实时荧光定量PCR技术的原理及应用

在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

1. 实时荧光定量PCR技术的基本原理

在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数 。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧

光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。（如图1所示）

（图1）

1.1数学原理

PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以用下式表达：

Yn=Yn-1· (1+Ex) = Yn-2· (1+E)2=…= X·(1+Ex)n （ 0≤Ex≤1 ） 其中Ex表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1表示n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增。实时荧光定量 PCR就是在PCR扩增的指数扩增期来测定起始模板的分子数量。

在实时荧光定量 PCR反应中 Rn =RB+XO(1+Ex)n RS,也就是说第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分

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子数量XO的乘积。当循环次数n = Ct时，则有RT=RB+XO(1+Ex)CtRS。两边取对数，得log(RT -RB) = logX0 + Ctlog(1+ Ex) + logRs。整顿此式，得

Ctlog(1+Ex)=-logX0+log(RT-RB)–logRs 则

而对于每一个特定的PCR反应来说，Ex、RT、RB和RS都是常数，因此上式可以表示为：

Ct=-klogX0+b

即Ct值与log X0成反比，也就是说，Ct值与起始模板拷贝数(X0)的对数成反比。因此，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。所以，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数（如图2所示）。

（图2）

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1.2化学原理

实时荧光定量 PCR 的化学原理包括使用探针和荧光染料两种，探针是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，后者是利用荧光染料来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。 1.2.1 TaqMan荧光探针

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸序列，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步（如图3所示）。

（图3）

1.2.2 SYBR Green I荧光染料

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SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。而由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。

2. 实时荧光定量PCR技术的定量方法

实时定量PCR大致分为两类,即绝对定量与相对定量。绝对定量(Absolute Quantification，AQ)：指的是用已知浓度的标准样品来推算待测样本的绝对拷贝数。相对定量(Relative Quantification，RQ)：指的是在一定样本中待测样本相对于另一参照样本的量的变化。 2.1绝对定量

2.1.1单一的外参照法

单一的外参照,即只用外标准品构建标准曲线,测得目的基因的量在标准曲线上有一个

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对应的值,检测结果的报告方式是目的基因的拷贝数。该法是最早使用的绝对定量方法,但由于对各样本的个体差异及反应体系无法监控,对造成假阴性的结果也无法控制,因此该方法目前已较少使用。

2.1.2外参照+非竞争性内参照(管家基因)法

外参照+非竞争性内参照(管家基因) ,该法一方面利用标准曲线实现了准确定量,另一方面应用内标管家基因来标化结果并补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程造成的目的基因拷贝数的变化,故结果比第一种绝对定量更可信。另外通过PCR反应条件的优化使目的基因具有最佳的扩增效率,并与内标管家基因扩增效率尽可能相同,但此方法的缺点是成本较高。 2.2相对定量

2.2.1标准曲线法

首先要制备标准品,包括目的基因的标准品与内参基因的标准品。标准品可以不知道准确拷贝数或浓度,但必须准确地倍比稀释,一般为10倍倍比稀释制成标准曲线,样品与内参的基因表达量根据标准曲线得出,并用内参进行均一化,即将目的基因的数量(微克、纳克或拷贝数)除以与之相应的内参基因数量。另外还要选定一个用于表达差异分析的参照体系。假定目的基因在参照体系中的表达量为1×,那么目的基因在其他情况下的表达量以相对于参照体系的n倍表示。该方法是目前应用较多的相对定量方法,当标准品内参照因子与目的基因扩增效率不同时可用该方法进行相对定量。

2.2.2比较2-ΔΔCt法

该方法所用公式如下: Xn = Xo×(1+ Ex) n ①, Xn是第n个循环后目标分子数, Xo是初

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始目标分子数, Ex是目标分子扩增效率, n是循环数; Xt =Xo×(1 +Ex) Ct, x = Kx②, Xt是目标分子达到设定阈值时的分子数, Ct, x是目标分子扩增达到阈值时的循环数, Kx是一个常数;内参也有同样的公式: Rt =Ro ×(1 + Er) Ct, rt = Kr③,用Xt除以Rt得到: Xt/Rt =Xo×( 1 + Ex) Ct, x /Ro×( 1 + Er) Ct, r = Kx/Kr= K④,假设目标序列与内参序列扩增效率相同Ex = Er = E,则Xo /Ro ×(1 + E) Ct, x-Ct, r = K⑤,或Xn×( 1 + E)ΔCt = K⑥。Xn表示经过均一化处理过的初始目标分子量,ΔCt表示目标基因和内标基因Ct值的差异(Ct, x - Ct, r) 。整理上式得: Xn= K×(1 + E) -ΔCt ⑦。最后用任一样本的Xn除以参照因子的Xn 得到: Xn, q /Xn, cb = K×( 1 + E) -ΔCt, q /K×( 1 +E) -ΔCt, cb = ( 1 + E) -ΔΔCt ⑧。这里-ΔΔCt = - (ΔCt, q-ΔCt, cb) 。如果对反应条件进行优化使扩增效率接近1,那么目标分子经均一化处理后相对于参照因子就是:总目标分子=2 -ΔΔCt。公式⑧中参照因子的选择是根据不同的实验类型确定的,其应用有以下3种情况: (1)某种处理方法对基因表达的影响,将未经处理的样本表达量设为1×,那么可得到经某种方法处理后的样本相对于未处理样本的基因表达差异。(2)检测基因在不同时间的表达差异,假设某基因在某时刻(可设为0时刻)的表达量为1 ×,则可比较基因在其他时刻的表达量相对于其在0时刻的表达量的变化。例如,细胞在不同周期内某基因表达量的变化。(3)比较基因在不同组织中的表达差异,将用作参照的组织中目的基因表达量设定为1×,那么目的基因在待测组织中的表达量用相对于参照组织的N倍表示。例如,APR L基因在肿瘤组织中的表达量是其在正常组织中表达量的多少倍。该方法的优点是不需要标准曲线,但其公式的应用要满足两个条件: (1)目的基因与内参要有相同的扩增效率, ( 2)要使扩增效率达到最佳(接近100% ) ,主要通过一系列反应体系与条件的优化来实现。由于不同的扩增效率会导致该方法结果的错误,因此该方法必须检测扩增效率是否一致,方法是以系列稀释的cDNA浓度为横坐标,以ΔCt为纵坐标作图,如果直线斜率的绝对值小于0. 1则该法方可使用。

2.2.3 Pfaffl法

Pfaffl法也是用公式来计算基因相对的表达量,相对的表达量由未知样本和内参基因

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(管家基因)的E值和Cp值(同Ct值,在不同仪器中表示不同,意义相同)推导出,公式为: ratio = E targetΔCp target(control-sample)/ErefereΔCp reference ( control-sample) , Etarget为目的基因的扩增效率, Erefere为内参基因的扩增效率,ΔCp target为参照体系中目的基因的Cp 减去待测样品中目的基因的Cp,ΔCpref为参照体系中内参基因的Cp减去待测样本中内参基因的ΔCp。参照体系就是预先假定目的基因在其表达量为1×的体系,那么目的基因在其他体系的表达量为相对于参照因子N倍。利用可在Excel中运行的相对表达软件(RESTZ )可对数据进行自动分析。RESTZ 利用随机区组设计资料的两两比较使实验结果更具意义,并同时显示所选的参照基因是否适合该实验。

2.2.4 Liu and Saint法

该法首先通过仪器的软件( PE Applied Biosystems)根据公式Rn =Ro×(1+E) n (Rn为n个循环后的荧光值, Ro为初始荧光值)模拟出在PCR指数扩增早期的动力学曲线。因为随着反应的进行,反应体系的各成分的消耗将影响目的片段的扩增,所以将指数扩增早期的动力学图形用于分析结果更加可信。通过PCR的动力学曲线得出扩增效率E值: E = (Rn,A /Rn,B)-(Ct,A2Ct,B) -1 (Rn, A、Rn,B为在扩增曲线上任意A、B两点的阈值的Rn) 。通过该公式可直接得出各不同扩增反应的E值。最后根据E值推导出其相对于参照因子(即1×)的表达公式: Rn, b /Rn, a = ( 1+E) -ΔΔCt (Rn, b、Rn, a是待检样本a、b经过公式: Ro, t/Ro, r =(1 + E)ΔCt标化后的Ro,ΔCt = Ct, r-Ct, t, -ΔΔCt为待检样本a、b的ΔCt的差值) ,该公式在定量的同时标化实验结果。作者还将该法与标准曲线法、2-ΔΔCt法同时进行比较,结果表明:该法比“标准曲线法”更简单、省时,比“2-ΔΔCt法”更准确、可靠。因为使用者可根据模拟的动力学图形确定PCR过程的指数增长期并将其应用于计算。

2.2.5 Q2基因法

Q2基因是通过两种不同的数学公式用标准误来计算基因表达的均值,两种公式都需要校正扩增效率,计算得到的表达量再与其匹配的组进行比较从而得到样本相对于参照因子

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(假定表达量为1×的样本)的表达量。该方法还包括一些统计学分析,如,配对t检验、非配对t检验、u检验、Wilcoxon配对法、Personp’s相关性分析等从而全面评价实验结果的重要意义。利用可在Excel中运行的自动处理程序Q-Gene软件高通量地处理复杂的定量PCR实验,可优化实验方案、资料分析、数据处理,还可保证实验的高重复性,加快了实验的进程。

2.2.6Gentle法

该法是不用标准品曲线计算样本与对照品倍比变化的公式之一,在PCR过程指数增长期通过计算荧光量的变化来计算每个样品扩增效率,通过将对照品与样本一起作图,两图形间的垂直距离表明样本与对照品的表达差异,而图形的斜率表示其扩增的效率。

2.2.7Amplification plot法

该方法用一种简单的算法来计算每个样本的扩增效率,得到的数据用于表达量的计算。为简化数据的处理, Peirson等开发了相关的软件DART-PCR(Data Analysis for

Real-Time PCR) ,该软件可根据SDS1. 7软件得出的原始数据快速计算出Ct值、E值及Ro。该法的优点是提供一种手段,可依赖自身反应动力学的分析使PCR数据处理流水化操作,以使实验过程自动化,由于不需标准曲线可省去手工标准品制备的繁杂过程。

3. 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面： (1). DNA

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或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi基因失活率的检测等。 (2). 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证。(3). 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用

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