酱香型大曲酶系与大曲中微生物产酶关系的研究

王晓丹;胡宝东;班世栋;肖蓓;邱树毅

【摘 要】Jiangxiang Daqu, produced by wheat, is a block starter containing a variety of fungi and enzymes. With the deep exploration of Ji-angxiang Daqu, people know more about Jiangxiang Daqu gradually. The

importance of Daqu enzyme system has been highlighted. A large amount of enzyme is produced by microbial metabolism in Daqu. Accordingly, there is surely a direct relation between Daqu enzyme system and microbes in Daqu. In this experiment, the activities of acidic protease, glucoamylase, cellulase, pectinase, lipase in enzyme system in Ji-angxiang Daqu were measured. Enzyme production test was carried with 48 bacteria strains and 35 fungus strains which were screened from Ji-angxiang Daqu, and the varieties and the activities of the produced enzyme were

determined at the same time. The results suggested that, all the screened bacteria strains and fungi strains could produce enzyme, and strains with high-yield of enzyme could be used for the preparation of in-tensified Daqu. The physiochemical indexes of Jiangxiang Daqu could indirectly reflect the relation between Daqu enzyme system and the mi-crobes in Daqu. This study provided theoretical evidence for the optimization of Daqu-making techniques and the preparation of intensified Daqu.%酱香型大曲是以小麦为原料制成的含有多种菌类和酶类的曲块.随着对酱香型大曲研究的深入,人们对酱香型大曲的认识也在逐渐加深.酱香型大曲酶系的重要性也就凸显出来.酱香型大曲中微生物代谢产生大量的酶,酱香型大曲酶系和大曲中微生物必定存

在着直接的关联性.本实验对酱香型大曲酶系中酸性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶进行活力测定,对从酱香型大曲中筛选出的48株细菌和35株霉菌进行产酶试验,并对产酶种类、酶活大小进行测定.筛选出的48株细菌和35株霉菌大都可以产酶,产酶量高的菌株可以用于强化大曲的制备.酱香型大曲的理化指标也间接反映了酱香型大曲酶系和大曲中微生物产酶的关系.研究酱香型大曲酶系和大曲中微生物产酶关系为优化制曲工艺和制备强化大曲提供了理论依据. 【期刊名称】《酿酒科技》 【年(卷),期】2015(000)009 【总页数】7页(P1-7)

【关键词】酱香型大曲;酶系;微生物产酶;理化指标 【作 者】王晓丹;胡宝东;班世栋;肖蓓;邱树毅

【作者单位】贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025 【正文语种】中 文

【中图分类】TS261.1;Q93-3;TS262.3;TS261.7

大曲是以小麦、大麦、豌豆等为原料制成的形状较大且含有多菌酶类的曲块［1］，主要是由物系、菌系和酶系三部分构成。酱香型大曲是典型的高温大曲，原料小麦经过润料、磨碎、拌料踩曲、堆积培养、出房贮存形成酱香型大曲。酱香型大曲制作过程中利用微生物产生的酶系进行庞大和复杂的生化反应。根据原料以及催化功能，可以将其分为液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶、果胶酶、植酸酶、脂肪酶、酒化酶、酯化酶、漆酶等酶类［1-2］。 由于大曲中微生物的多样性，在大曲培养成熟的过程中微生物可以产酶，并进一步降解发酵时的原料以促进利用［3-4］。对于酱香型大曲中产酶微生物的研究，目前主要集中在细菌和霉菌，并都是对单一酶活的研究［5-6］。一般而言，液化酶和蛋白酶主要是由细菌和霉菌产生，而糖化酶主要是由霉菌产生［7-8］。酱香型大曲酶系不仅仅影响到白酒中酿造微生物的代谢，同时也和白酒中风味物质的生成和风格特征的形成有着密不可分的联系。原料小麦中的淀粉和蛋白质在酶系作用下生成的还原性糖和氨基酸可以发生美拉德反应，生成的物质形成了白酒中呈香物质的前体物质，原料中脂肪被酶系分解生成了甘油和脂肪酸，影响着酱香大曲中的酸度，而酸度的变化影响着大曲中微生物的代谢。本实验对酱香型大曲的酶系和大曲中主要优势微生物产酶进行对比，从制曲过程的产酶种类、酶活大小等方面研究酱香型大曲的酶系和微生物产酶的关系，同时测定大曲的理化指标，为优化酱香型大曲制曲工艺和制备强化大曲提供理论依据。 1.1 材料

从某酱香型酒厂曲房采样，酱香型大曲1#：新制曲；酱香型大曲2#：储藏3个月曲；酱香型大曲3#：储藏6个月曲；酱香型大曲4#：混合曲，混合曲是储藏3个月陈曲和储藏6个月陈曲按照比例粉碎混合后直接进入发酵生产的曲。 1.2 大曲理化指标测定方法

大曲的酸度、淀粉、水分、还原糖、氨基酸态氮、发酵力和酯化力的测定方法参照

酿酒大曲通用分析方法。 1.3 微生物产酶方法 1.3.1 细菌产酶方法

将细菌接种到斜面上35℃培养1 d，挑取单菌落接种在营养琼脂液体种子培养基，在摇床150 r/min培养16 h，以10%的接种量接种到麸皮培养基，于35℃培养3 d，所得培养物与水混合（1∶10，w/v）搅匀，40℃水浴加热1 h，每隔15 min搅拌1次，过滤，滤液为粗酶液，用于酶活测定。 1.3.2 霉菌产酶方法

将霉菌接种到斜面上30℃培养7 d，之后接种到固体PDA种子培养基中，于30℃培养3 d，以10%的接种量接种到麸皮培养基，于30℃培养5 d，所得培养物与水混合（1∶10，w/v）搅匀，40℃水浴加热1h，每隔15 min搅拌1次，过滤，滤液为粗酶液，用于酶活测定。 1.4 酶活测定方法 1.4.1 大曲酶系测定方法 1.4.1.1 酸性蛋白酶活力测定

测定方法见国标GB/T 10317—1999。酪氨酸标准曲线方程：y=0.00999x+0.00757（x为酪氨酸毫克数，y为吸光度OD660nm，R2=0.99919）。

样品蛋白酶活力=A/10×4×N×1/（1-W）。

式中：A——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（OD值×K）；

4——4 mL反应液取出1 mL测定（即4倍）； N——酶液稀释的倍数； 10——反应10 min；

W——样品水分百分含量。

酶活定义：在40℃下1 min水解酪蛋白产生l μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。

1.4.1.2 糖化酶活力测定

采用DNS法［9］。葡萄糖标准曲线方程：y=0.855x-0.00467（x为葡萄糖毫克数，y为吸光度OD550nm，R2=0.99839）。 酶活力=OD×n×k×2.5×20×3。 式中：OD——吸光度值；

2.5 ——将0.4 mL酶液换算成1 mL酶液； k——比色常数（C/A）； n——酶稀释倍数；

20——将0.5 mL反应液换算成10 mL； 3——将20 min换算成1 h。

酶活定义：在40℃、pH4.6条件下，1 h水解淀粉产生1 mg葡萄糖作为一个酶活力单位。

1.4.1.3 纤维素酶活力测定

采用DNS［10］法。葡萄糖标准曲线方程：y=0.06691x-0.05217（x为葡萄糖含量，y为吸光度OD520nm，R2=0.99138）。 酶活力（U/mL）=葡萄糖量/15×Ew×n。

式中：5为保温时间（酶与底物作用时间，min）； Ew为粗酶液的体积（mL）； n为酶液稀释倍数。

酶活定义：50℃条件下，1 min催化纤维素水解成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

1.4.1.4 果胶酶活力测定 测定方法同国标QB1502—92。

X=（A-B）×c×0.51×194.14×n×10/（5×1×0.5）=（A-B）× c×n×396.05。 式中：X——样品的酶活力，U/g（U/mL）； A——空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL； B——样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL； c——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；

0.51 ——1 mmol代硫酸钠相当于0.51 mmol的游离半乳糖醛酸； 194.14 ——半乳糖醛酸的毫摩尔质量，mg； n——酶液稀释倍数； 10——反应液总体积，mL；

5——滴定时取反应混合物的体积，mL； 1——反应时加入稀释酶液的体积，mL； 0.5 ——反应时间，h。 所得结果应表示至整数。

测定酶活力时，酶液浓度应控制在消耗0.05 mol/L硫代硫酸钠标准溶液（A-B）之差为0.5-1.0 mL。

酶活定义：1 mL酶液在50℃、pH3.5的条件下，1 h分解果胶产生l mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。 1.4.1.5 脂肪酶活力测定

测定方法采用国标GB/T 23535—2009指示剂滴定法。

式中：X1——样品的酶活力，U/g；V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；50——0.05 mol/L氢氧化钠溶液1.00 mL相当于脂肪

酸50 μmol；n——样品的稀释倍数；0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；1/15——反应时间15 min，以1 min计。

酶活定义：1 mL酶液在40℃，pH7.5条件下，1 min水解底物生成1 μmol可滴定的脂肪酸为1个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。

1.4.2 微生物产酶测定方法酸性蛋白酶活力测定：测定方法同1.4.1.1。糖化酶活力测定：测定方法同1.4.1.2。纤维素酶活力测定：测定方法同1.4.1.3。果胶酶活力测定：测定方法同1.4.1.4。脂肪酶活力测定：测定方法同1.4.1.5。 1.4.3 数据分析

本研究的实验数据分析均采用Origin8.0软件完成，实验结果以平均值±标准偏差表示。

2.1 大曲的理化指标

大曲的酸度、淀粉、水分、还原糖、氨基酸态氮、发酵力和酯化力是评价大曲质量的主要指标，对4种酱香型大曲理化指标测定结果见表1。酱香型大曲2#的酸度、淀粉质量分数、还原糖质量分数和酯化力最低，随着曲龄的延长，酱香型大曲中酸度、淀粉质量分数、发酵力有下降的趋势；酱香型大曲中水分含量、还原糖质量分数、氨基酸态氮和酯化力有增加的趋势。

大曲酸度的形成主要来源于生酸微生物进行的有机酸代谢以及脂肪、淀粉和蛋白质的降解。随着曲龄的延长，酱香型大曲酸度有下降的趋势，这可能与大曲中酸性蛋白酶和脂肪酶的活力降低以及产酸微生物的数量减少和代谢减弱有着密切关系。大曲的淀粉的质量分数与糖化酶活力和液化酶活力的高低有着密切的关系。液化酶和糖化酶的活力高，表明原料中淀粉的利用率高。但是液化酶和糖化酶的高低又与大曲中微生物的生长繁殖有一定的关联性，尤其是霉菌。同时，大曲中果胶酶和纤维素酶也能提高原料中淀粉的利用率。

大曲中水分是一个很重要的指标，水分在制曲过程中与微生物的生长和酶的生成密

切相关。一般成品曲水分含量低于13%，若大曲中水分含量太高，大曲容易二次生霉，使质量降低。大曲中氨基酸态氮的含量与大曲中酸性蛋白酶的活力以及产酸微生物的数量和代谢有着密切关系。

从不同曲龄大曲的发酵力和酯化力测定结果来看，随着曲龄的延长，大曲的发酵力有降低的趋势，而酯化力有升高的趋势。这与大曲中微生物的数量和代谢有着密切的关联性，特别是产酒酵母和产酯酵母。 2.2 大曲酶系测定结果

大曲中的酸性蛋白酶分解大曲原料中蛋白质生成多肽及氨基酸等，氨基酸和还原糖可以发生美拉德反应［1］，生成了白酒呈香物质的前驱物质。测定不同曲龄的大曲中酸性蛋白酶活力见图1，随着贮藏时间的增长，酸性蛋白酶活力有降低的趋势，其酶活力在31.63～58.96 U/g。糖化酶作用于淀粉的非还原性末端的α-1，4-葡萄糖苷键，是一种可将淀粉、糊精和糖原水解为葡萄糖，有助于酵母分解葡萄糖生成乙醇的酶制剂。酱香型大曲的原料只有小麦，而小麦原料中淀粉的含量最高。测定不同曲龄的大曲中糖化酶活力结果见图2，其酶活力在286.55～1045.61 U/g。随着储藏时间的增长，大曲中微生物的代谢减弱。糖化酶和液化酶一样，关系到原料的利用，与白酒的出酒率有直接关系。纤维素酶可以降解发酵原料中的纤维素。测定不同曲龄的大曲中纤维素酶活力结果如图3所示，其酶活力在0.59～0.88 U/g。不同曲龄中纤维素酶活力都较低，姜淑荣［11］等人研究，纤维素酶对于纤维素的降解作用也破坏了细胞壁的结构，使细胞内的淀粉释放出来，有利于糖化酶的作用，提高了淀粉原料的利用率。纤维素酶的作用适温为40～50℃，当温度高于60℃时，酶会迅速钝化。由于酱香型大曲采用高温制曲，高温制曲时会使纤维素酶钝化，另外高温制曲也会破坏细胞壁的结构。所以不同曲龄的酱香型大曲中纤维酶活力很低。果胶酶能够分解大曲原料中果胶物质生成甲醇和聚半乳糖醛酸，从而降低了大曲的黏度。

测定不同曲龄的大曲中果胶酶活力结果见图4，其酶活力在93.82～174.85 U/g。随着曲龄的延长，酱香型大曲中果胶酶活力在增加。果胶酶和纤维素酶有着相同的作用，可以提高原料中淀粉的利用率［12］。脂肪酶可以将原料中的脂肪分解成为脂肪酸、甘油、甘油单酯或者甘油二酯。生成的产物构成了白酒中香味物质的本身或者前驱物质。脂肪酸、甘油、甘油单酯及甘油二酯除供给生物体所需要的能量外，也是合成磷脂等具有重要生理功能的类脂的主链和前体。测定不同曲龄的大曲中脂肪酶活力结果见图5，其酶活力在12.08～21.27 U/g。被脂肪酶分解生成的脂肪酸与醇发生酯化反应生成脂肪酸酯，丁酸乙酯和己酸乙酯均可以通过此种途径生成。被分解生成的酸和醇可以发生酯化反应，形成了白酒中的香味物质。 2.3 细菌酶系测定结果

从曲样中分离纯化筛选出48株可培养细菌，并进行分子鉴定及产酶实验，48株种类分类测定其酸性蛋白酶活力、糖化酶活力、纤维素酶活力、果胶酶活力和脂肪酶活力。筛选出的可培养细菌中有一半可以产生酸性蛋白酶，这些细菌大都是腐生葡萄球菌、解淀粉芽孢杆菌、鸡葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和埃希氏大肠杆菌。其中，腐生葡萄球菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生的酸性蛋白酶活力比较高。48株细菌几乎都可以产生糖化酶，这些细菌是腐生葡萄球菌、解淀粉芽孢杆菌、鸡葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和埃希氏大肠杆菌。4#为白酒生产中所用的混合曲，筛选出来的大部分菌株都比4#的糖化酶活力还要高，可用于制备强化大曲，也几乎都可以产生纤维素酶，而且这些可培养的细菌产纤维素酶活力比酱香型大曲4#还要高，这与培养时的温度有关系，纤维素酶的作用适温为40～50℃，当温度高于60℃，酶会迅速钝化。酱香型大曲4#在制曲过程采用高温制曲使酶钝化。48株可培养细菌产果胶酶见图9，只有部分的可培养细菌菌株可以产果胶酶活力，与酱香型大曲4#相比，鸡葡萄球菌和解芽孢淀粉杆菌的产果胶酶的能力高于酱香型大曲4#，果胶酶和纤维素酶一样，可以提高原料中淀

粉的利用率，在强化大曲的制备过程中，若鸡葡萄球菌和解芽孢淀粉杆菌的数量多，可以提高原料中淀粉的利用率。筛选出的48株可培养细菌产脂肪酶见图10，几乎所有筛选出来的48株可培养细菌菌株都能够产脂肪酶，并且酶活力高于酱香型大曲4#。

2.4 霉菌酶系测定结果

从曲样中分离纯化筛选出35株可培养霉菌，并对35株霉菌进行分子鉴定及产酶实验，35株种类分类测定其酸性蛋白酶活力、糖化酶活力、纤维素酶活力、果胶酶活力和脂肪酶活力。霉菌菌株酸性蛋白酶活力见图11，菌株酶活差异较大，其中FBKL3.0029菌株酸性蛋白酶活力最高，其他菌株酶活差异较大，有些菌株甚至不产酸性蛋白酶。酸性蛋白酶主要来源于曲霉和根霉，酸性蛋白酶影响白酒品质。FBKL3.0029菌株对于制备强化大曲以及白酒酿造有着重要意义。霉菌菌株糖化酶活力酶活差异较大，其中FBKL3.007、FBKL3.0014、FBKL3.0023、FBKL3.0035和FBKL3.0052产糖化酶活力较高，但是都低于酱香型大曲4#。绝大部分的霉菌菌株产糖化酶活力很低，有些菌株甚至不产，这与李祖明［13］等报道结果一致。刘秀［14］等从茅台酒曲中分离到1株红曲霉，其酶活力也较低，说明酱香型大曲中产糖化酶的丝状真菌通常产糖化酶的活力较低。霉菌菌株产纤维素酶活力均高于酱香型大曲4#，纤维素酶的作用适温为40～50℃，当温度高于60℃，酶会迅速钝化。酱香型大曲是高温制曲，在制备强化大曲，温度过高肯定会使纤维素酶钝化。霉菌菌株果胶酶活力差异较大，其中FBKL3.0029和FBKL3.0041酶活力较高，在制备强化大曲时，菌株的果胶酶活力不仅可以迅速降解大曲原料中的果胶物质，同时可以提高原料中淀粉的利用率，提高出酒率。经测定的35株可培养的霉菌菌株脂肪酶活力见图15，菌株酶活差异较大，其中FBKL3.0024和FBKL3.0041酶活力较高，但菌株酶活力均高于酱香型大曲4#。脂肪酶分解大曲原料生成的酸影响着大曲的酸度，生成的醇影响着白酒的品质和口感。

大曲中酶系是大曲中产酶微生物产酶得到的。所以大曲中酶系和大曲的微生物产酶有着直接的关联性。大曲中细菌和霉菌都可以产酸性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶。酸性蛋白酶和脂肪酶降解原料中的蛋白质和脂肪，进而进一步被微生物所利用，蛋白酶和脂肪酶影响着白酒的口感和品质。糖化酶降解原料中的淀粉生成葡萄糖，生成的葡萄糖进一步被微生物利用生成酒精，糖化酶的高低决定着白酒的出酒率。纤维素酶和果胶酶可以破坏细胞的细胞壁，使原料淀粉从细胞内释放出来，进而被降解成还原糖。纤维素酶和果胶酶可以提高原料淀粉的利用率，进一步提高出酒率。从酱香大曲中分离出产酸性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶的菌株，对于提高大曲质量、优化大曲制作工艺以及制备强化大曲有着重要的意义。

大曲中微生物产酶的种类和产酶微生物的数量决定着大曲中酶系的种类和酶活力的高低，同时也决定了大曲的理化指标。而大曲的理化指标从侧面也反映了大曲的酶系和微生物产酶之间的关系。

通过对大曲的酶系和微生物产酶关系的研究，找出对大曲酶系贡献大的细菌和霉菌，尤其是细菌（FBKL1.0151和FBKL1.0177）和霉菌（FBKL3.0014和FBKL3.0035）对酱香大曲的酶系贡献比较大，可以用于强化大曲的制备，为后续的混菌发酵提供基础研究和理论依据。

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