响应面法优化头孢菌素C发酵条件

Plackett-Burman方法对影响头抱菌素C发酵水平的11个因素进行考察，评估各因素的影响程度，筛查影响发酵水平的关键因素，

再采用响应面方法建立这些因素与发酵水平间的数学模型，为发酵条件的优化提供指导。结果 Plackett-Burman实验发现，金

鱼浸膏浓度和蛋氨酸浓度是对头抱菌素C发酵产量影响最显著的2个因素，经响应面方法优化后头抱菌素C的产量从32.59g/L提 高到了35.99g/L,提高了 10.4%。结论 合适浓度的金鱼浸膏和蛋氨酸可提高头抱菌素C发酵产量，通过统计优化方法，可有

效提高头抱菌素C发酵水平。关键词：头抱菌素C；顶头抱霉；Plackett-Burman设计；响应面法；发酵优化中图分类号：R97&1

文献标志码：AOptimization of the cephalosporin C fermentation using the response surface analysisLi Ning-hui, Li Lingand Jin Zhi-hua(School of Biological and Chemical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100)Abstract Objective To study the cephalosporin C fermentation by Cephalosporium acremonium, ascertain the key factors, and improve the production level through condition optimization. Methods The Plackett-

Burman design was applied to evaluate the influence of related factors and screen the key factors critical to the yield. The response surface methodology was used to construct one statistic model of how these key elements impact the cephalosporin C yield in order to guide the fermentation condition optimization. Results Of eleven factors investigated, tuna extract and DL-methionine concentration were identified as the critical factors. Based on the mathematical model between the two factors and the fermentation yield of cephalosporin C established by the response surface methodology, an optimal fermentation condition was obtained and the yield of cephalosporin C increased 10.3% from 32.5 to 35.946g/L. Conclusion The suitable concentration of tuna extract and methionine can improve the fennentation yield of cephalosporin C. With the help of statistical optimization methods, cephalosporin C fermentation yield was enhanced effectively.Key words Cephalosporin C; Cephalosporium acremomum\\ Pickett-Burman design; Response surface method; Optimization of fermentation头范菌素类抗生素具有抗菌活性强、抗菌谱广、

素全球已上市了 50多个品种，占抗感染药物市场的

50%,是目前世界上销售额最大的抗生素之一【2】。我

耐B■内酰胺酶、毒副作用小等优点，是临床治疗细

菌性感染的重要药物⑴。迄今为止，头抱菌素类抗生国自20世纪70年代生产第一代头范菌素产品以来，

收稿日期：2018-04-02基金项目：国家自然科学基金(No. 21386217)；浙江大学宁波理工学院教研教改项U(No. NITJG-201722)作者简介：李宁慧，女，生于1980年，硕士，工程师，主要从事微生物遗传及育种研究，E-mail: lnh@nit.net.cn

•通讯作者,E-mail: zhking@nit.zju.edu.cn响应面法优化头抱菌素C发酵条件李宁慧等已有40多种头抱菌类抗生素用于临床。而与全球市

场中头苞菌素类抗生素销售额逐渐减缓的趋势不

同，近年来国内头抱菌素类抗生素产品正处于快速

增长期，销售额年增长率超过30%,超过了国内医

药产品的平均增长速率，未来几年头抱菌素原料药 可能会出现更大竞争31。因此，关于头范菌素类抗

生素发现、生产和应用的研究方兴未艾。头砲菌素C(cephalosporin C, CPC)是顶头抱霉

(Cephalosporium acremonium)的代谢产物。虽然CPC 的抗菌活力低于青霉素G,但由于其毒性和过敏性

较低，可作为合成7-氨基头范烷酸的前体，生产多 种低毒、广谱和高效的新型头抱菌素类抗生素。因

此，不少学者对头抱菌素C的发酵条件研究，取得了 显著的成果4叽本课题组进行了头抱菌素C合成菌株 的筛选研究，获得了一株高产头抱菌素C的顶头抱霉；

由于该菌株的头泡菌素C产量显著高于已报道的菌株的 产量，对该菌株产头抱菌素C的发酵条件进行了研究，

以提高头抱菌素C的发酵产量，并丰富对顶头抱霉代谢

和头抱菌素C发酵研究的认识，为深入揭示顶头抱霉中

头抱菌素C的合成机理和调节机制提供信息由于影响顶头砲霉发酵生产头砲菌素C的因素较

多，为了不遗漏关键的因素，以及诸因素间可能的

交互效应，同时为了提高研究的效率，在实验中采

用了Plackett-Burman法和响应面方法进行了研究。

Plackett-Bunnan实验(以下文中简称PB实验设计)，能 从众多变量中快速筛选出重要的因素；响应面方法 (response surface methodology, RSM)能将实验设计和

数学建模综合起来，给出指标和因素的关系式，从

而得到准确有效的实验结论W近年来，PB实验设

计、RSM等统计优化方法越来越受到重视，在各行

业中得到广泛应用，尤其是微生物发酵条件优化的研 究中［'3-'6io本文从大量菌株中筛选出顶头抱霉高产菌

株，采用响应面法对头抱菌素C液体发酵中的各因素

进行考察及评价，在摇瓶中对头泡菌素C的发酵条件 进行了优化，为后续放大培养提供了可靠依据。1材料与方法1.1菌株与培养基顶头抱霉(Cephalosporium acremonium),实验室

低温保存。斜面培养基(g/L)：燕麦片24,麦芽糖10,酵母

提取物 1,琼脂粉20, Na2SO4 1, pH6.4o一级种子培养基(g/L)：黄豆饼粉30,金鱼浸 膏20,玉米浆7.5,蔗糖5,葡萄糖10, CaCO3 5,豆

.427.油0.1, pH7.0o二级种子培养基(g/L)：工业花生饼粉28,黄豆 饼粉28,金鱼浸膏20,玉米浆15,蔗糖25,葡萄 糖 10, CaCO3 5,豆油0.1, pH7.0o发酵培养基(g/L)：工业花生饼粉24,金鱼

浸膏20,玉米浆13, DL-蛋氨酸7,玉米粉20,果葡 糖浆35,工业小麦面筋粉38, (NH4)2SO4 8, CaSO』

12, CaCO3 34,豆油0.1, pH7.2»以上培养基lx IO：Pa灭菌30min。1.2实验方法1.2.1顶头胞霉菌的筛选取ImL的10%甘油砲子悬浮液稀释，分别取稀 释为10」、IO?和10\"的菌悬液各0.1 mL涂布于培养

基平板，28°C培养3〜4d至单菌落岀现，菌落长到

1〜2mm,挑选白色、菌落直径大、隆起高、没有裂

缝的单菌落接种一级种子培养液，在28°C, 190r/min 的摇床培养4d。取一级种子培养液，用生理盐水稀

释10倍，然后取ImL,加入二级种子瓶中，摇床培

养，转速：210r/min,培养温度：28°C,培养时间：

4d=取2mL二级种子培养液，加入含1.5mL豆油和

10mL的发酵培养基的摇瓶中，置于摇床培养，转

速：280r/min,温度：28°C,培养7d。取发酵液测定

头抱菌素含量，筛选高产菌株并保存备用。1.2.2头弛菌素C的液体发酵将筛选得到的高产菌株经活化后，分别接种于

一级、二级种子液中培养，取一定稀释倍数的二级

种子液接种至经PB试验设计的液体发酵培养基中，

于选定温度下，转速为280r/min的摇床培养7d后测定

培养基中头范菌素C含量。1.2.3头胞菌素C的浓度测定采用HPLC法测定问。发酵液中头砲菌素的提取：

用定性滤纸过滤发酵液，吸取ImL上清液，再加入4mL

甲醇和5mL纯水，充分摇匀，再取ImL与稀释液与9mL 纯水混合，摇匀后用0.22pm微孔过滤器过滤备用E】。

1.3头胞菌素C发酵培养基的优化1.3.1 Plackett-Bunnan设计筛选重要影响因素PB设计是一种二水平的实验设计方法，主要通

过对每个因素取高低两个水平，即以“+”、“-”分 析，低水平一般为原始水平，高水平一般为原始水平 的1.5倍左右，但主要还是视具体实验情况而定。它

以N次实验来考察最多N-1个变量，还应留足空项(或

称虚拟变量)用于方差分析。在N次的PB实验中，每个

变量的“高”、“低”水平分别出现N/2次，可计算

.428 .中国抗生素杂志2019年4月第44卷第4期出此因素的效应，当某个因素处于“高”、“低”水

Design-Expert &0软件对表4中数据拟合得到一个二阶

平时，其余因素均出现N/4次，其他因素的效用将正 数学模型，求解得到最高头抱菌素C产量最优化发酵 条件，由三维响应面图直观显示出优化结果。1.3.4验证实验负抵消而消除。对结果进行多元线性回归分析，并通

过F检验进行效应显著度的统计学检验”】。本实验考 察11个影响因素，余留4个空项，所以选用N=16的PB 试验设计，如表1安排实验，各代号对应的实际变量

对头抱菌素C产量的预测值进行实验验证，安排

在该预测之下的最优发酵条件，比较真实值和预测 值，确定优化结果。2结果与分析2.1顶头胞霉的筛选“ + ”、和水平相应的真实值见表2。1.3.2最陡坡试验最陡坡法也叫最陡(速)上升法(method of steepest

ascent),是一种多因素试验的设计方法。首先用正

从分离平板中选出了 18个白色、隆起高、菌落

直径大、没有裂缝的单菌落，编号1〜18,将单菌落 的一半准备接种到种子培养基中，另一半接种至斜 面培养基上保藏菌种。取对应的菌株编号转接到种子培养液中，再经

交试验查找最陡坡，使各因素水平的变动幅度与各

自效应的大小成比例；然后沿最陡方向即目标相应

升高方向安排一批试验点，根据响应目标对该效应

的敏感度确定步长，调节至实验指标最优化；最后 以最优点为中心安排实验阴，检验头抱菌素C发酵产

-级、二级种子液培养后转接至发酵培养基中，发

量的最高区域。根据PB实验结论，安排最陡坡实验 见表3。此法可明显减少实验次数，缩短实验周期。

1.3.3中心复合试验酵7d后取样测定头抱菌素C的含量。从甘油抱中筛

选得到一株顶头抱霉高产菌G3-7,发酵液中的头抱 菌素C含量达到32.59g/L。与已报道的多株产头抱菌

素C的顶头抱霉相比，该菌株的头砲菌素C发酵产量

中心复合试验设计(central composite design, CCD)

采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的模

较高9切，表明该菌株在代谢性能、特别是头砲菌素

C合成代谢途径方面，具有与已报道菌株不同的特

型切。通过最陡坡实验确定头抱菌素C发酵产量最高

区域后，选用中心复合设计对数据进行统计分析，

征，具有重要的研究价值。2.2顶头胞霉液体发酵条件优化研究具体实验设计如表4,各因素及其水平见表5。利用

表 1 Plackett-Burman 的实验与结果(N=16)Tab. 1 Experimental and results of the Plackett-Burman design for 16 trials试验ABCDEF-11GHI -1JKL■11MN0CPC 产量/(g/L)12■1-1-1-1-11J11-11-1-1-11-1-1-1-11-1-111-111129.07-1-11-111-1-1-1・1-111•1-126.757.7728.5820.27.33345・111■1-111-111-1111-1-1-1■1-1-111111・1-111-11-111167-1-111•11-11-1111-1・111-111・11-111・1-1-112.521011-1-1■1111111■111111・1-1-11131.7016.37-1・11-111•1-11-11111-1-1-111-111-11-132.35.9824.9433.8230.83■11・11■1-1-111■1■1-11112111-1■1-111・1-11■1-11-1-111・11131411■1-1・1-11-1111111-11111111-1-1-1-11-1-115161・1111-133.71111-11-11・1-134.48响应面法优化头抱菌素C发酵条件李宁慧等表2 Plackett-Burman设计各因素水平、效应Tab. 2 Levels and effect of variables for Plackett-Burman design水平编号名称低(-)高(+)效应阳验A金鱼浸膏/(g/L)203010.090.0004B蛋氨酸/(g/L)710.5-9.390.0005C温度/°C23273.700.0161D空项----E花生饼粉/(g/L)2436-2.620.0475F(NH4)2SO4/(g/L)8123.390.0215GCaSO4/(g/L)1218-0.410.6840H空项----I果葡糖浆/(g/L)3552.5-1.450.1932J装液量913.5-0.340.7280K接种量1.62.41.600.1582L空项----M玉米浆/(g/L)1321.5-5.300.0046NpH77.5-1.500.17950空项■---注：代表空项表3最陡坡试验设计及结果Tab. 3 Experimental design of steepest ascent and the

corresponding results试验金鱼浸膏/(g/L)蛋氨酸/(g/L)产量/(g/L)1207.027.842256.825.253306.634.744356.435.915406.232.5955.024.94表4中心复合试验设计及其响应值Tab. 4 Experimental design and the actual and predicted values

of cephalosporin C by CCD试验 金鱼浸膏(A)/(g/L)蛋氨酸(B)/(g/L)产量/(g/L)预测值/(g/L)1■1-131.8632.1321-132.9433.3331.414032.1131.6740-1.41434.2833.96501.41435.9035.536-1134.3634.6671132.5933.028-1.414032.2531.9990035.7635.82100036.0535.82110035.7135.82120035.9035.82130035.6635.82.429.表5中心复合设计因素变量及其水平Tab. 5 Levels and code of variables for CCD因素水平-1.414-1 011.414金鱼浸膏(A)/(g/L)27.9330 354042.07蛋氨酸(B)/(g/L)6」26.2

6.46.66.682.2.1影响顶头胞霉液体发酵的重要因素由表2中P值大小可知，金鱼浸膏和蛋氨酸浓 度是对头抱菌素C发酵产量有显著影响的重要因素： 前者存在显著的正效应，浓度需进一步增加；后者

存在显著的负效应，当前使用浓度过高，应适当降

低。玉米浆和花生饼粉浓度以及发酵温度也有一定 的影响，而培养基中的其它成分，如果葡糖浆等的

浓度以及pH值、装液量、接种量对发酵产量均无显

著影响。这说明对于高产菌株G3-7发酵产生头抱菌 素C的过程而言，金鱼浸膏和蛋氨酸是两种重要的

营养要素。金鱼浸膏的主要成份是鱼蛋白酶解而

成的短肽链，富含20多种氨基酸、多种B族维生素、 有机微量矿物质、牛磺酸和不饱和脂肪酸等物质，

不仅可以为菌株的生长和代谢提供氮源、维生素和 不饱和脂肪等营养要素，而且其中的有机微量矿物

质有助于提高菌体内相关代谢酶的活力，促进头抱

菌素C合成途径的活力，进而有助于头抱菌素C的合

成。本研究后期采用国内海产品加工厂废角料生产

的鱼精膏代替进口金鱼浸膏，两者相比，头抱菌

素C产量基本相当，但鱼精膏更加便宜。蛋氨酸在诱

导头抱菌素C的合成过程中不仅是硫的供应者，还有

一些其他重要作用，不能被其他化合物所取代，可能

原因包括：1)诱导扩环酶，环化酶，ACV合成酶等； 2)为合成头泡菌素C所需的半脫氨酸提供硫原子\"1。

因此，在后续实验中，对培养基中金鱼浸膏和蛋

氨酸的浓度进行了进一步的优化研究。2.2.2最陡坡试验为了保证响应面实验的顺利进行，首先采用最

陡坡实验法对金鱼浸膏和蛋氨酸浓度进行了搜

索，以确定存在极值的区域。根据表2中这二因素的

水平、效应值，确定其变化方向及步长进行最陡坡

试验，实验设计及结果见表3。显然，实验4的头砲菌素C产量最高，为35.91g/Lo

根据响应面CCD实验的设计原理，选取头抱菌素C液

体发酵的最优发酵条件即第4组实验为中心点设计。 2.2.3响应面法优化实验条件根据最陡坡实验，响应面变量逼近最大产量区

.430.中国抗生素杂志2019年4月第44卷第4期域，以最陡坡实验中的4号配方为中心点用中心复合 6.52g/L时，头抱菌素C的产量为35.99g/L。图1是金

法设计试验，设计成2因素5水平，表4是2因素的编 码及取值，表5是试验设计及其响应值。根据实验结果，利用Design-expert 8.0软件,二 次多项式回归得到的二次经验模型为：头抱菌素C的

鱼浸膏和蛋氨酸影响头抱菌素C产量的响应面图及

等高线。在已有对顶头抱霉发酵制备头抱菌素C的研究

中，研究者发现对发酵水平存在显著影响的关键因 素为碳源、氮源和磷源等因素。虽然表2显示蛋氨酸

浓度呈现负效应，但其原因在于培养基中添加的蛋 氨酸浓度较高(10.5g/L),因为在前期单因素优化研 究中发现，添加蛋氨酸可以显著增加头抱菌素C的发

产量(g/L)=35.82-0.1 M+0.56B-0.7 MS-1,99/42-0.54B2 o模型整体方差分析(表6)表明：F值为41.532, P<0.001,

说明模型是成立的，有统计学意义。模型决定系数为 0.967,说明响应值的变化96.7%来源于所选因素，

模型拟合良好。此外，方差分析中的变异系数、信噪

比均反映数据合理，模型的可信度高，可重复性好， 精确度高，能准确地反映实验结果。因此可以认为该

酵水平。之所以在PB实验中蛋氨酸浓度过高，这可

能与多因素之间的交互效应有关。经最陡坡实验和

响应面方法建模，表明在培养基中添加6.5g/L的蛋氨 酸有助于头电菌素C的合成，与文献报道用量基本一

经验模型可以用来预测头范菌素C发酵产量。对拟合 的方程求解得：当金鱼浸膏为34.32g/L、蛋氨酸为

致u叽蛋氨酸的主要生理作用是提供一碳单位，参表6二次模型回归方程系数的方差分析Tab. 6 Regression coefficients and their significance of the quadratic model来源模型平方和自由度均方F值P值32.755940.0985742.4653272.030625516.5511880.09857441.532660.62493115.6294712.87358175.075212.7318813.31252<0.00010.45520.0055A■金鱼浸膏B-蛋氨酸112.4653272.030625ABA20.00<0.00010.009127.615632.0082741.1041511.0036310.100521127.61563B2残差失拟2.0082740.1577360.3345440.02513734120.0151纯误差Cor Total注：空白代表没有数据33.860096.606.503③

姿滌6.40划m

6.306.2030.00

32.00 34.00 36.00 38.00 40.00A：金鱼浸膏/(g/L)

图1金鱼浸膏和蛋氨酸影响头砲菌素C产量的响应面图及等高线Fig. 1 Surface and contour plots of mutual-influence for tuna ottelia alismoides concentration and DL-mertioninon the yield of

cephalosporin C production响应面法优化头抱菌素C发酵条件李宁慧等与核酸等多种物质的合成，并且具有抗氧化功能。因

此，蛋氨酸有可能通过提供一碳单位的作用，参与头

抱菌素C的合成或其，此外，蛋氨酸中还含有硫

元素，这也可能是蛋氨酸影响头范菌素C合成的一个

原因。桑美纳等E在进行头苞菌素C补料发酵优化研究 中，之所以选择硫酸鞍而不是氨水，其原因在于前者

不仅可以提供氮源，而且还能为CPC合成提供硫源。

因此，蛋氨酸增加头抱菌素C发酵的产量的原因一方 面可能与其提供的一碳单位有关，另一方面还与其提

供的硫元素有关。但具体机制有待进一步研究。2.3优化后发酵培养基结果检验在此条件下验证该实验的可靠性，选择最优发 酵条件，以此条件重复实验3次，头砲菌素C的平均

产量为35.946g/L,与理论预测值较为接近，误差小

于5%。验证证明该模型能较好地预测实际发酵情 况，可应用于顶头抱霉发酵条件优化。优化后头抱

菌素C的产量较优化前提高了 10.4%。3结语利用自然筛选的方法分离顶头抱霉菌的策略，

分离得到一株高产头抱菌素C的菌株，在培养基中添 加蛋氨酸可增加该菌株的头砲菌素C合成，产量达到

32.59g/Lo采用PB设计方法及响应面法相结合的实验

设计方法对头泡菌素C液体发酵培养条件优化，优化 后的发酵培养基配方为：金鱼浸膏34.32、DL-蛋氨 酸6.52、花生饼粉24、玉米浆13、玉米粉20、果葡糖 浆35、工业小麦面筋粉38、(NH4)2SO4 8、CaSOJ2、

CaCO3 34.豆油0.1, pH7.2,在此条件下的头范菌素

C产量达到了35.99g/Lo实验表明，响应面法对于缩

短头砲菌素C液体发酵试验周期，减少实验次数都有 很的作用。此法求得回归方程精度高，可考察各因

素间的交互作用，是研究初期优化加工条件、降低开

发成本、提高产物产量等实际问题的一种有效办法。参考文献[1] 李洁云，顾觉奋.第5代头砲菌素类抗生素的研究进展和

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