第３６卷第４期 ２０１ ２年７月 水生生物学报 ＡＣＴＡ ＨＹＤＲＯＢＩＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ Ｖｏ１．３６，ＮＯ．４ Ｊｕ１．． ２ ０ ｌ ２ Ｄ０Ｉ：１０．３７２４／ＳＰＪ．１０３５．２０１２．００６４０ 雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达 范 勇 于广欣２ 汪乐霓 曲芳兵 冷 鹂 兰利琼 卿人韦 （１．四川大学生命科学学院，成都６１００６５；２．中海油新能源投资有限责任公司，北京 １０００１６） 摘要：叶绿体或者有色体中的质体球滴结构（Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ）是多数植物的类胡萝卜素等次生代谢产物积累的 场所，但在能大量积累虾青素的雨生红球藻中，这个结构一直没有得到确认。通过透射电子显微镜观察发现 雨生红球藻的质体内确切存在ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构；并通过ＲＴ－ＰＣＲ结合ＲＡＣＥ技术，从雨生红球藻ｃＤＮＡ 文库中克隆到了与编码ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ的结构蛋白（Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）具有高度同源性的基因序列全长，称做 Ｈｐｇｐ基因；该基因的表达产物称之为雨生红球藻质体球滴蛋白（ＨＰＧＰ；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ）；并进一步利用原核表达系统将该编码基因进行原核诱导表达，用Ｈｉｓ．Ｔａｇ蛋白分离纯化系统纯化到了 目标蛋白，并用该Ｈｉｓ．Ｔａｇ融合蛋白为抗原免疫实验兔，制备到了相应的一抗抗体，为下一步对该蛋白的功 能阐明以及雨生红球藻的虾青素积累机制研究提供重要的基础。 关键词：雨生红球藻；虾青素；质体球滴；基因克隆；原核表达；抗体 中图分类号：Ｑ７８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３２０７（２０１２）０４－０６４０－０６ 虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜 谢过程而被人们关注Ｌ２引。 雨生红球藻能够大量积累虾青素，但关于虾青 素的积累结构并没有得到深入的阐述［３，２４，２５】。根据对 虾青素的性质以及ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构积累物质的比 较，发现雨生红球藻的虾青素积累也可能存在于类 素，具有广泛的应用价值。单细胞绿藻雨生红球藻在 环境胁迫条件下可以合成和积累虾青素高达细胞干 重的４％，成为目前首选的天然虾青素合成来源Ｌ１ ］。 早期的研究证实雨生红球藻在叶绿体中合成虾青素 的前体［６－－８】，并大量积累虾青素在胞质中的虾青素 球滴中［ ， 】。但是在大多数植物中，类胡萝卜素类物 质积累于叶绿体或者有色体的质体球滴（Ｐｌａｓｔｏｇｌｏ— ｂｕｌｅｓ）结构中［】卜 】。Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构已被证明是 植物中类胡萝卜素代谢和储存的重要场所，目前对 ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构的研究还在不断深人 ＂１”。 Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构除了含有脂质及次生代谢产物外， 还含有许多蛋白质。其中，ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ蛋白家族是 特异性的结合在ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构上的蛋白［２２］ｏ另 似ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ的结构中。研究雨生红球藻是否含 有ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ蛋白不仅可以揭示虾青素的积累结 构及积累机制，也会对将来的虾青素生产提供优化 的手段和依据。为了对此假设进行研究，我们首先 通过电子显微镜观察，发现雨生红球藻的质体内也 存在ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构。在分子水平上，从已建立 的雨生红球藻ｃＤＮＡ文库中，鉴定出一个相关基因 片段，并通过ＲＡＣＥ技术克隆到了该基因全长，并 将其命名为Ｈｐｇｐ（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ 外，近期的研究还发现在ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ结构中含有 ｐｒｏｔｅｉｎ）。该基因的表达产物我们称之为雨生红球藻 次生代谢产物合成相关的酶，因此，ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ 结构除了具有储存作用外，还参与了相关物质的代 质体球滴蛋白（ＨＰＧＰ），并通过生物信息学分析证 实其与已知植物质体内次生代谢产物积累结构 收稿日期：２Ｏｌ１—０９—２０；修订日期：２０１２－０４—１６ 基金项目：国家高技术发展计￣（８６３计划）（２０ｏ７ＡＡ０９ｚ４２７）；国家自然科学基金面上项目（４０９７６０９２）；四川省科技厅应用基础项 目（２００８ＪＹ００３０）资助 作者简介：范勇（１９８３一），男，山东济南人；硕士研究生；主要从事微藻次生代谢产物开发和能源微藻开发工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｆａｎｙｏｎｇ ＠ｑｉｂｅｂｔ．ａｃ．ｃｎ 通讯作者：卿人韦，Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｉｎｇｒｗ＠ＳＣＵ．ｅｄｕ．ｃｎ ４期 范 勇等：雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达 ６４１ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ相关蛋白ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ有３７％一４５％ 的相似性。并且雨生红球藻ＨＰＧＰ同样存在定位于 质体的前导肽。利用原核表达系统得到了ＨＰＧＰ的 成熟蛋白，并制备了特异性的抗体，为后续研究奠 定基础。 １材料与方法 １．１藻种及培养方法 雨生红球藻（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ Ｆｌｏｔｏｗ ＮＩＥＳ一１ ４４）来自日本的ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎ． ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＩＥＳ）。培养基使用Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａ１．改良的配方［ ，。 ，（醋酸钠：１．２０ ｇ／Ｌ；酵母提取 物：２．００ ｇ／Ｌ；Ｌ一天冬氨酸：０．４０ ｇ／Ｌ；ＭｇＣ１２‘６Ｈ２Ｏ：０．２０ ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４‘７Ｈ２０：０．０１ ｇ‘／Ｌ；ＣａＣ１２‘２Ｈ２０：０．０２ ｇ／Ｌ， ｐＨ＝６．８）。雨生红球藻培养于（２２ｉｌ）￣Ｃ，５０ ｉ．ｔｍｏｌ／（ｍ２＇Ｓ） 光照强度下１２ｈ／１２ｈ的光暗周期，用于同步化处理， 细胞进入对数生长期后，１００ ｇｍｏｌ／（ｒｎ２・ｓ）光照强度下 进行光胁迫。 １．２透射电镜检测 ５０ ｍＬ对数生长期的细胞经过４８ｈ光照胁迫后、 低速离心收集，ＰＢＳ缓冲液洗２次，固定于２％的多 聚甲醛和０．２％的戊二醛中，４＋Ｃ下放置４５ｍｉｎ。低速 离心后倒掉固定液，ＰＢＳ缓冲液洗２次。然后加入 １％四氧化锇固定液在４℃下固定２ｈ。３０％、５０％、 ７０％的丙酮各脱水１０ｍｉｎ，７０％乙醇饱和醋酸铀溶液 中染色过夜（４℃），９０％的丙酮脱水１０ｍｉｎ，１００％的 丙酮脱水２次，每次１０ｍｉｎ，Ｅｐｏｎ ８１２环氧树脂包埋 液与１００％的丙酮按１：１加入进行渗透，３７￣Ｃ放置 过夜。渗透完成后，将样品置于包埋模具中，加入新 鲜的Ｅｐｏｎ８１２包埋液。４５℃下聚合１２ｈ，６０℃下再聚 合１２ｈ。样品包埋聚合后，进行超薄切片，常规铅铀 染后，电镜观察。 １．３ ＲＮＡ提取及ＲＴ．ＰＣＲ扩增目的基因片段 将光照胁迫２４ｈ的细胞４０００ ｒ／ｍｉｎ离心收集， 迅速液氮研磨，使用植物小量ＲＮＡ提取试剂盒（上 海华舜生物技术公司）进行提取，实验操作参照试剂 盒说明。将提取的ＲＮＡ立即进行反转录。 使用已知的３种植物的ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ蛋白家族 蛋白序列『Ｐ８０４７ １（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）；Ｑ４２４９３ （Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）；Ｑ９６３９８（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）】，通 过ｔｂｌａｓｔｎ与本实验室建立的雨生红球藻ｃＤＮＡ文库 中的序列进行比对，选择Ｅ值小于１０ 的片段作为 疑似的雨生红球藻ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ蛋白的ＥＳＴ序列。 设计特异性引物，ＨＰＧＰ１：５ ．ＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣ ＣＴＡＣＧＣＧＣＴＴ一３ ：ＨＰＧＰ２：５＇－ＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＧＣ ＧＴＡＧＧＴＧＧＴＣＡ．３ 。以ＨＰＧＰ１和ＨＰＧＰ２为引物， 以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增［ＰＣＲ反应：９４￣Ｃ ５ｍｉｎ； ３５个循环（９０℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２￣Ｃ ２ｍｉｎ）；７２￣Ｃ保持 １０ｍｉｎ］。ＰＣＲ产物进行琼脂糖电泳，并且胶回收目 的片段。 １．４ 雨生红球藻ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ蛋白基因ｃＤＮＡ全 长的克隆１ 。一 。 ３ 末端扩增（３ ＲＡＣＥ） 用两个套合的ＰＣＲ完 成，即第一个锚定ＰＣＲ和一个Ｎｅｓｔｅｄ—ＰＣＲ，分别设 计三条引物，即３ＲＲＴ（用于锚定ｐｏｌｙＡ）：５－ＧＣＴＧＴ ＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧＴ 一３ ：３ＲＮＰ（用于Ｎｅｓｔｅｄ—ＰＣＲ） ５＇－ＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ．３ 和ＨＰＧＰ３（用 于Ｎｅｓｔｅｄ—ＰＣＲ）：５＇－ＧＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＣＴ ＴＧＡＣ－３ 。 以３ＲＲＴ和ＨＰＧＰ１为引物做第一轮ＰＣＲ，然后 将ＰＣＲ产物稀释１０倍，以ＨＰＧＰ３和３ＲＮＰ为引物 做第二轮ＰＣＲ，将ＰＣＲ条带回收，进行测序。 ５ 末端扩增（５ ＲＡＣＥ） 根据测序得到的中 间片段设计基因上的特异性引物（５Ｒ：５＇－ＧＡＴＣＡＣ ＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣ．３ ）进行反转录，醋酸钠 沉淀反转录产物，以去除反应体系中的酶，再用少 量ｄｄＨ Ｏ溶解。用末端连接酶（ＴＤＴ）在其３ 末端加 上ｐｏｌｙＡ。再以加过ｐｏｌｙＡ的ｃＤＮＡ为模板，以锚定 引物５ＲＲＴ（用于锚定ｐｏｌｙＡ）和５Ｒ进行第一轮扩增 ｆ５ＲＲＴ：５ 一ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｖ．３ １。将第一轮的ＰＣＲ产物稀释８ 倍，接着以基因上的特异性引物５ＲＮ和５ＲＮＰ（用于 Ｎｅｓｔｅｄ．ＰＣＲ）做第二轮ＰＣＲ（５ＲＮ：５＇－ＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴ ＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧ・３ ：５ＲＮＰ：５＇－ＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴ ＧＡＣＡＧＴＧ．３ ）。将ＰＣＲ条带回收，进行测序。 全长序列的生物信息学分析 蛋白质的功能 区由ＮＣＢＩ的保守结构域（ＣＤＤ）数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍ１）进行预 测。采用ＤＮＡＭＡＮ软件进行氨基酸多序列比对，比 对序列包括：『Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ中Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ蛋白［¨，Ｈ ； Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ由ＣＨＲＣ（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ）蛋白［１３１；Ｃｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ Ｍａｒｃ中ＣｉｔＰＡＰ蛋白 ； Ｐ＆ｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ中ＰＧ１（ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ１）蛋白Ｉ ； Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ中ＣＤＳＰ３４（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｏｕｇｈｔ－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白 ， ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ６４４ 水 生 生 在雨生红球藻含虾青素的球滴中发现了一个特异的 蛋白ＨＯＧＰ（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｏｉｌ Ｇｌｏｂｕｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ），这 个蛋白基因的转录水平与雨生红球藻在胁迫条件下 积累虾青素的量成正比【３ ｌ。大量文献证明雨生红球 藻虾青素的合成和积累分别存在于质体和胞质中， ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ中的ＨＰＧＰ蛋白和胞质中的虾青素球 滴的ＨＯＧＰ蛋白，可能分别是两个不同阶段的主要 结构蛋白，在虾青素合成过程的过膜阶段存在着功 能的对接。本文通过原核表达融合蛋白制备了ＨＰＧＰ 蛋白的特异性抗体，为今后进行免疫杂交实验和免 疫胶体金细胞内标记实验提供了基础。 参考文献 ［１］ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ，Ｋａｋｉｚｏｎｏ Ｔ＇Ｎａｇａｉ Ｓ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ａｃｅｔａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｓｔｃｅｌｌｓ ｏｆ ａ ｇｒｅｅｎ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌｒａ ａｌｇａ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．Ａｐ－ ｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，５９：８６７—８７３ 【２】 Ｂｏｕｓｓｉｂａ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｙｕａｎ Ｐ ｅｔ ａ１．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９９，２１： ６０１－－６０４ 【３】 Ｂｏｕｓｓｉｂａ Ｓ．Ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｈａｅｍａ— ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌ＆：ｃｅｌｌｕｌｒａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ［Ｊ］＿Ｐｌａｎｔ ＪＰ ｉｏｌｏｇｙ，２０００，１０８：ｌ１ １一ｌ１７ ［４】 Ｓａｒａｄａ Ｒ，Ｕｓｈａ Ｌ Ｒａｖｉｓｈａｎｋａｒ Ｇ Ａ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｒｔｅｓｓ ｏｎ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２．３７：６２３—６２７ ［５］ Ｗａｎｇ Ｍ，Ｌｉ Ｌ Ｌｉ Ａ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｌｉｇｈｔｉｎｇ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｎ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕ— ｖｉａｌｉｓ ＣＧ－１ １［Ｊ］＿Ａｃｔａ Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００９，３３（３）： ４００－－４０５［王铭，李涛，李爱芬，等．光照、温度和ｐＨ对 雨生红球藻光合特性的影响．水生生物学报，２００９，３３（３）： ４０ｏ＿一４Ｏ５】 【６】 ＧｒＯｎｅｗａｌｄ Ｋ，Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｊ，Ｈａｇｅｎ Ｃ．Ｋｅｔｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏ— ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｕｔｓｉｄｅ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ— ｔｒｙ，２００１，２７６：６０２３－－６０２９ ［７】 Ｇ￣ｎｅｗａｌｄ Ｋ，Ｈａｇｅｎ Ｃ．ｂｅｔａ・ｃａｒｏｔｅｎｅ ｉｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅｘｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃ— ｏｎｄａｒｙ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００１，１３（１）：８９—９３ 【８】 Ｃｏｌｌｉｎｓ Ａ Ｍ，Ｊｏｎｅｓ Ｈ Ｄ Ｔｊ Ｈａｎ Ｄ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｄｉｓ— ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ （Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）［Ｊ】．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１１，６（９）：ｅ２４３０２ 【９］ Ｇｒｉｉｎｅｗａｌｄ Ｋ，Ｈａｇｅｎ Ｃ．Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕ— ｖｉａｌｉｓ（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ；Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｏｔａｎｙ—Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ ＢｏｔａｎｉＬ ２０００，７４（３－４１：ｌ４１—１４４ ［１０】Ｓａｎｔｏｓ Ｍ Ｆ’Ｍｅｓｑｕｉｔａ Ｊ Ｆ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｈａｅｍａ— 物 学 报 ３６卷 ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓ（Ｇｉｒｏｄ）Ｒｏｓｔａｆｉｎｓｋｉ（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）．１．Ｓｏｍｅａ— ｓｐｅｃｔｓ ｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｌｏｇｉａ，１９８４，４９：２１５—２２８ ［１１］Ｄｅｒｕ６ｒｅ Ｊ，Ｒｏｍｅｒ Ｓ，ｄ，Ｈａｒｌｉｎｇｕｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｂｒｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｏｖｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｕｔｒｅｓ［Ｊ】．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９９４．６：ｌ１９—１３３ ［１２］Ｋａｔｚ Ａ，Ｊｉｍ６ｎｅｚ Ｃ，Ｐｉｃｋ Ｕ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｈｔ ｃａｒｏｔｅｎｅ ｇｌｏｂｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｌｇａ Ｄｕ— ｎａｌｉｅｌｌａ ｂａｖｄａｗｉｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９５，１０８：１６５７— １６６４ ［１３］Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙ Ｍ，Ｏｖａｄｉｓ Ｍ，Ｉｔｚｈａｋｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ－－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｕｃｕｍ＆ｓａ－－ ｔｉｖｕｓ ｃｏｒｏｌｌａｓ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｓｅ— ｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１０： ｌ１ｌ１一ｌ１１８ ［１４】Ｐｏｚｕｅｔａ—Ｒｏｍｅｒｏ Ｊ，Ｒａｆｉａ Ｆ，Ｈｏｕｌｎｅ Ｇ ｅｔ ａ１．Ａ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ，ＰＡＰ，ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｂｅｌｌ ｐｅｐｐｅｒ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐ ｉｏｌｏｇｙ， １９９７．１１５：ｌ１８５—１１９４ ［１５］Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ Ｏ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｈ，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ ＣｈｌｏｒｏＰ，ａ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐ－ ｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１ ９９９，８： ９７８—９８４ 【１６］Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｆ，Ｓｃｈｎｅｌｌ Ｄ，Ｂｌｏｂｅｌ Ｇ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓｏ— ｔｉｖｕｍ Ｌ．）ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ】．Ｐｌａｎｔａ，１９９９，２０８：１０７－－１１３ ［１７】Ｋｉｍ Ｈ Ｕ，Ｗｕ Ｓ Ｈ，Ｒａｔｎａｙａｋｅ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｈａｓ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｐｌａｓｔｉｄｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ— ｏｌｏｇｙ，２００１．１２６：３３０—３４１ ［１８】Ｂｒ６ｈ６１ｉｎ Ｃ，Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｆ’ｖａｎ Ｗｉｊｋ Ｋ Ｊ．Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ：ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｔｉｄｓ【Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７．１２：２６０—２６６ ［１９］Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｅ Ｖｉｄｉ Ｒ Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅ ｌｉｐｉｄ ｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ【Ｊ］． ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７， １０７：１５３—１７２ ［２０】Ｂｒ６ｈ６１ｉｎ Ｃ，Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｆ．Ｔｈｅ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅ：ａ ｂａｇ ｆｕｌｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｒｉｃｋｓ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００８．８４：１３８８—１３９４ 【２１］Ｓｉｎｇｈ Ｄ Ｋ，ＭｃＮｅｌｌｉｓ Ｔ Ｗ．Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｔｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｉｃｅｂｅｒｇ［Ｊ］？Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，１６（８）： ４３２—４４１ ［２２】Ｌａｉｚｅｔ Ｐｏｎｔｉｅｒ Ｄ，Ｍａｃｈｅ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｎａｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｌａｓｔｉｄ ｌｉｐｉｄ－・ａｓ－－ ｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｔｅ ｉｆｂｒｉｌｌｉｎ ｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４．３：１７－－２６ ［２３］Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇ Ａ Ｊ，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｊ Ｂ，ｖａｎ Ｗｉｊｋ Ｋ Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ．Ａ ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ． ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６．１４０：９８４—９９７ ［２４］Ｊｉｎ Ｅ，Ｌｅｅ Ｃ Ｇ Ｐｏｌｌｅ Ｊ Ｅ ｗ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａ— ｔｉｏｎ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｒｅｇｕ— ｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００６．１６：８２１—８３ １ ４期 范勇等：雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达 ６４５ ［２５］Ｖｉｄｈｙａｖａｔｈｉ Ｒ，Ｓａｒａｄａ Ｒ，Ｒａｖｉｓｈａｎｋａｒ Ｇ Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏ— ３３４—３３８ ［３２】Ｐｒｕｖｏｔ Ｇ Ｃｕｉｎｅ Ｓ，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｇ’ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒｏｕｇｈｔ・－ｉｎｄｕｃｅｄ ３４—－ｋＤ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｌａ・－ ｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌ￣ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］＿Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈ— ｎｏｌｏｇｙ，２００９，４５（２）：８８—９３ ［２６］Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ，Ｋａｋｉｚｏｎｏ Ｎａｇａｉ Ｓ．Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ，Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ，ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｋｏｉｄｓ ｏｆＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．［Ｊ】．Ｐｌａｎｔａ，１９９６，１９８：４７１— ４７９ ［３３］Ｇｉｌｌｅｔ Ｂ，Ｂｅｙｌｙ Ａ，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｇ ｅｌ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＳＰ３４，ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ ｉｎ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｐｌａｎｔｓ，ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＳＰ３４ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｅｔａｔｅ ｍｅｄｉａ［Ｊ］＿Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＦｅｒ－ ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９１．７１：３３５—３３９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＡＢＡ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９８．１６：２５７—２６２ 【２７］Ｌｏｍｂａｒｄｏ Ｍ Ｅ，Ａｒａｕｊｏ Ｌ Ｓ，Ｊｕｋｎａｔ Ａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ，ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ８－ａｍｉｎｏ－ ［３４】Ｆｒｉｓｏ Ｇ Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ Ｌ，Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇ Ａ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｎ—ｄｅｐｔｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅ ｔｔｈｙｌａｋｏｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ：ｎｅｗ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ａ ｐｌａｓｔｉｄ ｐｒｏ— ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｐｎｎ Ｂ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅ— ｍｉｓｔｙ，１９８８，９ｌ（ｒ２）：２７９—２８４ ｔｅｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ［Ｊ】＿Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２００４，１６：４７８—４９９ 【２８］Ｂｏｒｓｏｎ Ｎ Ｄ，Ｓａｔｏ Ｗ Ｌ，Ｄｒｅｗｅｓ Ｌ Ｒ．Ａ ｌｏｃｋ—ｄｏｃｋ ｉｎｇ ｏｌｉｇｏ （ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ５’ａｎｄ ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ［Ｊ］＿ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２．２：１４４—１４８ ［３５１ Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ，Ｇｅ￣ｎｅｒ Ｇ Ｌｕｆｆ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｙｅｓｐｏｔ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｎｄ ａｔａｃｔｉｃ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅ ２００６，１８：ｌ９Ｏ８—１９３０ 【２９】Ｆｅｈｒ Ｃ，Ｆｉｃｋｏｖ Ｍ，Ｈｉｅｍｋｅ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｅＤＮＡ ｅｎｄｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ—ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐ ［３６】Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ Ｅ．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｍ】．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．２００３ ｔｏ ｒ ｋｉｎａｓｅ ６：ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ５’一ａｎｄ ３＇－ｅＤＮＡ ｅｎｄｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰｒｏｔｏｃｏＩｓ，１９９９，３（３）： ２４２—２５１ ［３７］Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ Ｗ Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ［Ｍ］．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ（ＣＳＨＬ）Ｐｒｅｓｓ．２００１ ［３８］ｖｉｄｉ Ｐ Ａ，Ｋａｎｗｉｓｃｈｅｒ Ｍ，Ｂａｇｉｎｓｋｙ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｃｙ— ｃｌａｓｅ（ＶＴＥ１）ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎＥ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，２００６．２８１：ｌ１２２５一ｌｒ １２３４ ［３０］Ｆａｎｇ Ｃ，Ｍｋｒｔｃｈｉａｎ Ｓ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ｍ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉ ｍｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ ａｎｄ ５’一／３’－ＲＡＣＥ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｎｏｖｅｌ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ— ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２３（１）：５２—５８ ［３ １］Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｋｉｔａ Ｍ，Ｅｎｄｏ－Ｉｎａｇａｋｉ Ｌ ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｅＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ［３９］Ｐｅｌｅｄ Ｅ，Ｌｅｕ Ｓ，Ｚａｒｋａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｉｌ ｇｌｏｂ・ ｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｃｉｔｒｕｓ ｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］＿Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１ ９９８，１４４２： （Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）［Ｊ】． ｉｄｓ，２０１１，４６（９）：８５１—８６１ ＣＬｏＮＩＮＧ ＡＮＤ ＰＲｏＫＡＲＹｏＴＩＣ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＴＨＥ ＰＬＡＳＴＯＧＬＯＢＵＬＥＳ ＰＲｏＴＥＩＮ ＧＥＮＥ ＦＲｏＭ月 Ｅ ＣＤＣ Ｃ 【 咒 三 ＦＡＮ Ｙｏｎｇ ，ＹＵ Ｇｕａｎｇ．Ｘｉｎ ，ＷＡＮＧ Ｌｅ—Ｎｉ ，ＱＵ Ｆａｎｇ．Ｂｉｎｇ ，ＬＥＮＧ Ｌｉ ，ＬＡＮ Ｌｉ．Ｑｉｏｎｇ ａｎｄ ＱＩＮＧ Ｒｅｎ．Ｗｅｉ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６ １ ００６５，Ｃｈｉｎａ； ２．ＣＮＯＯＣＮｅｗＥｎｅｒｇｙＩｎｖｅｓｔｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００１６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｅｔ：Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｉｎ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｔｈｙｌａｋｏｉｄ ｓｐａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｆｏｒ ｍａｎｙ ｐｌａｎｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅ，ａ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ，ｗａｓ ｎｏｔ ｃｌｅａｒ ｉｎ ｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｙｅｔ ｕｐ ｔｏ ｄａｔｅ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｍａｎｙ ｏｓｍｉｏｐｈｉｌｉｃ ｇｌｏｂｕｌｉ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｕｎｄｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｄｉｉｅｄ ｆｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｏｓｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｃｌｅａｒｌｙ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｏｆ／４．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ．Ａ ｆｕｌ１．１ｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｉ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＣＥ （ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＤＮＡ ｅｎｄｓ）ｍｅｔｈｏｄ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ ｅＤＮＡ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐ１ａｓｔｏｇ１ｏｂｕ１ｅｓ ｉｎ ｍａｎｙ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｗａｓ ｔｅｒｍｅｄ ａｓ ＨＰＧＰ（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｉｓ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｓ・Ｔａｇｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｉｎｉｆｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ）．Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｒａｉｓｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｗ ｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｏｓｅ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ；Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ；Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕ１ｅｓ；Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ
