴｓｗＶ被列为世界危害最大的ｌ０ 种植物病毒之一 。ＴＳｗＶ可以通过汁液接种、种 子传染，蓟马也能传播。感病种苗的贸易是该病毒 远距离传播的方式之一。ＴＳｗＶ是《中华人民共和 国进境植物检疫性有害生物名录》中列明的有害生 １ 材料和方法 １．１ 材料 ＴＳｗＶ、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑 环病毒的阳性材料均由中国检验检疫科学研究院 提供。 Ｍ—ＭＬＶ反转录酶为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，ＲＮａ— ｓｉｎ、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶和１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ 物，也是欧洲及地中海植物保护组织（ＥＰＰＯ）检疫 性有害生物。建立该病毒快速、精准的检测方法，能 有效地阻止外来种苗携带的病毒入侵，保护我国的 农业生产。 （Ｄｙｅ Ｐｌｕｓ）为大连宝生物（ＴａＫａＲａ）公司产品，核酸 提取试剂为Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ。 １．２引物设计与合成 根据ＴｓｗＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的保守序列，设 计了普通引物以及ＤＰＯ引物（表１），均由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成。 双启动寡核苷酸引物（ＤＰＯ）技术２００７年由韩 国的Ｓｅｅｇｅｎｅ公司首次研制成功¨ ，应用于感染性 疾病诊断，极大地提高了ＰＣＲ的敏感性和特异性。 表１引物序列及产物大小 １．３ 总ＲＮＡ提取 ＤＥＰＣ水，７０℃保温５ ｍｉｎ，冰上放置２ ｍｉｎ；再加入 ４ Ｌ ５ Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ、２ ＩｘＬ ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．５ Ｌ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１ ８（１００ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ）、１ ｔｘＬ Ｒａｎｄｏｍ ６ ｍｅｒ（１００ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ）、０．５ Ｌ ＲＮａｓｉｎ（４０ ｕ／ Ｌ）、１ Ｌ Ｍ—ＭＬＶ 称取１００ ｍｇ ＴＳｗＶ阳性材料，用Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ提取总ＲＮＡ，用ＮＤ一１０００超微量分 光光度计测定其浓度。 １．４反转录 （２００ Ｕ／ｐ￣Ｌ），４２℃保温１ ｈ。９５℃灭活５ ｍｉｎ，放置 冰上待用。 反转录体系２０ Ｌ：先加入２ Ｌ总ＲＮＡ、９ ＩｘＬ 第１ Ｉ期 １．５ ＤＰＯ—ＰＣＲ反应 刘忠梅等：应用…’Ｏ技术检测番茄斑萎病毒方法的建立 ｒｌ：刈 照，分析Ｄｔ’Ｏ一 Ｉ｛的特异ｌｆ牛 １）１ （）一ＰＣＲ反』、 体系２５ １ ：ｄＮＴＰｓ（ 和｛Ｊ ２．５ ｌｎｍｏｌ／１ ）川ｆ 范 为０．０１～５．０ １．ｃ１ ，７ Ｉ）ＮＡ聚 腑 ２ 结果与分析 ２．１ ＴＳｗＶ ＤＰＯ—ＰＣＲ检测方法的建立 ｆ… （）引物没汁力‘法，以 ＦＳＷＶ ＣＰ 、（５ ＩＪ／ Ｉ ）』ＩＪ量范Ｉ矧为０．㈤Ｉ～０．５ １ ，１）ＰＯ弓【物（Ｉ 、 下游引物 ２０￣ｍｏｌ／１ ）川一ｉｌ … ０．０５～２．０ Ｉ ． 的 １０ ｘ Ｂｕｆｔｋ Ｉ’（含Ｍｇ ）２．５ １ ，仪板ｌ Ｌ，以ｔｌ‘ＩＨ，Ｏ 补充 ２５ Ｉ 反应条件：９４ ５ ＩＹｌｉｌ］；９４ ３０ 、 １：序列为靶序列，没汁ｒ・埘ｉ）ＰＯ ｆｊｌ物， Ｊ 心 体系优化，建Ｏｆ＿ＴＳＷＶ的…，（）一ＰＣＲ检测厅法 从 １ ｔｌ可以看｝ｆＩ＇随符ｄＮ Ｉ、ｒｓ打¨人造的增ＪＪ【】，扩增刊 ６０ ｑ【：４５ 、７２ ｃ（：４５ Ｓ，３５个衙环；７２ ：ｌ０ ｌｌｌｉｌｌ。反心 结 后，取５ Ｉ＿扩增产物进行１．２％琼脂糖凝胶电 泳检洲，Ｊｉ ｉ 录结果 、 １．６ ＤＰＯ—ＰＣＲ退火温度敏感性试验 将… Ｏ—ＰＣＲ退火湍度范『川 为４９．８～７０．０ ｏＣ， 川ＤＰＯ ｆ Ｊｌ物进行扩增 验，以｝ ＰＣＲ引物作为 的『１的条带逐渐变庇， Ｌ｛ＪＪＩ１入龄为２．０ Ｉ．Ｈ、ｆ达划ｆＥｉ４ ｉ 庇，之后不阿随ＪＪ【Ｉ入址的增ＪＪＪＩ而增强．．从 ｌ ｈ Ｉ叮以 …，Ｔａｑ Ｉ）ＮＡ聚合 』Ｊｌ１人 与ＰＣＲ扩增效 簪‘ｌ ｉｔ 十¨父，当』Ｊ『ｊ入 为０．２ ｔｘ１ ＩＩ，Ｊ‘ 以有效地扩增ｙ：ｌｊｌ Ｉ ｆ，Ｊ； 条带 从 ｈ・ｒ・Ｊ‘以 ‘…，随首引物 的减少，扩增 参照， 琼脂 凝胶电泳检测扩增效果 １．７ ＤＰＯ—ＰＣＲ灵敏度试验 ｎ勺ｆ Ｉ标条带总休ｆ：越来越 ， ＪＪＩ１人 为Ｉ．０ Ｉ 时 扩增效果最佳 此， Ｉ１ＳＷＶ Ｉ）ＰＯ—ＰＣＩＩ测 ‘法 ， 分ＪｊＵ．【ｌ ＴＳＷＶ佯品总ＲＮ Ａ ５、２．５、ｌ、０．５、０．２５、 一｝ｔ 优化的反』、 休系（２５ Ｉ ）为：１）ＮＡ卡Ｉｌ板１ ０．１、０．０５、０．０２５ Ｌ作为反转求十Ｉｌ板，进 ＲＴ— ＰＣＲ，埘１）１，０一ＰＣＲ的灵敏 进ｉ 测定 １．８ ＤＰＯ—ＰＣＲ特异性试验 １０ ｘ Ｂｕｆｆｍ’（含Ｍｇ ）２．５ Ｌ，【１Ｎ＿ｒＰｓ（ ｆ Ｉ ｌ２．５ ｌ】ｌｌｌｌ（ Ｉ／Ｉ ）２．０ Ｉｘ１ ，Ｔａｑ Ｉ）ＮＡ聚合酶（５ ＬＩ／Ｉｘ１ ） ０．２ Ｉ ，卜、下游ＤＩ Ｏ ｆｊｌ物（２０ ｔｘｍ￣，Ｉ／Ｉ ）符１．０ Ｉ ， 以 离＿ｒ水补充至２５ ＩＪ 采川该最优体系伶测 ．ｒＳＷＶ阳 样 ，呵以 效地扩增到Ｈ标条，，…ｉｆ：（ １（１ １ 收ＴｓｗＶ、番肺环斑病薄、娴ｆ， ｊ１ 斑病 干¨番 黑 病 ４种均能侵染肺科 物的榆疫性病越的 ｃＤＮＡ ７ｔ 模板，同时用健 ，０铃僻植侏叶片作 ａ ｂｐ Ｉ５００ ｌ０００ Ｍ ９ Ｉ ５０（卜 （）００ ５００ ４００ ３００ ２００ ＩＯ０ ５Ｏ０ 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变弱 、 １总ＲＮＡ取５～０．０５ ｔｘＬ ，… Ｏ—ＰＣＲ均能 ２５０ 扫 增ｊｉＩＪ Ｈ标条带．ｍ 总Ｉ／ＮＡ取０．０２５ １ Ｈ ，ＤＰＯ— ＰＣ｜－Ｉ不能扩增到¨际条带（罔３） ｔｔＮＡ．陔方法的检测灵敏度为７．５ ｌ ｇ ｂｎ Ｍ ｌ０（１ 此，利用 ●： 的ＴＳＷＶ 的１）ＰＯ—Ｉ＇ＣＲ方法能仃效地检…７．５ Ｍ：ＤＩ．２（１００ Ｉ）Ｎ 、１Ｉｌ ｌｋｅｒ；１ ４：分 ｌＪ ｊＫ Ｔ 、、、、 Ｊ Ｊ Ｒｆ ｆ ｝ ・ 』１ 且｛・ｊｆ 毒手｛】番 ｝ｉ Ｊ＝干＝ 拉ｌ ｌ０ ｃ、Ｉ）、、” ｆ旗ｆＫ， ２０００ 进仃１）１ Ｏ—Ｉ＂ＣＩｔ １７．Ｊ、 ；５： 对照 １０００ ７５Ｏ ５（）Ｏ 图４ ＴＳＷＶ ＤＰＯ—ＰＣＲ检测方法特异性试验结果 ３ 结论与讨论 植物愉疫是种传痫 １；＝ｊｘ 令管理巾－个 的措 施，各【ｔ４制定相应的法规对种Ｉ 健 进行 １５０ ｌ（ｍ Ｍ：Ｉ）Ｉ ２００（Ｊ Ｉ）Ｎ Ａ Ｍ ａｉ ；１ ８：分刖取５、２．５、１、０ ５、０ ２５、０ ｌ、０ ０５、 检测和僻 ，阻ｌ卜外来痫 物（病毒、扎闲、细 等） 的进入， ｝厂Ｉ书闻的农、Ｉ 随着 州运和 ０ ０２５ ｌ 、、、ｌ｛ 、 ＇土Ｊ校扳，进行反转 Ｒｌ Ｉ）ｌＪ（１一｝】ｔ Ｒ反 图３ ＴＳＷＶ ＤＰＯ—ＰＣＲ检测方法灵敏度试验结果 际种苗 易的迅速发 ，仙物病毒检 蹙 种苗 ２．４ ＴＳｗＶ ＤＰｏ—ＰＣＲ检测方法特异性试验 结果 贸易中受剑越来越多的 视，研究一些快速、准确、 灵敏的 ｆ１Ｉ 痫毒愉疫技术成为各 植物愉螋技术研 １究的重点 『１前，ＴＳｗ、’快速愉测最常 的力‘法是 普通ＰＣＲ嗣Ｉ 时荧光定 Ｉ）（：Ｒ 引物没汁 制约 利Ｈ】建立的１）１ （）一ＰＣＲ方法伶测４种供 十ｒ【 物 ，结粜表日』ｊ，以ＴＳｇ； ￣Ｖ ｃＤＮＡ 模板能够扩增 对照均术扩增刨Ｈ的条带，｝ｉ＿ …２０８ Ｉ，ＩＪ条带， 颅 『｛标条带 小一敏，而ｊ 他 病 川性材料和 无 特件性扩增（ ４），说明本 究地 的ＴＳＷＶ 陔类俭测办法成败的父键惟 袭 、 小研究引 入一种利Ｊ｛Ｊ ＤＰ（）引物的 ：Ｒ技术，ＪＩＩ十愉测 ＴＳＷＶ 通ＰＣＲ ｌｒ 』ｌ物ｆ¨ ｆ荧光定ｌｌ ＰＣＲ引 第１１期 刘忠梅等：应用ＤＰＯ技术检测番茄斑萎病毒方法的建立 ９７ 物相比，ＤＰＯ引物设计简单，不需要反复比对引物 的特异性，也不需要优化引物的各项参数与反应条 件。本研究还表明，采用ＤＰＯ—ＰＣＲ方法检测 ＴＳＷＶ时，在４９．８～７０．０ ｏＣ的退火温度下，均能保 持高效扩增，不同于普通ＰＣＲ和实时荧光定量ＰＣＲ 需要选择最适的退火温度。因此，ＤＰＯ—ＰＣＲ大大 地简化了引物设计、试验操作，且节约成本。经过对 引物、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶用量的优化，建立了 ＴｓｗＶ ＤＰＯ—ＰＣＲ反应体系（２５ Ｌ）：ＤＮＡ模板 １ ｔｘＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ“）２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰｓ（每种２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０ ＩｘＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ ｕ／ Ｌ）０．２ ＩｘＬ， 上、下游ＤＰＯ引物（２０￣ｍｏｌ／Ｌ）各１．０ Ｌ，以去离 子水补充至２５ Ｌ。采用该最优体系检测ＴＳＷＶ阳 性样品，可以有效地扩增到目标条带。 ＤＰＯ引物中加入了多聚次黄嘌呤（ｐｏｌｙＩ），该多 聚次黄嘌呤由弱的氢键连接，所以它比其他碱基的 熔点低，同时多聚次黄嘌呤把ＤＰＯ引物分成了两部 分，起到了固定作用并决定着引物的特异性延伸。 由于ＤＰＯ引物特殊的结构，使其自身或者引物之间 很少形成发夹结构或二级结构，提高了扩增效率， ＤＰＯ引物与模板发生错配的概率很小，一旦有３个 以上碱基错配，就不会成功扩增，保证了扩增的特异 性¨ 。本研究中特异性试验结果表明，ＤＰＯ技术 能准确地鉴定出目标植物病毒，其他植物病毒无交 叉反应和非特异性反应。该技术显示出了良好的可 靠性和实用性，为ＴｓｗＶ的准确检测提供了新手 段，为种苗调运和国际种苗贸易的迅速发展提供了 技术保障。 参考文献 ［１］ 洪霓．番茄斑萎病毒的检疫技术［Ｊ］．植物检疫，２００６， ２０（６）：３８９—３９２． ［２］ Ｇｅｒｍａｎ Ｔ Ｌ，Ｕｌｌｍａｎ Ｄ Ｅ，Ｍｏｙｅｒ Ｊ Ｗ．Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｄｉａｇ— ｎｏｓｉｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｌａｔｉｏｎ— ｓｈｉｐｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９２，３０： ３１５—３４８． ［３］ Ｍｏｍｏｌ Ｍ Ｔ，Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｋ Ｊ Ｅ，Ｏｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ０ｆ ＴＳＷＶ ｏｎ ｔｏｍａｔｏｅｓ ｗｉｔｈ ＵＶ—ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ ｍｕｌｃｈ ａｎｄ ａｃｉｂｅｎｚｏｌａｒ—Ｓ—ｍｅｔｈｙｌ［Ｃ］／／Ｔｈｒｉｐｓ ａｎｄ ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｐｒｏ— ｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ７ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｈｙｓａｎ— ｏｐｔｅｒａ．Ｉｔａｌｙ：ＣＳＩＲＯ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，２００１：１１１・１１６． ［４］ 郑元仙，刘雅婷．番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究 进展［Ｊ］．云南农业大学学报，２００９，２４（４）：６０７—６１３． ［５］ Ｗｈｉｔｉｆｅｌｄ Ａ Ｅ，Ｕｌｌｍａｎ Ｄ Ｅ，Ｇｅｒｍａｎ Ｔ Ｌ．Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓｅｓ— ｔｈｒｉｐｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ，２００５，４３： ４５９－４８９． ｒ［６］ Ｇｈａｎｅｋａｒ Ａ Ｍ，Ｒｅｄｄｙ Ｄ Ｖ Ｒ，Ｌｉｚｕｋａ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｂｕｄ ｎｅｃｒｏ— ｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｕｄｎｕｔ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ．）ｉｎ Ｉｎｄｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｈ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９７９，９３：１７３—１７９． ［７］ Ｃｈｏ Ｊ Ｊ，Ｍａｕ Ｒ Ｆ Ｌ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｗ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｈｏｓｔ ｌｉｓｔ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ（ＴＳＷＶ） ［Ｊ］．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｉｅｓ，１９８７，７８：１—１２． ［８］ 洪霓，高必达．植物病害检疫学［Ｍ］．北京：科学技术 出版社，２００５：１２０—１２３． ［９］Ｓｃｈｏｈｈｏｆ Ｋ Ｂ Ｇ，Ａｄｋｉｎｓ Ｓ，Ｃｚｏｓｎｅｋ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｐ １０ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１１，１２（９）：９３８—９５４． ［１０］ Ｃｈｕｎ Ｊ Ｙ，Ｋｉｍ Ｋ Ｊ，Ｈｗａｎｇ Ｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏ— ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａ— ｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２ Ｃ１９ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３５：４０－４６． ［１１］ Ｋｏｍｍｅｄａｌ Ｏ，Ｓｉｍｍｏｎ Ｋ，Ｋａｒａｃａ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｄｕａｌ—ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ０ｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ—ｒａｎｇｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃ— ｔｅｒｉａｌ １ ６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉ— ｍｅｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，５０ （４）：１２８９—１２９４． ［１２］ 刘梅，黄新，马占鸿，等．应用ＤＰＯ引物检测马铃薯病 毒的多重ＲＴ—ＰＣＲ技术研究［Ｊ］．植物病理学报， ２００９，３９（４）：４３１－４３４． ［１３］ 徐义刚，李丹丹，崔丽春，等．应用ＤＰＯ—ＰＣＲ技术检 测肠出血性大肠杆菌０１５７：Ｈ７［Ｊ］．食品科学，２０１４， ３５（８）：１６０—１６４． ［１４］ 徐义刚，李丹丹，刘忠梅，等．产肠毒性大肠杆菌ＤＰＯ— ＰＣＲ检测方法的建立与应用［Ｊ］．中国生物工程杂 志，２０１３，３３（１１）：７５—８０． ［１５］ 辛言言，刘洪义，杨长志，等．番茄黑环病毒ＲＴ— ＬＡＭＰ检测方法的建立［Ｊ］．河南农业科学，２０１５，４４ （４）：８８—９２． ［１６］ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ Ｄ Ｅ，Ｚｈａｎｇ Ｐ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｗ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅ— ｏｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ０ｌｉｇ０ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５ 一ｄ（ＣＧＣＸＡＡＴＴＹＧＣＧ）．３ ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ・ ｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５：１９３５—１９４２． ［１７］ Ｗｏｏ Ｈ Ｙ，Ｐａｒｋ Ｈ，Ｋｉｍ Ｂ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃ— ｔｉｏｎ ｏｆ ＨＢＶ ＹＭＤＤ ｍｕｔａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，２００８，１５３ （１１）：２０１９—２０２５．
