EBP50影响HeLa细胞微丝骨架的分布和定位

󰀀1192󰀀中国肿瘤临床󰀀2008年第35卷第20期󰀀基础研究EBP50影响HeLal：细胞微丝骨架的分布和定位：郑君芳王瑛陈鹏①贺俊崎100069首都医科大学基础医学院生化和分子生物学系(北京市)摘要—目的：通过研究与膜phosphow—一细胞骨架连接蛋白(ezrin)对HeLaradixin—moesin，ERM)家族相结合的磷酸化蛋白50(ERMbinding(plateletde—proteintor一50。EBP50，细胞微丝骨架含量分布的影响及受血小板源性生长因子PDGF、，rivedgrothfac)刺激后微丝骨架在细胞中定位的变化及微丝骨架定位变化与EBP50的关系阐明。EBP50蛋白影响肿瘤细胞生长迁移的分子机制，方法：将pBK，CMV—HAs空载体和pBK—CMVHA—EBP50wt重组质粒分别转染HeLa细胞系G418进行稳定表达细胞系的筛选并用WeWeHAstern免疫印迹方法进行蛋白表达的鉴定；利用—tern免疫印迹免疫荧光细胞化学染色等方法结合光镜和激光共聚焦扫描显微镜分别观察和分析HA、一HeLa与，—EBP50HeLa微丝骨架的含量及分布的异同；然后使用lOn~ml和20n~mlPDGF37℃刺激细胞15rnin后分别观EBP50察及分析两组细胞微丝骨架的分布情况及源性EBP50Western在细胞中定位的变化，。结果：Western免疫印迹鉴定证实转染的外La细一cDNA片段可在HeLa细胞系中成功表达EBP50蛋白证明获得稳定表达EBP50蛋白的He——胞系。免疫印迹及免疫荧光结果证实转染空载pBKCMVHA的，．HeLa细，胞微丝骨架粗大疏松方向不，，交错排，列：与其相比EBP50虽然对HeLa细胞微丝骨架的含量没有明显影响但能够促使细胞微丝骨架呈致密细丝状平行规则排列并沿细胞极性分布；并且在PDGF刺激下EBP50能够与微丝骨架，，一起自胞浆迁移至膜上并共定位，。结论：EBP50能改变He于膜表面。La细胞微丝骨架的分布。在受到PDGF刺激时，EBP50还能使HeLa细胞系的微丝骨架定位。EPB50可能通过影响微丝骨架的分布和定位来发挥其影响肿瘤细胞生长迁移的功能HeLa细胞关键词微丝骨架encesa，EBP50EBP50InfluDistributionandLocalizationofMicroilafmentCytoskeletoninCulturedHeLunfannCells’，ZHENGJg’WANGYingthor：HECHENPeng—’一，HEJunqi．。Correspo’dingauJunqiE，mail：jqhe@ccmuedu．cneDepartmnentofBiochemistryandMolecularBiologyCapitalMedicalUniversityB，，ijing100069，China。SharandosungEyeIn：Nae：stitute，Qingdao266071Chin，aGttpportionalNaturalScienceFoundationofChinaex(30572183dixinan—d30772573sa)phoprotein50—一objectivcroToploretheinflutenceofEBP50(ezrincu—raremoesceinbindingpholls，)onmi—filamentcytoskeletonccontenanddistributioninnltudHeLanantoinverestigtethere—lationshipberowtweenthehanges，inanmicrofilamentcytoskeletothe．localizatiodEBP50bywatfPDGFsu(plasmteletderivesedgthfactor)sratimulationanthedtofur．rclarifys：molecularmec—．hawnismhichEBP50binanppressidceantumorce—llprolifeemtiondmigrationnsMethodpBKCMVHAEBP50ceildtypewasxrecomusetplaandpBKCMVHAsptyssvectorwere．traesfectedintoHeLasllsou．G418aLt350mg／cdto．screenforsllclonestablyexprecroingEBP50menWternblotwacontencarriedttodetetEBP50ecepressioncSimilaritiewddifferencesinwmifilatcytoskeletonnt—anddistributioninvecHeLatorcllstransfetedithpBKCMVHAEBP50sild’typerecombinatplasmmido—orpBKCMVHAemptywereanalyzedbyWeternblotfluo，rescencestainingnanandconfocalicroscpyHeLaceemllsptystablytransfevectedwiththepBKCMVHAEBP50wwildtyperecom。bi‘tplasmidandthepBKCM、，_HAanotorwerealsootreatedrveithPDGFn(10osnmmlg／and20nml37Cg／，，15min)dgstainedbyrhodamine1abeledphalloidinto．bsethedistributioficrofilamentcytoskeletonmunointhetwroups．EBP50proteindistributioninPDGFstimulatedHeLacellswadetectedbyimlfuores。}本文课题受国家自然科学基金(编号：30572183北京市新世纪优秀人才支持计划(编号：NCEF(编号：2007lD0501800253)一，30772573)、北京教委重点基金(编号：KZ200610025013)、060184)和北京市优秀人才培养项目资助①山东省眼科研究所通讯作者：贺俊崎jqhe@ccmu．edu．cn2008年第35卷第20期EBP50影响HeLa细胞微丝骨架的分布和定位DNAfragwerew󰀀1193󰀀cence．Resultsce：WesternanblotresultsconesfirmsedthattheexcenwEBP50cmentcouldexopresseEBP50in．cul—turedHeLaanlllinesdthalsseceemcelllintablypressingEBP50transfecsuccessemfullytor．btain1hedWesternblottcy—dfluorescencenwasresultsho，wedthatintheltidireeclIlinetedithptyvec．milaicroftofmenmtoskeletomericethickn，loomutionaladdisplayedcrossingarrangementsThecontenicrofilatcytoskeletoeinthewlIIinpty．transfectedithpBKCMVHAEBP50exwasdiffemenrentfrOmytosthatfoundintheerizalIJinntransfectedithvector．EBP50thecspresnsionoenha．ncedmicrofilamtckeletonpolymnetiothetheintoccomopactthinfilarwmentsmUndemenrtimulatiofPDGFdco—EBP50eig．ratedtothecelImembrancfromncytosltogetheoithroicroilaftctytoskeletonanlocalizcedtheanreCoalusion：EBP50mcanchatgedistributionnfmicllfilamenytoskeletoninculturedHeLaunllsdcanmalsobindthearoleicrofilamenytoskeletoantothetionocemembranederthestimulationuofPDGFn．EBP50ayplayicrointhecprolifen．rationdmigeraftumorcellsbyinfluemenncingthedistribtionadlocaliztionofmfilamentytoskeletoK一ywordsMicrofilatcytoskeleton；HeLacell；EBP50与膜细胞骨架连接蛋白家族结合的磷酸化蛋白50121．．真核表达质粒的构建、参照参考文献[1]。(ERMbindin—gphosphoprotein一50I，EBP50，122．．细胞培养稳定转染细胞系的建立。细胞培的4NHERF，NHERFl)是含有两个PDZ(PDZ、PDZ2)结养参照参考文献[1]用含浓度为350mLag／LG418构域和白。一个ERM结合结构域的胞内多功能连接蛋和ERM结合结构域均为典型的蛋白质蛋一筛选培养基筛选已转染重组质粒的He周后得到抗性细胞克隆进行培养和传代123．．细胞，3～PDZ。用含G418的维持培养基白质相互作用的结构域种蛋白结合。，EBP50能够通过它们与多。WesternBlot参照参考文献[1]将5X。最近研究发现EBP50具有抑癌潜能在细胞的，124．．PDGFHeLa，刺激HA—EBP50一HeLa及，生长和迁移中起着非常重要的作用EBP50，”。。，但对其影。HA—分别接种于内置盖玻片的35ra．m平皿中。响细胞生长和迁移的分子机制尚有争议由于L每孔细胞数约为1各3孑10’，培养过夜镜下，可通过其ERM结合结构域问接结合细胞骨观察细胞贴壁完全后更换无血清培养基饥饿24h架而细胞骨架在细胞分化和运动中起着重要作用H分别加入终浓度为0con、10和20n~ml的PDGF(Chem，，i—。…’。因而本研究采用能够特异结合微丝骨架，一)，37℃刺激15rain后取出细胞爬片进行荧光主要成分F肌动蛋白的Phalloidin对微丝骨架进行，染色125．．。染色”。，同时对EB50进行免疫荧光细胞化学染色细胞免疫荧光技术标记蛋白阳’利用罗丹进而采用光镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞明一鬼笔环肽荧光探针(Rhodamcuine—Phalloidin。．中F肌动蛋白的动态变化粒和空载体的He异同及，。分析转染EBP50重组质MolelarProbe：1s，美国)对微丝作直接荧光染色3具La细胞微丝骨架的含量及分布的体步骤如下固定15min5mine—)PBS洗3次，4％．中性多聚甲醛室温nPDGF刺激后两组细胞微丝骨架定位的变，。2)PBS洗3次)PBS，01％TritoX一1001U处理Rho—化以探讨EBP50对细胞骨架的影响阐明其影响，细胞dam。洗3次，滴加，肿瘤细胞生长迁移的分子机制111．。inPhalloidin。(含10∥L的BSA)于湿盒中室温，材料与方法避光lh4)PBS洗3次95％甘油封片。材料．利用、、FITC标记的荧光二抗对。一EBP50，进行间接3111．菌株细胞系质粒HeLa，、菌株E—．coliDH5o【、细为免疫荧光染色为加入lhPBS，具体步骤基本同上仅将步骤，改胞系真核表达质粒pBK—CMV——HA—由本实验t1：100稀释的HA，抗于湿盒中室温孵育室保存重组表达质粒pBKCMVHAEBP50w洗3次加人1：50稀释的FITC标记的荧光二。本实验室构建112．。抗于湿盒中室温避光，lh．试剂；Liptin各种限制性内切酶购自Takara公司；、将染色后的细胞爬片置于激光扫描共聚焦显微镜(Leica565n221．DMEM培养基小牛血清及青／链霉素购自HyclonoeMie，rosystexm，LASAF，，TCSSP5，Leic，a，德公司p—fectamine2000a购自Invitrogen公司；国)下观察油镜(m。63)激发光540nm发射光ac抗体购自Sigm公司；HA抗体购自MBL公Biote司；HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公结果稳定表达EBP50蛋白的HeLa司；ECL化学发光试剂盒购自Piercech公司；其~J胞系的鉴定一他试剂均为国产分析纯I2．。分另0收取HeLa1，xlO‘的HA—EBP50sHeLaBlot与HA，—方法制备样品取10斗l进行Wetern实验证󰀀】194󰀀中国肿瘤临床．明获得稳定表达EBP50蛋白的HeLa细胞系(图1)。长迁移的细胞骨架的定位与EBP50在细胞中的分布密切相关据此认为EBP50对细胞生长迁移的影，响是通过其对细胞骨架的调节来实现的。l：control；2：HAHeLa；3：HAEBP50HeLa网Figure11稳定表达EBP50的HeLa细胞系鉴定IdentificationoftheHeLacelllinestablyexpressingEBP50protein22．EBP50对HeLa，细胞微丝骨架表达量的影响HA—操作过程同上的表达量与HA—EBP50一HeLa的F肌动蛋白】。HeLa~g比无差别(图2)2Helm2：H；1：HAAEBP50—一Helm图3FiguWB：EBP50Effec对微丝骨架定位的影响fEBP50son油镜o×63filamenre3tcotheloccalizatioenfmieroBactinytokeleton(objetiv×63)l1：HA—2HeLaml2；：HA—EBP50HeLa图2FigureEBP5对Heo细胞微丝骨架表达量的影响on2EffectfEBP50ctheexprenssionofmicroilafmentytoskeleto2．3EBP50HA—对HeLa细胞微丝骨架定位的影响一EBP50HeLa与HArn—HeLa相比荧光强度，，无显著差别(与上述Westeblot—鉴定结果相同)均11：HA—2HeLa：广泛分布于胞浆中。但HAHeLa，中F肌动蛋白粗—2：HAEBP50—一Helm大疏松方向不，一，交错排列而HA，，EBP50一HeLa，图4FigucPDGFre~lJ激后EBP50对微丝骨架定位的影响Effec油镜×63t中F肌动蛋白呈细丝状纤维平行规则排列粗细匀称24．4ntofEBP50ceonthelocalizdwationofmicrofilamen。与HA—HeLa。l比骨架变得致密并沿细胞极}~，ytoskeletoinHeLallsstimulateithPDGF(objective×63性分布(图3)PDGFPDGF刺激后EBP50对微丝骨架定位的影响刺激后对照HA，——HeLa的微丝骨架没有“变化而，HAEBP50，一HeLa细胞系的微丝骨架迁移”，至细胞膜处胞浆及胞核部位没有荧光呈空洞状，细胞边缘清晰形态完整(图4)，。10ng／ml和20ng／ml的PDGF对He刺激后La细胞骨架分布的影响无显与微丝骨架在膜上共HA，著差别25．。PDGF，EBP50定位与对照组细胞系HA——HeLa相比，EBP50一HeLa受PDGF刺激后微丝骨架的定位一发生了明显变化我们推测这，变化是由于EBP50一1：HA—HeLa2：HA；—HeLa(PDGF刺激)；3：HAEBP50—Helm；的介导而发生的EBP50。因此我们进，步检测了EBP50，，4：HA—EBP50HeLaPDGF(PDGF刺激)；红色：微丝骨架；绿色：EBP50在细胞中定位的变化。结果显示在PDGF刺激后，图5油镜激HeLa细胞后EBP50与微丝骨架的共定位$O×63re在胞浆中减少在胞膜上却显著增加与微丝，。Figutos5ColocalizationceofEBP50tewithmierofilativementcy—骨架在膜上共定位(图5)也就是说影响细胞生，keletoninHeLallsstimuladwithPDGF(objec×63)2008年第35卷第20期EBP50影响HeLa细胞微丝骨架的分布和定位󰀀1195󰀀3讨论Ga2nccrRcs，2006，，8(6)：R63lesFGw，．细胞骨架是胞内的网络系统是细胞运动分，、TsuakahsahiYorsMoraKreimannEL，eta1PTEN．tumor裂和跨膜信息传递的结构基础在细胞分化和运动，ppressptotarassociatesithNHERFpro，，teinstoattenuatePDGFrece时会发生重组““…。近年对细胞凋亡信号转导的研ign，aling[J]EMBOJ．200625(4)：910920．．3ShibaTChumaM，Kookubu，Ahna，et1aEBP50s，abed究发现：三种细胞骨架在细胞凋亡过程中变化非常活跃它们在细胞内的状态直接影响凋亡信号的终，proverteniuencesWantignalingnais，expressedin．hepatocellarcarcniom[]]1a．Hepatology，2003点表明细胞骨架可能是信号转导的空间调控者和，384(1)：178dh186，功能性分子展非常重要F。细胞骨架的这些功能对肿瘤发生发、TheisenCSNwah】JK3rd，JnohntoacsonKR，et．NHERFlinkstheecaerirdcatoteinocom。细胞骨架的成分之一微丝骨架是肌5plexhtehttineplacteletderivtonnadgrodrewhttefac．_cetormotreceptormdulateytoskelegulall动蛋白(actin)以非共价键结合形成的纤维型多聚体肌动蛋白。ilityneⅡ]．M，olBiolCell，200718(4)：1220，，1232tein．。F肌动蛋白的聚合是细胞骨架重构的基，GardooRABagordaABelizziA，ct1a．ProkinaseAgatingmo本事件微丝骨架在细胞分化和运动时会发生重组HfleapsreeudopodialtesloioncatedRhoA／ROCK／NHElp38／breassignald—而且它还可能起着介导胞外信号分子的作用EBP50‘“u。ulagnivasni．tcancercellfines[]]．MolBiolCell，能够通过其，PDZ和ERM，结合结构域与EBP502005，166(7)：3117．—3127cJancameyPAonnaTheytoskeletoncounadcell．signa多种蛋白结合调节多种信号通路进而调控肿瘤细胞的生长迁移”中的分布及与EBP50F“ling：comevponentlolizaifdmechanicalng[J]PhysiolRpli，1998，78(3)：J。为了进一步揭示与细7763781．胞骨架聚合的关系本研究观察EBP50蛋白在细胞，WheelerDtos，SneddotenWBe，WcnagBdm，etem1a．NHERFe1nadthoecy__——肌动蛋白的关系。结果显示keletonregulahttrarsffi．nabrandyn，amicsfGpro，使HeLa细胞微丝骨架变得致密并沿细胞极，teincoupled．recepto~]JBiolGhem2007，282(34)：25076—25087，性分布；在PDGF作为诱导因素的情况下即细胞在受PDGF刺激后，，8HuangzjsaHsaaungladRPflu204，，YouWMen，et1a．PhalenotoxinnadactinEBP50。与细胞微丝骨架均趋于膜能够与某些抑癌蛋白如inhomeuroobinding19929，ybyorescencehancemt[J]．AnalBiochem．上表达并共定位FFENcEBP50dtens200(1)：199，．(phosphata10seanloguedeletostedfrom2。ColeBKcCurtoMtCharAWfonc，et1a．Lerocalizaitdepeonnto山ctecoritclalahromosome)MERLIN(n、ibromfaistypeytoskeleowtoncisnccessarysrNf2／mlinde，npide，rmNf2抑癌基因产物)等相互作用并使这些蛋白从胞，grth—fatorreceptorilengi[J]．MolCellBiol200828(4)：1274101284．浆迁移至膜上发挥其抑制生长信号通路的作用[位从而起到其影响肿瘤细胞生长迁移的作用，、2910󰀀，MreurhyAttor，GonzlarezAgositrG一，CorderoEhanpr，et1a．NHEonRF，a其机制可能是通过影响细胞微丝骨架的分布和定。ulagycomfactolinfoNa(+)H+excgeo，isacomm访te卜，actorof，rernadERM1276．(MERM)teins]J[1．BiolChem(致谢：感谢本科室刘华程杉老师对本文提出建议1998。273(3)：1273感谢司杨和冯桂芬实验员的准备工作)。(20080331收稿)——(2008llgr．08一01参考文献1修回)(邢颖校对)oPanYaW，+angL，DaidEnha．Supprreessionyfafbre1astcanccrceowthtbyN／H+excgergulatorctor(NHERFl)Ⅱ]Breas书，讯“”一由方志沂教授主编中国抗癌协会乳腺癌专业委员会组织全国著名乳腺癌防治专家参加编撰的国家十五重点图书中国肿瘤医师临床实践指南丛书之《已于2007年7月由北京大学医学出版社出版该书兼顾乳腺癌》一，。乳腺癌领域最新研究成果的介绍和临床规范化实用技术的阐述主要内容涉及预防流行病学临床检诊等基本知识同时避免类似书籍中基础内容过多的重复对乳腺癌诊断治疗中的新技术新成果结合国内外的经验尤其对，、、，，、、，．较成熟或较有发展前景的研究均有重点介绍、。内容详实图文并茂即兼顾前沿且重点突出此为本书的特点可作，，，为乳腺肿瘤专业医师普外工作者及其相关基础研究人员的每册定价59元全国新华书店均有售，。一本有价值的参考书籍和教材。