绵羊卵巢组织石蜡切片

姜晓龙陈建伟姚晓磊赵妙妙吕丽华

（山西农业大学动物科技学院山西太谷 030801 ）

【摘要］为观察绵羊正常卵巢组织的形态结构， 采用苏术精一伊红 （hcmatoxylirrcosi n, HE）染色法制作绵羊卵巢

组织石蜡切片。结果显示，在切片制作过程中存在的问题主要包括染 色不均、染色对比不明显、过度染色、染色过浅 和切片出现斑点等。在试验过程中可通过充分分化、蓝化、充分水洗 等因素的控制来提高切片的染色效果，该方法 可为动物卵巢及卵泡染色切片制作提供技术指导。

关键词:绵羊；HF染色;卵巢;切片;优化

HF染色法是石蜡切片技术中常用的染色法。苏术精 碱性染液可使细胞核内染色质与胞质内核糖体着蓝紫色 ；伊 红酸性染料可使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，作为 组织学、月王胎学、病理学教学与科研中最基木的技术方法而 被］'一泛使用川

木试验通过HF染色技术制作石蜡切片，该方法是一种多步骤、 多因素决定的过程，在试验中由于操作不当，经验不足，以及实践的 使用和时间的掌握等诸多因素影响，出现切片脱落、染色不均匀、糊 不清、褶皱，及细胞核和细胞质对比不明显等现象，从而影响使用效 果。HF染色切片制作过程中出现的问题进行了探究，并提出解决方 案，这对相关的试验操作具有指导意义。 1材料与方法 1. 1试验材料

木试验选用山西省清徐县屠宰场成年健康母羊，屠宰后 取卵巢。 1.2主要试剂和仪器

Youin氏固定液、包埋纸盒、染色缸、融蜡箱、切片机、恒温箱、 载玻片、小烧杯、吸水纸、移液枪、盖玻片、石蜡，1%盐酸水溶液、 0.500伊红（水溶性）溶液、各梯度的乙醇、二甲苯、苏术精染液、伊 红染液、中性树胶、蒸馏水。 1.3试验方法

1.3. 1绵羊卵巢的处理：将卵巢投入预先配好的固定液中（1000福尔马 林，Youin氏固定液等），使组织蛋白质变性并防 I I几细胞死亡后自溶或细菌分解。

1.3.2脱水透明：用低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织中的 水分，再将组织块置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒 精，才能浸蜡包埋。 1.3.

3浸蜡包埋:

将透明处理的组织块置于熔化的石蜡中， 保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。

放入熔蜡箱

1.3. 通切片与贴片:将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为｝八-8 pm薄片。切卜的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载 玻片上，放朽。C恒温箱中烘干川。

1.3脱蜡染色：染色前，用二甲苯门）脱蜡5min,入二甲苯UI｝中脱蜡 10min，用吸水纸吸干液体；入100%乙醇U）smin，入100%乙醇门1） 5min，用吸水纸吸干液体；入9500乙醇3 min并过流水2 min，用吸 水纸吸干水分。苏术精染色｝ A-8 min，并用1%盐酸水溶液分化5｝-10s， 自来水洗返蓝15A-30 min;0. 500伊红（水溶性）染色30 s,95%乙醇门脱 水5 min，用吸水纸吸干液体;95%乙醇门1）脱水5 mln，用吸水纸吸 干液体入 100%乙醇门｝6 min,100%乙醇｝ll｝ 2 min,用吸水纸吸干液体 入二甲苯＜1）中透明2A-3 min，二甲苯CII）中透明5 min。用移液枪 吸取适量中性树胶于载玻片上，盖上盖玻片待凝固后观察结果。 2结果与分析 2. 1正常染色

经显微镜观察，正常 HF染色切片见图1-A,I-B。图1-A可见卵 巢上有腔卵泡的存在，图1-B可见卵巢卵泡颗粒细胞（GCS、内膜细 胞CTC）的细胞核呈蓝紫色；而周围的细胞质、纤维被染成粉红色，切 片染色均匀无褶皱，细胞核和细胞质对比明显。 2.2染色异常

在切片制作尤其是染色过程中常会出现染色异常情况，从而影响 了正常的组织形态观察。图1-C显示细胞核染色苍白、暗淡，细胞核 与细胞质染色对比度差。出现这类问题有三种原因：切片在苏术精染 液停留时间太短；苏术精染液过度氧化，失去染色能力；分化步骤处理 时间过长。可进行切片重新染色。如果组织在酸性固定液Zenkcr,Bouin 及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加 其在苏术精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善 细胞核的着色。

图1 - I｝显示细胞核过染，核膜、核仁等不清晰，细胞质含有大 量的苏术精，导致细胞核与细胞质比例失调。这主要是由于在染色过 程中切片在苏术精染液停留过长、切片太厚、分化步骤时间太短，造 成苏术精染液大量分布而占据细胞质位置。通过显微镜上卜微调观 察，如果只有1 ｝- 2层细胞核层次，说明不是因为切片太厚，可经脱 色、漂白、重新染色，对染色和分化时间做些适当的调整。若是由于 切片太厚导致的细胞核过染，则需要重新切片。

图1-F显示细胞核呈红、棕色改变。这主要由于苏术精染色液过 度氧化和切片在苏术精染液染色后返蓝不足。提示染色之前检查苏术 精染色液的染色能力，发现氧化过度应及时更换 ；同时，可用流水、 温水或弱碱性溶液如稀氨水、0.200碳酸氢钠溶液等在苏术精染色后， 给切片足够的蓝化时间。

图1-F显示伊红着色淡，切片中央区域伊红染色不均匀，可能为 弱碱性溶液残留导致伊红拒染；也可能是蓝化液残留过多、切片太薄， 或

切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。因此，在染色前应检查伊 红染液的pH值，必要时可用乙酸将pH调节在｝. 6-5. 0之间。在脱水 时切片在低浓度乙醇停留时间不可过长，低浓度乙醇会将伊红的颜色 分。 化掉

图1-G显示细胞质过染，分色不足，这是由于伊红深染导致细胞 核与细胞质没有层次，缺乏对比。提示在染色前适当稀释伊红染液， 减少伊红染色时间；切片在乙醇脱水步骤时，停留时间要相对均匀。 图1-H显示切片中出现蓝黑色沉淀物，这主要是试验中使用的苏 术精染液没有过滤处理，导致苏术精染液中的金属膜熟附在玻片上。 建议使用半氧化苏术精染色液，如Gill苏术精染液，可以避免金属膜 的产生。

图1-1可见切片内有大量水珠或云雾状改变， 这是梯度乙醇处理 后没有完全脱水造成的，因此，所有用于脱水和透明的液体，在使用 一定时间后应及时更换。

图1-J显示由于组织切片脱蜡不彻底或分化液浓度过大、分化后 没有迅速入水终i1=分化，导致切片染色不均，出现“阴阳脸”，出现 这种情况需要重新取材制作切片

图1-K显示镜检时切片中出现大片白色斑点，这是由于脱蜡不彻底， 染色液因石蜡斑点的残留不能渗透组织着色。 因此，脱蜡时切片在二 甲苯中停留时间相对延长或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色。

图i需羊駅JIE礪色■卷跆果

3讨论

在研究雌性动物繁殖性能中，卵巢组织切片是较常用的用于了解 动物卵巢结构与其年龄特征、生理功能、细胞凋亡、蛋白表达相关的 常规技术。常青等(2001)为观察早期老年大鼠使用外源雌激素后卵巢 结构及功能的变化，通过建立早期老年大鼠模型，采用放射免疫法测 定使用外源雌激素后外周(fi.液中促卵泡素(FSH)、促黄体素((LH), 雌二醇(E})及辜酮(丁)水平，并通过卵巢组织切片观察卵巢结构的改 变。

结果

发现，早期老年大鼠应用雌激素后外周血 FSH明显降低，F水平明显 上升，丁水平明显降低；同时卵巢门细胞减少，卵巢基质相对增生。 土朝清等(2006)为探索家兔卵巢典型结构与其年龄的关系，选取不同 年龄段的家兔卵巢，常规石蜡切片， HE, Vna}icson和PAS染色，镜 检并计数各级卵泡。

结果表明，2月龄的家兔卵泡开始发育，随年龄的增长发育程度逐 渐增强。} }- 5月龄卵巢的皮质、髓质分界清楚，未见黄体、闭锁

卵泡及间质腺，发育中卵泡由周围向中央排列，与人的卵巢结构较为 相

似。7}-8月龄卵巢结构呈性成熟状态，卵巢髓质随着家兔月龄增 长间质腺逐渐增多川习。陈华絮等(2007)针对常规石蜡切片制作步骤 琐、耗时长，试验中所用二甲苯对人体有较大危害的缺点，探讨提咼 兔卵巢组织石蜡切片质量的制作方法，研究从脱水和透明环节进行技 术优化，用正J醇与无水乙醇混合溶液取代常规的脱水剂和透明剂。 该混合液具有较好的脱水和透明作用。 镜检结果表明，卵巢组织结构 清晰可辨、对比度好、层次分明，组织切片镜检效果良好，具有工序 简单、质优、省时和实用性较好等优点〔’2习。杨轩(2009)对家兔 卵巢石蜡切片HF染色过程中影响因素进行了研究，在试验过程中通 过改变条件进行比较试验，重点分析了染色过程中温度、时间、切片 厚度等因素对镜检效果的影响。

木研究通过对绵羊卵巢组织切片的制作， 并通过镜检效果重点对影 响HF染色的因素如切片厚度、染液pH值、染色时间、分化、蓝化等 进行分析探讨，对试验中影响镜检效果的相关因素进行了解决并加以 优化，这对相关动物卵巢常规切片的制作具有一定的指导意义。

参考文献

C1〕刘ill_新.实用生物组织学技术〔M].北京科学出版刹_,2004,03. 口〕汪谦.现代医学实验力法〔M].北京人民卫生出版刹_,1998,06. [3〕刘桂芝.石蜡切片标本的制作过程CJ}.通化师范学院学报，2004,

26C11):90 --103.

以〕王满贯.HE染色切片的技术操作规范〔J}.大同医学专科学校学 报，

2004, C2):2L 一 25.

[5J朱有华.浅谈石蜡切片HE染色〔J}.诊断病理学杂志，1997,4 C2}:111

一 LL2.

}6〕王风琴，孔佑华.浅谈HE染色切片着色浅的原因以及改进力法

U}.济宁医学院学报，2006,29(1):11.

叮〕李成，贾维民，张希国.石蜡切HE染色着色小良的原因及矫正力 法

〔J}.内蒙古医学院学报，2006,28(12):223一 224.

邝〕田玉旺，李琳，朱}1:艳.常规HE染色易出现的问题、原因及解 决

力法〔J}.诊断病理学杂志，2008,1}(6):}00-}-X02.

[9]曹书芬，国宏莉，张丽，等.石蜡切片HE染色力法的改进〔J}.郧 阳医

学院学报，2007,26(5)308.

C10〕常青，徐惠成，史常.雌激素对老午早期大鼠卵巢结构及功能的

影响〔J}.第三军医大学学报，2011,23(11):128三-}-1286.

X11〕王朝清，李瑞华，喇慧，等•家兔卵巢结构的午龄特征〔J}.新乡 医

学院学报，2006,23(1):4一 47.

C12y冻华絮，杨素娇.兔卵巢组织石蜡切片技术的改良〔J}•生物学杂

志，2007,240):i9 — 60.

C13〕杨轩•家兔卵巢石蜡切片HE染色影响因素的研究CJ}.安徽农

学通报，2009，1}(1):40 一 41.