华南师范大学 生命科学学院 分子生物学实验 考试复习资料

义忠仁Ricky

一、

1.什么是PCR？

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。 2.PCR原理是什么？

PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 3.PCR程序通常有哪几个步骤？

变性：加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。

退火：解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。

延伸：将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。

4.影响PCR扩增的因素有哪些？

引物的质量与特异性、退火温度、Mg2+浓度、模板DNA的质量、酶的质量。 二、

1.基因组DNA提取一般原理？

用CTAB或SDS可使细胞破裂，释放出核酸，溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解释放出来的DNA ；加入无水乙醇，可以使DNA从溶液中沉淀出来。 2.提取基因组DNA用途有哪些？

构建基因组文库、Southern 杂交、RFLP（限制性内切酶片段多态性）、基因克隆（PCR） 三、

1.琼脂糖凝胶电泳原理？

DNA是两性物质，在高于等电点（偏碱性）环境下， DNA带负电荷。在电场作用下向阳极迁移。

琼脂糖凝胶作为一种固体的具有一定孔径的支持基质, DNA分子在琼脂糖凝胶泳动时有电荷效应和分子筛效应。

在一定电场强度的恒电场下，DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型（分子筛效应）。

2.质粒DNA的构型与电泳速率关系？（不同浓度胶有所区别）

凝胶浓度1.2~1.5%速率：超螺旋>线性分子>开环分子（共价闭合的DNA其空间位阻最小，所以跑得最快。而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。） 凝胶浓度>1.5%速率：线性分子>超螺旋>开环分子 四、

1.什么是质粒DNA？

质粒是细胞内具有自身复制起点独立于细胞主染色体外的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。 2.质粒DNA特点？

共价闭环、自主复制、携带部分基因信息

3.碱裂解法提取质粒DNA的原理及三种溶液的作用？

原理：质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后，溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

溶液I：葡萄糖有助维持渗透压，EDTA的作用螯合胞壁Ca2+，利于酶与壁的接触。 溶液II：SDS的作用破坏细胞膜，NaOH作用使DNA分子变性。 溶液III：醋酸钾利于沉淀DNA和SDS与蛋白质的复合物。 五、

1.理想状态下DNA OD260/280分别为多少？在什么范围比较合适？ DNA =1.8 1.7~1.9 RNA=2.0 1.9~2.1 2.偏大或偏小分别说明什么？

DNA:偏低 蛋白质污染；苯酚残留 偏高 RNA污染

RNA：偏低 蛋白质污染；苯酚残留；材料多糖或多酚含量较多；过高：RNA降解

3.出现RNA、蛋白质等污染怎么处理？

蛋白污染可以考虑用酚、氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚,RNA污染就添加RNAase 消化

六、

1.酶切与连接原理？

酶切原理

限制性核酸内切酶是基因工程中剪切 DNA 分子的常用工具酶。限制性核酸内切酶是细菌体内限制修饰系统的重要组成部分之一，是一类能够识别DNA双链中的特异性序列并能特异地结合于其特异位点或其附近的特异位点上切割双链DNA的酶。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。 连接原理

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’- P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。

2.影响酶切的因素？

DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应 3.出现不完全酶切如何处理？

一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切 4.什么是星号活性？

在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。

5.为何出现星号活性？

过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性) 七、

1.什么是感受态细胞？

细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法、RhCl（KCl等化学试剂法））的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞。 2.大肠杆菌转化（CaCl2法）的原理？

0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。 3.CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时低温的主要目的？

抑制细胞的旺盛的生理代谢，有助于DNA-Ca2+吸附于细胞表面，防止DNAase降解DNA。

4.热休克温度和目的分别是什么?

42℃。短时间热冲击处理，细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入，促使细胞吸收DNA 复合物。

5.制备感受态细胞与转化过程中注意事项？

①一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%

②整个操作过程均应在无菌条件下进行 ，所用器皿 及试剂都要灭菌 ③用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染 ④整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴 ⑤CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。 八、

1.筛选阳性克隆的方法有哪些？ 蓝白斑筛选、菌落PCR筛选 2.蓝白斑筛选的原理是什么？

现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸（α-肽链）的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞具有编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。宿主和质粒编码的片段（即α-肽链与β-半乳糖苷酶C端部）单独存在都没有酶（ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的β-半乳糖苷酶。这种现象称为α-互补。

β-半乳糖苷酶是诱导酶，诱导剂IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导β-半乳糖苷酶的产生。β-半乳糖苷酶催化生色底物X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。

当外源DNA插入到质粒lacZ序列的多克隆位点后，原来的lacZ序列发生了变化，不能编码α-肽链，即含重组质粒的细胞不具活性的β-半乳糖苷酶，不能使X-Gal形成蓝色的5-溴-4-靛蓝。因此它形成白色菌落。而质粒没有重组的细胞能产生β-半乳糖苷酶，X-Gal被分解成蓝色的5-溴-4-靛蓝。它形成蓝色的菌落。这样的筛选称为蓝白斑筛选。 九、

1.SDS-PAGE的原理？

SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键， 使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与SDS充分结合。PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bi )在加速剂N N N′ N′-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸

铵 (简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

2.如何将一DNA片段连接进入蛋白表达载体并进行蛋白的表达？

①PCR扩增大量DNA，构建蛋白表达载体，②用相同限制酶酶切，回收，连接，③将细菌构建成感受态细胞，将载体转化进细胞，④筛选，诱导蛋白，⑤SDS-PAGE检测是否诱导蛋白。

3.重组DNA技术基本流程：目的基因获取、克隆载体构建、外源基因与载体连接、重组DNA导入受体菌、重组体筛选、克隆基因表达。