食品与发醇科技 Ｆｏｏｄ ａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第４９卷（第２期）Ｖｏ１．４９，Ｎｏ．２ 基于ＩＴＳ序列分析鉴定栓孑Ｌ菌属物种 孙晓琳 ，商圆圆 ，张恩奎 ，霍存录 ，贺新生 （１．西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０；２．金堂县林业局，四川金堂６１０４００） 摘 要：以采自四川盆地的栓孔菌属的ｌ２个标本作为研究材料，对形态特征进行初步鉴定，结合来自ＧｅｎＢａｎｋ的６ 个最相似物种（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｏｃｈｒａｃｅａｅ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｏｂｓｔｉｎａｔａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｐｕｂｅａｃｅｎｓ、Ｔｒａｍ・ ８ｔｅｓ ｙｅＺ“ｆ ０）共计１８种栓孔菌属的ｒＤＮＡ ＩＴＳ区段进行序列同源性分析。结果表明，三大类群中，粗毛栓孔茵和偏肿 栓菌的菌株各自聚为ｌ组。云芝栓孔茵属的菌株聚为三组，其中，ＨＥ２８０７和ＨＥ２１００６以９８％，ＨＥ２９２５与来自Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ上的５个茵株．ＨＥ２１０８０、ＨＥ２１０８４和ＨＥ２９０５分别以较高的同源性聚为一起。说明根据形态特征观察的同时， ＩＴＳ序列分析在近缘种的分类鉴别上有一定价值，但是只能作为大型真菌分类鉴定的参考依据。 关键词：栓孔茵属；ＩＴＳ序列：系统发育 中图分类号：￥６４６．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—５０６Ｘ（２０１３）０２—００８５—０００４ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｒＤＮＡ ＩＴＳ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ＳＵＮ Ｘｉａｏ—ｌｉｎ ，ＳＨＡＮＧ Ｙｕａｎ—ｙｕａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｅｎ－ｋｕｉ ，ＨＵＯ Ｃｕｎ－ｌｕ ，ＨＥ Ｘｉｎ－ｓｈｅｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｙａａｎｇ Ｓｉｃｈｕａｎ ６２１０００，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｊｉｎｔａｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｊｉｎｔｎｇ Ｓｉａｃｈｕａｎ ６１０４００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｅｌｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｍｅｔｅｓ，ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｓｉｃｈｕａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｔｈｅ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒ・ ｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ＢＬＡＳＴ ｍａｔｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｅｌｖｅ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｓｉｘ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ，ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ，Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ ａｎｄ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｇｉｂｂｏｓａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ １ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍ，４ ａｎｄ １４ ｔｏ ９８％，３５ ａｎｄ ５ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ，３７，４４ ａｎｄ Ｑ １４ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ．ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗａｓ ｂａｓｉｃ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄａｔａ ｉｓ ａ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｕｓｅｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ，ａｎｄ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｆｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂａｓｅｄ Ｏｉｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｕｉｒｔｉｎｇ ｂｏｄｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｍｅｔａｅｓ；ＩＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｐｈｙｌＴｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｏｉ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１６７４—５０６Ｘ．２０１３．０２—０２３ 栓孑Ｌ菌属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）隶属于担子菌门（Ｂａｓｉｄ． Ｉｎｄｅｘ Ｆｕｎｇｏｒｕｍ中记载了８１８个分类单元，但其中 ｉｏｍｙｃｏｔａ），伞菌亚门（Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ），伞菌纲（Ａ— 有许多物种被划分到了其他的属中，如Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ、 Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ、Ｃｅｒｒｅｎａ、Ｈｅｘａｇｏｎｉａ、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ、ｈｃｈｎｏｄｅｒ－ ｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ），多孔菌目（Ｐ０切ｏｒａｌｅｓ），多孔菌科 （Ｐ０ｌｙｐｏｒａｃｅａｅ），是大型真菌中分布广泛的大属，在 收稿日期：２０１３—０２—２２ ｍａ、ＰｏｌｙｐＯＦｌＺＳ、Ｌｅｎｚｉｔｅｓ等，几乎包括了多孔菌目的所 基金项目：西南科技大学研究生创新基金项目（１２ｙｃｊｊ２３） 作者简介：孙晓琳（１９８５一），男，硕士研究生。主要从事菌物学研究。 通信作者：贺新生（１９６５一），男，教授。主要从事菌物资源研究。 食品与发酵科技 ２０１３年第２－ｇｌ 有属，物种多样性是非常丰富，但具体种类的划分 比较混乱。栓孔菌主要生长在各种树木的枯树干、 树桩、倒木上，柏树、松树树干和树桩均可生长。广 泛分布。栓孔菌价值大，应用范围广，其主要应用 在染料脱色、漆酶、药用等方面。例如，云芝栓孑Ｌ菌 用菌丝体发酵进行提取，已经开发出多种抗癌药 物［１－３］。 大型真菌的传统分类主要依据子实体的形态、 孢子等特征，但有时受环境的影响，形态上可能表 现较大的差异．给分类和鉴定带来一定困难 。分 子生物学技术的发展为系统分类研究者开辟了新 途径。近年来。ｒＤＮＡ序列分析已经被系统发育学 研究人员广泛应用．已有较多关于利用ｒＤＮＡ上的 内转录间隔区（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）对 大型真菌包括食用菌、外生菌根菌等进行分类鉴 定、纯培养菌种鉴定和分子系统发育相关的研究 报道［７－９］。 本研究对采自四川盆周山区不同地方的ｌ２种 栓孔菌标本进行初步鉴定的基础上，对１２个栓孑Ｌ菌 的ｒＤＮＡＩＴＳ区段进行序列测定和分析，构建系统发 育树，以期为基于传统形态特征对ｌ２个栓孑Ｌ菌做出 的分类鉴定提供分子依据。 １材料和方法 １．１ 实验材料 １．１．１供试菌株 １２种供试栓孔菌属子实体（表１），于２０１ １－２０１２ 年采自四川地区。本实验室栓孑Ｌ菌属标本经过贺新 生教授初步鉴定后．烘干保存于西南科技大学微生 物实验室。 表１供试菌株 Ｔａｂ １ Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｓｔｒａｉＦＩＳ 种名 菌株编号 来源 登录号 Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＨＥ２８０７ 江油龙王村 ＫＣ４６１２９８ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＨＥ２１０３１ 德阳中江２村ＫＣ４６１２９９ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＨＥ２１００６ 德阳中江２村ＫＣ４６１３００ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＨＥ２９２５ 绵阳南湖机场ＫＣ４６１３０２ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＨＥ２１０８０ 江油西山 ＫＣ４６１３０３ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｕｅｒ￥ｉｃｏ／ｏｒ ＨＥ２１０８３ 江油西山 ＫＣ４６１３ｏ４ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＨＥ２９０５ 江油九岭乡 ＫＣ４１２２６７ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ ＨＥ２１０７６ 江油西山 ＫＣ４６１３０１ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｔｓｕｔａ ＨＥ２９１６ 江油西山 ＫＣ４６１３０５ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ ＨＥ１０７０１０１ 西科大校园 ＫＣ４１２２４９ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｂｂｏｓａ ＨＥ１０３２８０３ 江油药王谷 ＫＣ４６１３０６ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｂｂｏｓａ ＨＥ００９１３０２青ＪＩＩ三锅乡 ＫＣ４６１３０７ １．１．２主要试剂 ｄＮＴＰ，ＭｇＣ１２，１０ｘｂｕｆｆｅｒ，ＩＴＳ１／ＩＴＳ４引物，ＴａｑＤＮＡ 聚合酶（均购自上海Ｓａｎｇｏｎ公司）。 １．２试验方法 １＿２．１ ＤＮＡ提取 称取约１ｇ左右菌株子实体，加液氮研磨成粉末 后，采用改良的ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ［１ 。所提 ＤＮＡ先用１．Ｏ％的琼脂糖凝胶电泳定性检测。将检 测合格的总ＤＮＡ ４℃保存备用。 １．２．２引物序列及ＩＴＳ—ＰＣＲ扩增 采用真菌核糖体基因间隔区通用引物ＩＴＳ１和 ＩＴＳ４（ＩＴＳ １：ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ；ＩＴＳ４：ＴＣＣ ＴＣＣＧＣｒｒｒＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ）进行ＰＣＲ扩增，扩增在 Ｂｉｏｍｅｔｒｅ Ｔ３０００ＰＣＲ仪上进行。采用２５１￣Ｌ的反应体 系：２．５ｌｘＬ １０ｘｂｕｆｆｅｒ，２．０１ｘＬ ４种ｄＮＴＰ混合物。ＩＴＳ１ 和ＩＴＳ４引物各２．０ｔｚＬ，０。５ｊｘＬ ＴａｇＤＮＡ聚合酶，１．５￣Ｌ Ｍｇ ，１２．５ｐ＋Ｌ ｄｄＨ２Ｏ，２．０１ｘＬ ＤＮＡ模板。反应条件： ９４℃预变性５ｍｉｎ，９４ｃＩ＝变性４０ｓ，５５ｏＣ退火５０ｓ，７２℃ 延伸５０ｓ，７２℃延伸１０ｍｉｎ，循环３Ｏ次，４￣Ｃ保存。采 用１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用ＵＶＰ 凝胶成像系统拍照记录电泳谱带。 １．２＿３ 测序 将理想的ＰＣＲ产物寄送到生工生物工程（上 海）有限公司进行测序，获得所需的ＩＴＳ序列数 据。 １．２．４序列分析 在ＮＣＢＩ中进行Ｂｌａｓｔ，获得的同源序列。然后用 ＤＮＡＭＡＮ（６．０．３．９９版本）对所有的序列进行比对， 建立系统发育树。 ２结果与分析 ２．１ ＤＮＡ的提取、产物纯化 实验共提取了１２个菌株的菌丝体总ＤＮＡ，均 获得较高质量的总ＤＮＡ片段，以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引 物．对１２个样品基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增均得到 了单一的ＩＴＳ序列的片段（图１）。 图１ 十二个菌株ｒＤＮＡＩＴＳ区域电泳图谱 Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ １ ２ ｓｔｒａｉｎｓ 第４９卷（总第１７４期） 孙晓琳等：基于ＩＴＳ序列分析鉴定栓孔菌属物种 表２栓孑Ｌ菌ＩＴＳ的序列长度及ＧＣ含量 Ｔａｂ．２ Ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ６Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ２．２ ｒＤＮＡ ＩＴＳ的测序及序列分析结果 经ＰＣＲ产物直接测序，得到１２个菌株的ＩＴＳ 序列（见表２）。 由表２看出。１２个栓孔菌的ＩＴＳ序列全长为 ５８０—６１ｌｂｐ．其中ＨＥ１０７０１０１的ＩＴＳ序列的长度最 长为６１ｌｂｐ，ＨＥ２１００６的ＩＴＳ序列的长度最短为 ５８０ｂｐ，ＨＥ２１０８３和ＨＥ２９０５的碱基长度相同，均为 ５９６ｂｐ，ＨＥ２１０７６与ＨＥ００９１３０２的碱基长度也相同，洲蘸薰垂 均为６０６ｂｐ。ＧＣ含量为４５．６４—４８．７２％，差异较小。在 ４种碱基中Ｔ的含量较高且较稳定。 ２．３ 系统进化树的构建 运用ＤＮＡＭＡＮ（６．０．３．９９版本）软件对１２个本 试验测定所得和６个来自ＧｅｎＢａｎｋ的栓孔菌属ＩＴＳ 序列进行系统发育分析和进化树的构建。 Ｒｅｎｓｋｅ等ｎ。 在对土层中分布的外生菌根菌群 落进行分子鉴定的研究中提出．供试的ｒＤＮＡ ＩＴＳ 序列通过与ＮＣＢＩ的ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行ＢＬＡＳＴ 检索比对，序列相似性≥９９％，可以鉴别为相同种； 序列相似性为９５—９９％，可以鉴别为相同属；序列相 似性≤９５％，可以鉴别为相同科。 从图２系统发育树可以看到。ｌ２个实验菌株被 分为云芝栓孔菌、粗毛栓孔菌和偏肿栓菌三大类群。 其中粗毛栓孔菌和偏肿栓菌的菌株各自聚为１组。 偏肿栓菌的ＨＥ１０３２８０３和ＨＥ００９１３０２以９９％的 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值聚在了一起，这一结果从基于ＩＴＳ序列 的分子水平上支持了本试验的形态鉴定结果。特别 值得关注的是，代表Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ的ＨＥ２１０７６ 与同为Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ的ＨＥ２９１６和ＨＥ１０７０１０１ 以１００％的ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值聚为一起，再次从分子水平 上支持了基于形态特征对此三种所做的同类鉴定 云芝栓孔菌属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）的菌株聚为三 组，其中．ＨＥ２８０７和ＨＥ２１００６以９８％的ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值聚在了一起，ＨＥ２９２５与来自ＧｅｎＢａｎｋ上的５个 菌株聚为一起。ＨＥ２１０８０、ＨＥ２１０８３和ＨＥ２９０５以较 高的同源性聚为一起。 图２基于ＩＴＳ序列构建的栓孔菌属系统发育树 Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒｅｅ ｏｆ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＩＴＳ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３讨论 近几年来，依据子实体形态特征对大型真菌的 分类鉴定不仅受子实体生长环境、生长时期等客观 一 因素的影响，而且形态性状的选取和判断受主观因 素的影响也较大，因而基于形态性状特征对大型真 菌进行分类鉴定总是有一定的局限性．特别是对于 一些形态特征极为相近的种，极难准确区分鉴定到 种一级 。 李海波［１２－ｉ３ ３、曹颖ｎ 等的研究也表明ＲＡＰＤ等 其他分子方法也能用于菌种的快速鉴定。但相比之 下ＩＳＴ序列分析更为精准、有说服力，因为其他分子 方法只体现了序列长度的差异，而ＩＴＳ序列分析体 现的是碱基差异。因此，ＩＴＳ序列分析在食用菌的快 速分类鉴定方面具有极大优势。 在本研究之初，为了能更为真实的反应所有供 试栓孔菌属的亲缘关系及其分类地位，根据初步的 形态特征鉴定，所有供试菌株可被分为云芝栓孔菌、 粗毛栓孔菌和偏肿栓菌三大类群。本实验的聚类结 果也将栓孑Ｌ菌属分为三大类群。本试验首先测定了 １２个栓孑Ｌ菌属菌株的ＩＴＳ序列，ｌ２个栓孔菌属菌种 的ＩＳＴ序列全长为５８０—６１ｌｂｐ ＧＣ含量为４５．６４一 食品与发酵科技 ４８．７２％。差异较小，四个碱基中Ｔ的含量较高且较 稳定。然后对１２个本试验测定所得和６个来自 （３）：３６４－３７１． ２０１３年第２期 ［４］李海波，吴学谦，魏海龙，等．基于形态特征和ＩＴＳ序列 对７个鹅膏菌属菌株的分类鉴定［Ｊ］．菌物研究，２００７，５ （１）：１２—１８． ＧｅｎＢａｎｋ的栓孔菌属ＩＴＳ序列进行系统发育分析． 结果表明基于传统形态特征的鉴定依据．辅以ｒＤ． ＮＡ ＩＴＳ序列的比较分析，有助于栓孔菌属等大型真 菌的准确分类鉴定。如基于ＩＴＳ序列对ＨＥ１０３２８０３ ［５］戴沩田，张平．中国几种剧毒鹅膏菌的ＩＳ序列分析［ＴＪ］． 生命科学研究，２００６，１０（３）：１１０一ｌｌ３． ［６］黄龙花，杨小兵．基于ＩＳ序列分析鉴定灵芝属菌种［ＴＪ］． 中国食用菌，２０１０，２９（１）：５５—５７． 和ＨＥ００９１３０２以９９％的ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值，ＨＥ２１０７６、 ＨＥ２９１６和ＨＥ１０７０１０１以１００％的ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值聚为 一［７］Ｒｏｙｓｅ Ｄ Ｊ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｍ Ｓ，Ｂｕｎｙａｒｄ Ｂ Ａ．Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ 起，可以被鉴定为同一种。本研究同时也说明单方 面基于ＩＴＳ序列特征的分子鉴定有时会与基于传统 形态学的鉴定结果有所差别。如对于云芝栓孔菌属 （Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）的菌株由系统发育树来看被聚 为三组，ＨＥ２８０７和ＨＥ２１００６以９８％的ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值 聚在了一起，ＨＥ２９２５与来自ＧｅｎＢａｎｋ上的５个菌 株聚为一起。ＨＥ２１０８０、ＨＥ２１０８３和ＨＥ２９０５也以较 高的同源性聚为一起。这表明基于分子水平上的 ＩＴＳ序列特征只能作为大型真菌分类鉴定的参考依 据。 在对四川盆周山区丰富的大型真菌资源调查的 ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｄｉｂｌｅ ｆｕｎｇｉ［Ｃ］／／Ｌｕｏ Ｘ Ｃ，Ｚａｎｇ Ｍ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ Ｍｕｓｈｍｏｍ．北 京：中国农业科技出版社，１９９５． ［８］ Ｂｕｎｙａｒｄ Ｂ Ａ，Ｃｈａｉｃｈｕｃｈｏｔｅ Ｓ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｍ Ｓ，ｅｔ ａ１． Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌ Ｒｅｓ，１９９６，１００（２）：１２３— １５０． ［９］林晓民，李振岐，王少先．真菌ｒＤＮＡ的特点及在外生 菌根菌鉴定中的应用［Ｊ］．西北农业学报，２００５，１２（２）： １２０－１２５． ］｛［１０］Ｒｅｎｓｋｅ Ｌ，Ｐａｕｌａ Ｌ，Ｔｈｏｍ Ｗ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｏｆ ｅｃｔｏｍｙｅｏｒｒｈｉｚａｌ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｉｎ ｓｏｉｌ ｈｏｒｉ— 基础上，充分利用ＩＴＳ方便、快捷、科学的特点，借助 ＧｅｎＢａｎｋ等生物数据库的大量信息，从分子水平上 可以对这些真菌资源的准确分类、真菌类群的快速 鉴定提供科学依据。 参考文献 ［１］ 毕旺华，田雪梅．毛栓孔菌菌丝体生长营养条件的优化 研究［Ｊ］．青岛农业大学学报，２０１２，２９（１）：５ｌ一５４． ［２］戴玉成，图力古尔．中国东北野生食药用真菌图志［Ｍ］． 北京：科学出版社，２００７，２１２． ｚｏｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ２ｒｏｎｍｅｎｔｌａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０ｏ３，６９（１）：３２７—３３３． ［１１］李海波，吴学谦，魏海龙，等．基于形态特征和ＩＴＳ序列 对７个鹅膏菌属菌株的分类鉴定［Ｊ］．菌物研究，２００７，５ （１）：１２—１８． ［１２］李海波，吴学谦．缘盖牛肝菌纯培养菌种的ＲＡＰＤ和ＩＴＳ 分子标记鉴定［Ｊ］．食用菌学报，２００７，１２（１）：ｌ一５． ［１３］李海波，吴学谦．几种森林大型真菌纯培养菌种的ＲＡＰＤ 和ＩＴＳ分子标记鉴定［Ｊ］．林业科学，２００７，４３（１２）：９４— １０ｏ． ［３］ 司静，崔宝凯．东方栓孔菌在染料脱色中的应用及其 脱色条件的优化［Ｊ］．基因组学与应用生物学，２０１１，３０ ［１４］曹颖，贺新生．用ＲＡＰＤ和ＩＴＳ１标记鉴定斑褶菇属与裸 盖伞属间疑难菌株［Ｊ］．食用菌，２００７（６）：１６—１７． （上接第６０页） ３结论 翁毅力．山楂的药理作用ｆＪ］．中国药业，２００５，１４（１２）： ８９～９０． 通过Ｌ９（３ ）正交试验，热水浸提法提取山楂多 李艳红，林勤保，罗莹．山楂多糖提取的研究［Ｊ］．农产品 加工，２００６（５）：４３４６． 糖各影响因素对提取率影响大小依次为：提取次 数＞浸提温度＞浸提时间＞料液比。最佳提取条件为： 料液比１：４０、浸提时间４ｈ、浸提温度８０ｃＣ、提取次数 ３次，山楂多糖提取率达到１．５２￣０．０４％。 参考文献 ［１］ 赵焕淳，丰宝田．中国果树志．山楂卷［Ｍ］．北京：中国林 业出版社，１９９６． 闰启光．山楂多糖对小鼠免疫功能的影响［Ｊ］．中国中医 药咨讯，２００９，１（６）：１３４． 唐礼可．山楂多糖抗疲劳作用实验研究［Ｊ］．云南中医中 药杂志，２００８，２９（２）：３２—３３． 牛丽芳．利用响应面分析法优化山楂多糖的提取工艺［Ｊ］． 农产品加工，２０１ １（６）：６６—７０． 姜军平，唐俊昌．实用生物化工技术［Ｍ］．西安：西安交通 大学出版，１９８１：１２４—１２５．
