自体骨髓基质细胞立体培养修复关节软骨缺损的实验研究

５０８　Ｊ　Ｂｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄ　Ｃｏｉｌ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００７，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ。５　［文章编号］１０００－２２００（２００７）０５－０５０８－０３　・基础医学・　自体骨髓基质细胞立体培养修复关节软骨缺损的实验研究　秦骥　，蔡道章　，卓巍’　［摘要］目的：探讨细胞载体Ｉ型胶原海绵与骨髓基质细胞的组织相容性及利用自体骨髓基质细胞立体培养构建的组织工程　软骨修复关节软骨的效果。方法：在２４只４～６月龄新西兰大白兔股骨粗隆、胫骨下端进行骨穿，获取骨髓基质细胞进行体外　培养、扩增，三代后获取足够细胞数量，制成１０　／ｍｌ细胞悬液，植入细胞载体Ｉ型胶原海绵立体培养，２周后移植到直径３．５　ｍｍ的软骨缺损面上，于１、２、３个月处死动物检查。结杲：骨髓基质细胞与细胞载体Ｉ型胶原海绵有良好的组织相溶性，形成　自体组织工程软骨能完成关节软骨缺损修复。第１个月修复组织具备纤维软骨特征，第２个月具备透明软骨特征，第３个月　修复组织具备透明软骨的生物学特性。结论：细胞载体Ｉ型胶原海绵与骨髓基质细胞体外培养形成的组织工程软骨，能完成　关节软骨的修复，修复组织为透明软骨。　［关键词］生物医学工程；软骨，关节；细胞，培养的；骨髓基质细胞；兔　［中国图书资料分类法分类号］Ｒ　３１８；Ｒ　３２７．７２　［文献标识码］Ａ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ＱＩＮ　Ｊｉ　，ＣＡＩ　Ｄａｏ—ｚｈａｎｇ　，ＺＨＵＯ　Ｗｅｉ　（１。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｂｅｎｇｂｕ　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｆＯｒｏｔｏｐｈｅｄｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｈａｌ，８ｅ￣ｇｂｕ　２３３０００；　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｆＳｕｎ　Ｙａｔｏ￣ｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｗｅｎ￣－ｆｏｕｒ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｇｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　４　ａｎｄ　６　ｍｏｎｔｈｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｈａｒｖｅｓｔ．Ｔｈｅｓｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍａｋｅ　１×１０　／ｍｌ　ｓｕｓｐｅｎｄ。ａｎｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ　ｓｐｏｎｇｅ．Ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｌａｔｅｒ，ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｅｌｆ－ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｗｉｔｈ　３．５　ｍｍ　ｄｉａｍｅｔｅｒ，ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　Ｍｏｎｔｈ　Ｏｎｅ，Ｔｗｏ　ａｎｄ　Ｔｈｒｅｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：　Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　Ｃａｎ　ｇｒｏｗ　ｗｅｌｌ　ｉｎ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ　ｓｐｏｎｇｅ．Ｔｈｅ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｆｏｒｍｓ　ａｎｄ　ｒｅｐａｉｒｓ　ｔｈｅ　ｃｈｏｎｄｒａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅａｒ　ｏｒｇａｎｉｓｍ　ｆｅａｔｕｒｅｄ　ｆｉｂｒｏ—ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｉｎ　Ｍｏｎｔｈ　Ｏｎｅ．Ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｈｙａｌｉｎｅ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｉｎ　Ｍｏｎｔｈ　Ｔｗｏ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏｎｔｈ　ｈｒｅｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｃａｒｔＴｉｌａｇｅ　ｃａｎ　ｒｅｐａｉｒ　ｃｈｏｎｄｒａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｙａｌｉｎｅ　ｃａｒｔｉｌｇｅ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌａｖｅｄ　ｉｎ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｒｇａｎｉｓｍ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｃａｒｔｉｌｇｅ，ａａｒｔｉｃｕｌｒ；ａｃｅｌｌｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ；ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ；ｒｂｂｉａｔｓ　关节软骨自身修复能力有限，组织工程方法修　复关节软骨研究已有大量报道¨０　Ｊ，且部分用于临　床，但修复组织的临床效果都不是很理想。本文应　用自体骨髓基质细胞修复关节软骨缺损具有突出的　优势，同时应用细胞立体培养方式具有很大的改进，　烘箱，２５　ｃｍ　培养瓶，其它常用设备。试剂：ＤＭＥＭ　（Ｈ型），Ｈｅｐｅ　２　ｓ／Ｌ，ＥＤＴＡ，ＩＩ型胶原酶（以上均由　Ｇｉｂｃｏ公司提供），０．１２５％胰蛋白酶（上海生化试剂　厂产品），胎牛血清（杭州四季青公司），ＰＢＳ（中山　医学院动物中心试剂部提供），青霉素１００　ｕ／ｍｌ。　链霉素１００　ｕ／ｍｌ，细胞载体：Ｉ型胶原海绵（哈佛医　学院骨科实验室提供）。　１．２骨髓基质细胞的获取和培养４—６月龄新西　兰大白兔２４只，雄性ｌ４只，雌性ｌ０只，体重２．５—　解决了细胞流失和细胞分布不均问题，目前相关报　道较少。本文就此作一报道。　ｌ材料与方法　１。ｌ　主要实验设备和材料实验动物：２４只新西　３．５　ｋｇ。０．０１　ｍｌ／ｋｇ肌肉注射麻醉满意后，　胫骨结节或股骨粗隆处无菌状态下进行骨穿，预先　兰大白兔（中山医学院动物中心提供）。培养设备：　ＣＯ：孵箱（日本三洋公司），倒置显微镜及照相系统　（柯尼卡公司），超净台（苏州净化设备厂），离心机，　［收稿日期］２００６－０６－２２　［基金项目］广东省组织工程基金资助（２００２０２６７）　［作者单位］１．安徽省蚌埠市第三人民医院骨科，２３３０００；２．中山大　学附属第三医院骨科，广东广州５１０６３０　［作者简介］秦骥（１９６９一），男，硕士，主治医师．　用肝素０。１—０．２　ｍｌ预湿注射器和穿刺针，抽取骨　髓约０．５—１．５　ｍｌ，直接接种到含有１０％胎牛血清　ＤＭＥＭ的培养皿中，分散骨髓细胞，用吹打管轻轻　吹打，分散取得的骨髓使其均匀，过滤杂质后，离心　（１　０００　ｒ／ｍｉｎ）５　ｍｉｎ后，弃去上清液，加入含有１０％　胎牛血清ＤＭＥＭ液４　ｍｌ，吹打均匀，制成单细胞悬　液，计数有核细胞，按ｌ０　个有核细胞接种到２５　ｃｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com 蚌埠医学院学报２００７年９月第３２卷第５期　的细胞培养瓶中，置于５％ＣＯ：、３７℃孵箱中培养，　第３天换去一半培养液，２天后全部换液，弃去未贴　壁的细胞。观察到培养液由桃红色变为橙黄色时换　液，待细胞长满底壁后，用０．１２５％胰蛋白酶消化传　代。计数每个培养皿约４．３　Ｘ　１０　个，按１：３比例分　装到３个培养皿中，继续培养，最后收集所有自体骨　髓基质细胞制成１０　个／毫升浓度细胞悬液备用。　１．３　自体组织工程软骨形成　Ｉ型胶原海绵紫外　线消毒８～１２　ｈ后，放人无菌ＰＢＳ液中浸泡２　ｈ，取　出，无菌吸水纸吸干，放人１０　个／毫升浓度细胞悬　液中，振荡３０　ｍｉｎ，放人培养皿中继续培养。２周后　切片证实：细胞在海绵中生长良好，然后移植到动物　软骨缺损模型上，每隔１个月处死８只观察。　１．４动物模型建立、复合体移植、分组在每只兔　膝关节两侧的股骨下端髌股关节面上做一个直径　３．５　ｍｍ软骨缺损，深达软骨钙化层，不见出血点为　准。一侧膝关节作为实验组，用细胞复合体移植；另　一侧用空白对照或者用Ｉ型胶原海绵填充，形成自　身对照，观察组有空白组、Ｉ型胶原海绵、骨髓基质　细胞组。　１．５　术后自由活动，观察步态　２４只兔１、２、３个　月后分批处死８只，观察关节液情况，然后对修复组　织进行大体观察，组织学切片、染色、关节软骨特异　性染色，电镜观察，组织学评分，分析修复组织是否　是透明软骨。　１．６统计学方法修复组织用Ｐｉｎｄａ法行组织学　半定量评分，评分结果用秩和检验，同一个月份对照　组与实验组之间采用配对资料秩和检验。　２　结果　２．１　骨髓基质细胞培养及复合体形成　细胞培养　３天后，倒置显微镜下可见到散在的骨髓基质细胞，　呈长条状，胞质丰富，体积较大。第５天开始伸出伪　足，逐渐，增殖，形成细胞克隆，并向四周扩展成　结节，螺旋状生长（见图１）。细胞存活率测定达　９０％以上，Ⅱ代、Ⅲ代骨髓基质细胞克隆呈涡轮状生　长，细胞呈梭形，细胞核不明显，在培养基上固定染　色见骨髓基质细胞核明显。　骨髓基质细胞接种到Ｉ型胶原海绵复合体在　１周后逐渐变小，表面变光滑。２周后复合体标本作　垂直、水平两个角度病理切片见骨髓基质细胞比较　均匀分布在整个海绵。骨髓基质细胞在复合体内以　球形多见，还有多角形等（见图２）。　５０９　２４只实验兔３天后活动渐增加，１周后活动自　如。１只兔切口感染，１只兔的左膝关节活动度差。　２．２　空白组及Ｉ型胶原海绵对照组　在３个月观　察期间内，缺损的关节软骨面始终未得到修复，空白　及Ｉ型胶原海绵两个对照组结果相似，１个月后，胶　原海绵消失，剩下缺损面，在修复上无任何优势。　２．３　实验组大体观关节软骨缺损面得到修复，　１个月后修复组织为类软骨样，乳白色，修复组织稍　低于正常关节面，表面凸凹不平，有明显的阶梯感，　与正常关节软骨相比硬度较小，与周围软骨连接紧　密，按压时不能与周围分离；２个月后见修复组织与　周围软骨相似，表面光滑，无阶梯感，质地硬度明显　好转，与周围正常软骨稍有差别；３个月后修复组织　与正常关节软骨几乎无差别，表面光滑、平坦。　２．４光镜下１个月切片苏木精一伊红染色见：修　复组织比正常关节软骨染色较深，与周围关节组织　分界清楚，可见７～８个细胞宽度的无细胞分布区　域，与周围关节软骨连接紧密，无空隙，基质相互连　接，有凸起的数个丘状结构；修复组织细胞分布均　匀，看不到同源细胞群，细胞体积较大，核深染，细胞　周围陷窝不明显（见图３）。２个月后修复组织细胞　体积小，陷窝小，呈小串珠状，表面较光滑平坦，小丘　状结构消失，表面与正常关节软骨平齐，连接紧密，　无凹陷，修复组织内见大量同源细胞群，呈柱状排　列，细胞周围陷窝清晰可见，但比正常关节软骨细胞　陷窝较小，修复组织深部细胞的陷窝较大，浅层变　小，甚至消失，有时看不到细胞。３个月见修复组织　与正常关节软骨之间几乎没有任何区别，仅交界处　的表面稍凹陷，分界处有２～３排体积较小的细胞，　呈柱状。修复组织染色稍深，表面光滑，内部细胞分　化良好，同源细胞群体积稍小于正常，细胞陷窝明　显，接近正常，基质与正常几乎无差别，稍微深染。　２．５　甲苯胺蓝染色１个月后整个修复组织淡染，　从浅到深部修复组织比较均匀，细胞呈球形，约　５０％细胞被甲苯胺蓝异染，而５０％细胞淡染，呈现　细胞轮廓，靠近深部细胞异染明显，基质纤维较粗，　排列紊乱，初步具备纤维软骨特性。２个月后甲苯　胺蓝异染明显，染色明显加深，但较正常组织仍染色　淡，分界清楚，同源细胞体积较小，深部分化较好，浅　部欠佳，细胞排列较规则，基质纤维颗粒小，排列规　则，初步具备透明软骨的特点（见图４）。３个月后　染色比正常关节软骨稍微淡，区分不明显，细胞分化　良好，同源细胞群多见，已趋成熟，比较均匀，细胞排　维普资讯 http://www.cqvip.com

５１０　列规则，细胞陷窝明显，具备软骨生物学特点（见图　５）。　２．６　电镜见修复组织表面光滑，修复组织细胞周　围有软骨陷窝，细胞表面有许多不规则突起，胞质内　有大量粗面内质网和高尔基体、糖原颗粒，细胞周围　基质内胶原纤维较细且均匀分布，符合透明软骨的　生物学特性。　２．７　Ｐｉｎｄａ组织学评分空白组和胶原海绵对照组　均未完全修复，结果相似，因此把两对照组合并与骨　髓基质细胞实验组做统计学分析，Ｐｉｎｄａ组织学评　分，１、２、３个月两组差异均有统计学意义（Ｔ．＝４０，　＝７７，Ｔ３＝８９，Ｐ＜０．０１）。　３讨论　３．１　骨髓基质细胞特点　骨髓基质细胞具有成骨　和成软骨的能力，分布广泛，获取容易，是比较好的　软骨缺损修复种子细胞。骨髓基质细胞在体内体外　的成软骨能力均已报道　一　；骨髓基质细胞在体外　长期培养，大量扩增，仍可保留多向分化的潜能，且　遗传背景相当稳定。但此种细胞在骨髓中含量极　少，每１０　～１０　个单核细胞中只有１个，而组织工　程对细胞的数量要求大，因此，体外扩增骨髓基质细　胞就显得尤为重要。骨髓基质细胞是对血系细胞起　支持和连接作用的一类细胞的总称，其中３０％～　４０％是有成软骨能力的干细胞。利用骨髓基质细胞　有贴壁生长的特点，血细胞不贴壁，可以将两种细胞　分离。　３．２细胞载体选择用于吸附细胞的载体是组织　工程关键因素，理想的材料应具备：（１）组织兼容　性，不引发可能削弱组织功能临近组织的反应；（２）　可吸收性，最终材料完全被移植床吸收取代，吸收率　要与组织修复速度相配；（３）易于重复制作，可加工　成各种形态适应缺损的要求；（４）材料表面与移植　细胞相互作用，以保留分化细胞的功能或促进生长　的可能　Ｊ。本实验利用Ｉ型胶原海绵作为细胞载　体，基本上具备上述优势，因为关节软骨的基质成分　为Ｉ型胶原和Ⅱ型胶原纤维，所以Ｉ型胶原海绵降　解的同时，它的成分可以再次被利用，生成关节软骨　所需要的基质。　３．３　立体培养优点　Ｉ型胶原海绵与种子细胞立　体培养，是一种新的培养方式，使细胞与载体有机结　合，这样在移植后的修复过程中，不会因体位及周围　环境变化使细胞分布不均，还可以避免细胞流失，使　Ｊ　Ｂｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄ　Ｃｏｌ１．Ｓｅｏｔｅｍｂｅｒ　２００７．Ｖｏ１．３２．Ｎｏ．５　细胞与周围邻近正常软骨更紧密接触，有利于和周　围正常组织连接。　３．４动物模型选择本次实验没有选择全层软骨　缺损，是因为软骨缺损模型保留软骨钙化层可以起　到屏障作用：它阻止源于松质骨中骨髓基质细胞移　行修复软骨缺损，干扰实验观察及防止源于深部松　质骨中的血管长入缺损，修复关节软骨　］。　３．５组织工程软骨生长特点　骨髓基质细胞在关　节软骨缺损内经历增殖和分化两个阶段，１个月内　修复组织以增殖为主，缺损被修复组织填充，近关节　面细胞表现为圆形或椭圆形，修复组织内可见少数　带有软骨陷窝的细胞，基质中可以分辨出纤维结构，　这是纤维组织向透明软骨转变的过程，深部出现少　量钙化的骨组织。２个月、３个月修复组织已逐渐分　化为透明软骨，无论是细胞还是基质逐渐具备透明　软骨的生物学特性，近关节面细胞已分化为成熟的　软骨细胞，有软骨陷窝，随着修复组织的逐渐成熟，　软骨陷窝渐渐增大，同源细胞群变大，由原来的单一　纵向生长转变为纵横向分化，１３趋成熟，并出现软骨　下骨化，基质中也看不到纤维结构，ＨＥ染色也接近　正常关节软骨，这与良好的细胞载体和新的利用方　式分不开的。　（本文图１～５见封三）　［　参　考　文　献　】　［１］　Ｂａｈｕａｕｄ　Ｊ，Ｍ￣ｔｍｔ　ＲＣ，Ｂｏｕｖｅｔ　Ｒ，ｅｌ　ａ１．Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅｎｏｕｓ　ｌｅｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｙｏｕｎｇ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　２４　Ｃａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ，１９９８，１２３（６）：５６８—５７１．　［２］Ｗａｋｉｔａｎｉ　Ｓ，Ｉｍｏｔｏ　Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ　ｋｎｅｅｓ［Ｊ］．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００２，１０（３）：１９９—２０６．　［３］　董启榕，戴莲生．骨髓基质细胞增殖后移植修复关节软骨缺损　的实验研究［Ｊ］．中国矫形外科杂志，２０００，７（１０）：９８３—９８５．　［４］Ｄｉｄｕｃｈ　ＤＲ，Ｊｏｒｄａｎ　ＬＣ，Ｍｉｅｒｉｓｃｈ　ＣＭ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｅｍｂｅｄｄｅｄ　ｉｎ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｆｏｒ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ［Ｊ］．　Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ，２０００，１６（６）：５７１～５７７．　［５］Ｇｒａｎｄｅ　ＤＡ，Ｈａｌｂｅｒｓｔａｄｔ　Ｃ，Ｎａｕｇｈｔｏｎ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｔｒｉｘ　ｓｃａｆｏｌｄｓ　ｆｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉｌｇａｅ　ｇｒａｆｔｓ［Ｊ］．．，　ＢｉｏｍｅｄＭａｔｅｒＲｅｓ，１９９７，３４（２）：２１１—２２０．　［６］Ｌｅｅ　ＣＲ，Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ　ＡＪ，Ｈｓｕ　ＨＰ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈａｒｖｅｓｔ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｒｅｐａｉｒ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａｒｔｉｃｕｌｒａ　ｃａｒｔｉｌｇａｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｎｉｎｅ　ｋｎｅｅ　［Ｊ］．．，　・　Ｒｅｓ，２０００，１８（５）：７９０—７９９．　［７］Ｋａｔｓｕｂｅ　Ｋ，Ｏｃｈｉ　Ｍ，Ｕｃｈｉｏ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ａｒｔｉｃｕｌｒａ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　Ａｔｅｌｏｃｏｌｌｇａｅｎ　ｇｅ１．　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｏｒｔｈｏｐ　Ｔｒａｕｍａ　Ｓｕｒｇ，２０００，１２０（１）：１２１—１２７．　维普资讯 http://www.cqvip.com 自体骨髓基质细胞立体培养修复关节软骨缺损的实验研究（正文见５０８页）　图ｌ　贴壁生长的骨髓基质细胞（ＨＥ染色１０ｘ４０）　图２骨髓基质细胞在Ｉ型胶原海绵中生长（ＨＥ染色ｌＯｘ２０）　图３第１个月修复组织　（右边是修复组织，可见细胞体积较小，周围有软骨陷窝和软骨小囊，基质纤维紊乱，左上方为分界线及正常组织）（ＨＥ染色ｌＯｘ２０）图４第　２个月修复组织（左边修复组织，可见同源软骨细胞，呈柱状排列，细胞周围有软骨陷窝，基质异染明显，排列较规则，右边为正常组织）（甲苯胺　蓝染色ｌＯｘ４０）图５第３个月修复组织（右边是修复组织，可见细胞体积与正常组织相差无几，同源软骨细胞多见，周围有软骨陷窝，基质　纤维稍粗。交界处可见３个柱状同源细胞群，体积较小，左侧是正常组织）（甲苯胺蓝染色ｌＯｘ４０）　兔深静脉血栓形成后内皮细胞凋亡的研究（正文见５１１页）　图ｌ　兔后腔静脉血栓模型ｘｌＯ０图２血管壁三层炎性细胞浸润ｘｌＯ０图３血管内皮细胞单层变多层ｘｌＯ０图４　ｂａｘ染色阴性ｘ４００　图５　２天时相ｂａｘ表达ｘ４００图６　４天时相ｂａｘ表达ｘ４００图７　７天时相ｂａｘ表达￣４００图８　ｂｃｌ－２染色阴性Ｉ（，４００图９　ｌ天时　相ｂｃｌ一２表达ｘ４００图ｌ０　４天时相ｂｃｌ一２表达ｘ４００图ｌｌ　７天时相ｂｅｌ一２表达Ｉ，（４００图１２　ｔｕｎｅｌ标记阴性ｘ４００图１３　ｔｕｎｅｌ标记　４天ｘ４００图１４　ｔｕｎｄ标记ｌ天ｘ４００图１５　ｔｕｎｄ标记１２ｈ　ｘ４００　以瘢痕疙瘩为首发表现的皮肤转移性（胃）印戒细胞癌１例（正文见６３０页）　图１　中间见线形瘢痕（背部）　图２见大量胶原及成蔟的印戒细胞（空心箭头所指为胶原，实心箭头所指为印戒细胞）（ＨＥ染色ｘｌＯ０）　图３见可印戒细胞和粗大的胶原（空心箭头所指为印戒细胞）［ＡＢ／ＰＡＳ染色（＋）ｘ４００］