史华临床医师杂志（电子版）２０１３年５月第７卷第９期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｍａｙ１．２０１３．Ｖｏ１．７．Ｎ０．９ －９７・ ・临床论著・ 丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨 荧光免疫分析法的建立 谭玉华孙勇 吴道贫陈建起 【摘要】 目的建立丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨荧光免疫分析法。方法采用丙型 肝炎病毒基因重组多表位嵌合蛋白作为包被抗原，生物素标记抗原作为桥接抗原，链霉亲和素标记铕作为示 踪物，配制以Ｂ－萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液，自建方法的校准品以国家标准血清物质ＧＢｗ（Ｅ） ０９００４７为溯源，应用桥式双抗原夹心法建立丙型肝炎病毒抗体时间分辨荧光免疫分析法。结果 自建方法 在０．０３１—４．Ｏ０ ＮＣＵ／ｍｌ内，相关．系数可达Ｏ．９９；分析内和分析间变异系数均小于１０％；灵敏度可达 ０．０１６ ＮＣＵ／ｍｌ；校准品的效价比在０．９０～１．１０，平均回收率为１０１．４７％；与相关疾病的抗原或抗体无明显交 叉反应，其表观浓度值均小于０．０３ ＮＣＵ／ｍｌ；参考值为０．０５ ＮＣＵ／ｍｌ；符合国家检定标准的要求；３７℃恒温箱 烘烤７ ｄ后检测性能无明显改变；与同类方法学比对符合性好。结论 自建方法精密度好，灵敏度高，特异 性强，准确性好，线性范围宽，符合率高，能满足临床检测需要。 【关键词】 肝炎病毒属； 双抗原夹心法； 生物素亲和素法； 时间分辨荧光免疫法 Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｉｔｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＴＡＮ Ｙｕ—ｈｕａ． ＳＵＮ ｙ０ ，删Ｄａｏ－ｐｉｎ，ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ—ｑｉ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｆｅｎｇｈｕａ Ｂｉｏ—ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ，ＬＴＤ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０７３０，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＴＡＮ Ｙｕ—ｈｕａ。Ｅｍａｉｌ：ｔａｎｙｗｈｙ＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｔｉｍｅ．ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＴＲＦＩＡ）ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ（ａｎｔｉ－ＨＣＶ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＴＲＦＩＡ ｏｆ ｎａｔｉ・ＨＣＶ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ＨＣＶ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｕｈｉ－ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗａｓ ｃｏａｔｅｄ ｏｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，ｔｈｅ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ｌｂａｅｌｅｄ ｂｙ ｂｉｏｔｉｎ，ｔｈｅ ａｖｉｄｉｎ ｗａｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ．Ｔｈｅ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｔｈｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ．Ｔｈｅ ｔｒａｃｅａｂｉｌｉｔｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｍａｄｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｗａｓ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉｌａ ＧＢＷ（Ｅ）０９００４７．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｓｅｌ￣ｍａｄｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｆｒｏｍ ０．０３１ ＮＣＵ／ｍｌ ｔｏ ４．０ ＮＣＵ／ｍｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅａｃｈｅｄ ０．９９００．Ｔｈｅ ｉｎｔｒａ—ａｓｓａｙ ｎａｄ ｉｎｔｅｒ—ａｓｓａｙ ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １０％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ０．０１６ ＮＣＵ／ｍ１．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖａｌｕｅ ｔｏ ｌｂａｌｅｄ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ０．９０—１．１０．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｗａｓ １０１．４７％．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎａｔｉｇｅｎ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ ｔｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ Ｗａｓ ０．０５ ＮＣＵ／ｍ１．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ３７℃ｆｏｒ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｉｎａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｆ－ｍａｄｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗａｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｌｉｋｅ ｓｏｒｔ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｅｌｆ－ｍａｄｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｉｓ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｃｙ，ｗｉｄｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ，ａｎｄ ｉｔｓ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ａｒｅ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｌｉｋｅ ｓｏｒｔ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｓｅｌｆ－ｍａｄｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｉｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ；Ｄｏｕｂｌｅ ｎａｔｉｇｅｎ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｍｅｔｈｏｄ；Ｂｉｏｔｉｎ－ａｖｉｄｉｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕ－ ｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ 丙型肝炎病毒抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ， 确证用的重组免疫印迹法（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂｌｏｔ 抗一ＨＣＶ）是丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染机体后出现的特 Ａｓｓａｙ，ＲＩＢＡ），虽然ＥＬＩＳＡ已经发展到第三代，但仍采 异性抗体，常用于抗．ＨＣＶ的检测方法有筛检用的酶联 用间接法进行检测，由于间接法检测存在假阳性率高 免疫法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）、化 的不足，给个人和社会造成了不必要的疾病负担。ＲＩ— 学发光法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＬＥＩＡ）和 ＢＡ因费用昂贵和缺少已建立的试验标准，很难在临床 诊断中普及。建立一种不降低灵敏度和增加特异性的 ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１３．０９．０３３ 抗一ＨＣＶ检测方法尤为必要。时间分辨荧光免疫分析 基金项目：广州市科技计划项目（难题招贤２０１１Ｊ５１００００９） 作者单位：５ １０７３０广州市丰华生物工程有限公司 法（ｔｉｍｅ．ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｌｆｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＴＲＦＩＡ）将抗原抗体 通讯作者：谭玉华，Ｅｍａｉｌ：ｔａｎｙｗｈｙ＠ｙａｈｏｏ．ＣＯｌＴ１．ｅｆｔ 反应与荧光物质发光和时间分辨三者结合，集酶标记、 中华临床医师杂志（电子版）２０１３年５月第７卷第９期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｙ １，２０１３，Ｖｏ１．７ 同位素标记技术的优点于一身，因此笔者建立了抗一 ＨＣＶ生物素一亲和素桥式双抗原夹心ＴＲＦＩＡ法，并研制 出了一种高灵敏度、高特异性的诊断试剂盒，现报道 如下。 活血清样本、６４０ ｍＩＵ／ｍｌ乙型肝炎病毒表面抗体灭活 血清样本、１６ ＮｃＵ／ｍｌ的乙型肝炎病毒ｅ抗体灭活血清 样本、８ ＩＵ／ｍｌ的乙型肝炎病毒核心抗体灭活血清样 本、８ ＮＣＵ／ｍｌ的人类免疫缺陷病毒抗体灭活血清样 本、２５６ ＲＵ／ｍｌ的巨细胞病毒抗体灭活血清样本、 ２００ ＩＵ／ｍｌ的风疹病毒抗体灭活血清样本、２５６ ＲＵ／ｍｌ 的单纯疱疹病毒抗体灭活血清样本、０．５ Ｕ／ｍｌ的戊型 肝炎病毒抗体灭活血清样本、１００ ｍｌＵ／ｍｌ的甲型肝炎 资料和方法 一、一般资料 １．标本来源：血样本可以使用血清或血浆样本，样 本不限性别，可以选择任何年龄阶段的随机人群，样本 病毒抗体灭活血清样本、１００ ｍＩＵ／ｍｌ的梅毒螺旋体抗 如抗凝剂、溶血、脂血、黄疸等样本其干扰限超过试剂 盒说明书给定范围或样本污染等样本均应予以剔除。 样本中待测物浓度应覆盖自研试剂的检测范围，需包 含有阳性、阴性和接近临界值的样本，且尽可能均匀分 布。样本数量按文献ｌ１ Ｊ和《体外诊断试剂临床研究技 术指导原则》的方法或要求选择。血样本在中山大学 孙逸仙纪念医院、广州市第八人民医院、第３０９ 医院３家临床试验研究单位按《体外诊断试剂临床研 究技术指导原则》的要求收集，共１０２０例（用于“已有 同品种批准上市”产品的临床研究实验）。按《丙型病 毒性肝炎诊断标准》＿２ｊ诊断为非丙型肝炎患者的抗． ＨＣＶ阴性样本４９８例（用于自研试剂盒参考值的建立） 和丙型肝炎患者的抗．ＨＣＶ阳性混合血清（用于自研试 剂盒校准品的配制）均由南方医科大学第三附属医院 提供。 ２．主要试剂：包被抗原为ＨＣＶ基因重组嵌合抗原 （包括ＨＣＶ核心蛋白区Ｃｏｒｅ和非结构蛋白区ＮＳ３、 ＮＳ４、ＮＳ５基因中的多个免疫优势表位区的多表位嵌合 蛋白）、生物素化ＨＣＶ基因重组混合抗原（包括ＨＣＶ 核心蛋白区Ｃｏｒｅ抗原、生物素化ＮＳ３抗原、生物素化 ＮＳ４抗原、生物素化ＮＳ５抗原）、链霉亲和素（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉ． ｄｉｎ，ＳＡ）、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）和Ｔｗｅｅｎ２０、聚乙二醇 ６０００（美国Ｓｉｇｍａ公司）；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ凝胶（瑞典 Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司）；９６孔微孔板（深圳市金灿华实业有限 公司）；铕（Ｅｕ¨）标记试剂盒（Ｗａｌｌａｃ公司）；带有滤膜 的离心管（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；其余试剂为国产分析 纯试剂；参考文献＿３ 制备的以Ｂ．萘甲酰三氟丙酮为主 要成分的增强液；自制含０．４％（ｖ／Ｖ）的Ｔｗｅｅｎ２０为主 要成分的ｐＨ ７．８、２００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１溶液为浓缩洗 涤液、含１０％（ｖ／Ｖ）的小牛血清和０．０１ ｇ／Ｌ乙二胺四 乙酸二钠为主要成分的ｐＨ ７．８、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１ 溶液为实验缓冲液和５％（Ｖ／Ｖ）的小牛血清、１％（ｖ／ Ｖ）的Ｔｗｅｅｎ２０和４０ ｇ／Ｌ的聚乙二醇６０００为主要成分 的ｐＨ ７．４、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐溶液为样本稀释液；处 理剂Ｂ液和ｃ液、１５０ ｎｇ／ｍｌ的乙型肝炎病毒表面抗原 灭活血清样本、１６０ ＮＣＵ／ｍｌ的乙型肝炎病毒ｅ抗原灭 体灭活血清样本、企业内部低、中、高浓度３个质量控 制品（广州市丰华生物工程有限公司）；抗－ＨＣＶ标准血 清物质ＧＢＷ（Ｅ）０９００４７（中国卫生部临床检验中心）； 第５套抗．ＨＣＶ试剂国家参考品（中国食品药品检定研 究院）；参比试剂为抗．ＨＣＶ诊断试剂盒（荧光免疫法） （苏州新波生物技术有限公司）；第三方验证试剂为抗一 ＨＣＶ诊断试剂盒（酶联免疫法）（上海科华生物工程有 限公司）和ＨＣＶ核酸定量检测试剂盒（ＰＣＲ一荧光探针 法）（中山大学达安基因股份有限公司）。 ３．主要仪器：泰莱ＴＲＦＩＡ仪、恒温振荡仪、全自动 洗板机（广州市丰华生物工程有限公司）；酶标仪（深圳 雷杜生命科学股份有限公司）；ｖｉｃｔ０ｒＴＭ２Ｄｌ４２０型ＴＲ－ ＦＩＡ仪（美国Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ公司）。 二、方法 １．固相反应板的包被与制备：将ＨＣＶ基因重组多 表位嵌合抗原用５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．８的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液 按１：１０００稀释成最佳包被浓度，处理剂Ｂ液按体积比 （ｖ／Ｖ）１：１０００加入包被液中混匀，在固相微孔板每孑Ｌ 中加入１００ ｌ抗原包被混合液，４℃冰箱孵育过夜，洗 涤１次，再每孔中加入含有１：１０００稀释的处理剂ｃ液 和１０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ的上述Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液的混合液 ２５０ ｌ，３７℃恒温箱孵育２ ｈ封闭，甩干后晾干，真空封 膜，４℃冰箱保存。 ２．铕标记物的制备：将１ ｍｇ的ＳＡ加入Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司的带有滤膜的离心管中，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心９～ １０ ｍｉｎ。再用标记缓冲液重复洗涤３～５次。将２００ ｌ 的ＳＡ和１ ｍｇ的铕标记试剂充分混匀，４℃振荡反应 （７２±２）ｈ。反应液经用５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８０ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１ 缓冲液平衡的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ柱（１ ｃｍ×４０ ｃｍ）层析， Ａ２８０监测收集第一洗脱峰。 ３．校准品的制备：将收集的抗一ＨＣＶ阳性血清按 ２０００版《中国生物制品规程》的要求对血清进行灭活 处理。以抗一ＨＣＶ标准血清物质ＧＢＷ（Ｅ）０９００４７为参 照，抗．Ｈｃｖ阳性血清用含５０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ的５０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ ７．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣ１稀释液定量稀释成０，０．０５，０．１０， ０．５０，２．００，４．００ ＮＣＵ／ｍｌ。 中华临床医师杂志（电子版）２ｏ１３年５月第７卷第９期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｙ１，２０１３，Ｖｏ１．７．Ｎｏ：９ ４．方法学的建立：本方法采用固相桥式双抗原夹 心法时间分辨荧光免疫法。在固相抗原微孔反应板中 依次加入５０ ｌ的校准品或样本，再加入５０ ｌ样本稀 释液，在室温条件下振荡反应４５ ｍｉｎ，洗板５次拍干， 表１ 自研试剂盒检测低、中、高浓度三个质量 控制品的精密度结果 加入１００ ０，１生物素化ＨＣＶ基因重组混合抗原工作液 作为桥接抗原，在室温条件下振荡反应４５ ｍｉｎ，洗板５ 次拍干，再加入１００ ｌ铕标记物ＳＡ工作液，在室温条 件下振荡反应１５ ｒａｉｎ，洗板５次拍干，加入１００ ｌ增强 液，在室温条件下振荡５ ｍｉｎ，将反应板放入泰莱ＴＲ－ ＦＩＡ仪内进行荧光计数，并用随机配备的分析软件进行 数据分析。 ５．参比试剂、第三方验证试剂与仪器操作：严格按 照试剂盒说明书操作，仪器操作按其操作规程进行。 ６。方法学评价：参考文献 对自研试剂的剂量反 应曲线、精密度、分析灵敏度、准确度、回收率、特异性、 热稳定性等分析性能指标进行评价和质量检验。参照 《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》进行临床研究 比对试验。临床研究比对试验中，自研试剂与参比试 剂结果不符的样本，自研试剂与参比试剂均需采用双 孔重复检测１次，如结果仍然不符，需采用第三方验证 试剂进行检测。 三、统计学处理 检测结果采用均数±标准差（面，４－ｓ）表示。临床研 究比对试验的一致性分析采用Ｋａｐｐａ检验。 结 果 １．方法学的反应体系：通过棋盘方阵滴配法和实 验条件优化，确定了固相包被、标记条件、加样体积、反 应时间、洗板次数等。ＨＣＶ基因重组嵌合抗原采用包 被缓冲液按体积比１：１０００稀释后进行包被，生物素化 ＨＣＶ Ｃｏｒｅ抗原、生物素化ＮＳ３抗原、生物素化ＮＳ４抗 原、生物素化ＮＳ５抗原均用同一样本稀释液按体积比 １：１０ ０００稀释混合后为最适工作浓度，标记缓冲液为 ｐＨ ９．０，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的碳酸盐缓冲液，铕标记物用实验 缓冲液按体积比１：１５００稀释后为最适工作浓度。 ２．剂量反应曲线：通过最佳曲线拟合优化，采用 ｌｏｇ—ｌｏｇＢ双对数数学模式拟合。泰莱ＴＲＦＩＡ仪上检测 试剂盒的典型剂量一反应曲线见图ｌ。以８ ＮＣＵ／ｍｌ的 液态抗一ＨＣＶ标准血清物质ＧＢＷ（Ｅ）０９００４７做线性稀 释，在０．０３１—４．００ ＮＣＵ／ｍｌ内，实测值与理论值的线 性回归方程为Ｙ＝０．９５１１Ｘ＋０．０２４５，相关系数（ｅｏｉＴｅ— ｌａｔｉｏｎ ｅｏｅｍｃｉｅｎｔ，ｒ）为０．９９９２，见图２。 ３．精密度：采用企业内部低、中、高浓度三个质量 控制品分别进行２０次检测，分析内和分析间变异系数 （ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＶ）均小于ｌ０％。结果见表１。 ４．分析灵敏度：采用０ ＮＣＵ／ｍｌ的自研试剂盒校 准品２０次的检测荧光值分别为１３３１．９６ ４－７２．３８，采用 ９５％的可信限计算检测限，结果为１４７６．７２，代人标准 曲线计算浓度为０．０１６ ＮＣＵ／ｍｌ。 ５．准确度：将８ ＮＣＵ／ｍｌ的液态抗．ＨＣＶ标准血清 物质ＧＢＷ（Ｅ）０９ＯＯ４７用含５０／Ｌ ＢＳＡ的５０ ｇ／Ｌ，ｐＨ ７．８ 的Ｔｒｉｓ．ＨＣ１稀释液准确倍比稀释成４．０００，２．０００， １．０００，０．５００，０．２５０，０．１２５，０．０６３ ＮＣＵ／ｍｌ，其实测值 与理论值的效价比在０．９００～１．１００。 ６．回收率：在０．１０ ＮＣＵ／ｍｌ的血清样本中分别加 入Ｏ．０５…１ ００，２．００，３．００ ＮＣＵ／ｍｌ的血清样本的回收 率分别是９２．１４％、９８．９５％、１０５．２３％、１０９．５４％，平均 回收率为１０１．４７％。 ７．特异性：在自研试剂盒上检测相关疾病的物质， １５０ ｎｇ／ｍｌ的乙型肝炎病毒表面抗原灭活血清样本、 １６０ ＮＣＵ／ｍｌ的乙型肝炎病毒ｅ抗原灭活血清样本、 ６４０ ｍＩＵ／ｍｌ乙型肝炎病毒表面抗体灭活血清样本、 １６ ＮＣＵ／ｍｌ的乙型肝炎病毒ｅ抗体灭活血清样本、 ８ ＩＵ／ｍｌ的乙型肝炎病毒核心抗体灭活血清样本、 ８ ＮＣＵ／ｍｌ的人类免疫缺陷病毒抗体灭活血清样本、 ２５６ ＲＵ／ｍｌ的巨细胞病毒抗体灭活血清样本、２００ ＩＵ／ ｍｌ的风疹病毒抗体灭活血清样本、２５６ ＲＵ／ｍｌ的单纯 疱疹病毒抗体灭活血清样本、０．５ Ｕ／ｍｌ的戊型肝炎病 毒抗体灭活血清样本、１００ ｍＩＵ／ｍｌ的甲型肝炎病毒抗 体灭活血清样本、１００ ｍＩＵ／ｍｌ的梅毒螺旋体抗体灭活 血清样本，其实测浓度值均小于０．０３ ＮＣＵ／ｍｌ。 ８．参考值的建立：用自研试剂盒检测４９８例抗－ ＨＣＶ阴性样本的浓度值结果经统计学分析，呈正偏态 分布。最大值为０．０７６ ＮＣＵ／ｍｌ，最小值为０ ＮＣＵ／ｍｌ， ９０％，９５％，９７．５％，９９．０％，９９．５％，９９．９％的百分位数分 别为０．００９ ＮＣＵ／ｍｌ，０．０１５ ＮＣＵ／ｍｌ，０．０２２ ＮＣＵ／ｍｌ， ０．０５１ ＮＣＵ／ｌｌｌｌ，０．０５４ ＮＣＵ／Ⅱｄ，０．０７６ ＮＣＵ／ｍｌ。９９．０％ 的百分位数为０．０５１ ＮＣＵ／ｍｌ，建议自研试剂盒采用 ０．０５０ ＮＣｕ／ｍｌ作为参考值。结果见表２。 ９．质量检验：检测第５套抗－ＨＣＶ试剂国家参考 品，３０份阴性样品Ｎ１～Ｎ３０，阴性符合率为３０／３０；３０ 中华临床医师杂志（电子版）２０１３年５月第７卷第９期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。Ｍａｙ １。２０１３。Ｖｏ１．７．Ｎｏ．９ 份阳性样品Ｐ１一Ｐ３０，阳性符合率为３０／３０；４份灵敏度 样品Ｌ１一Ｌ４，Ｌ１一Ｌ３检测为阳性，Ｉ４为阴性；１份精密 度样品Ｊ，ＣＶ为５．３４％（ ＝１０），符合国家检定标准 要求。 表２ ４９８例抗一ＨＣＶ阴性样本的浓度结果频数分布 １０．热稳定性：试剂盒放置３７℃恒温箱烘烤７ ｄ 后，对剂量反应曲线、精密度、分析灵敏度、准确度、回 收率、特异性等分析性能指标进行评价和质量检验，试 剂盒检测性能无明显改变。 １１．临床研究比对试验：１０２０例临床研究样本采 用自研试剂与参比试剂进行平行比对试验，以参比试 剂结果为参考标准，阳性符合率为９８．２９％；阴性符合 率为９９．８５％，总符合率为９９．３１％，Ｋａｐｐａ指数为 ０．９８４７；７例不符合样本经自研试剂与参比试剂均经双 孔复检仍不符合，采用ＥＬＩＳＡ法和ＰＣＲ．荧光探针法试 剂验证试验，其中１例参比试剂检测为阴性的样本经 ＥＬＩＳＡ法和ＰＣＲ法检测为阳性，６例参比试剂检测为 阳性的样本经ＥＬＩＳＡ法和ＰＣＲ法检测为阴性，表明自 研试剂盒的特异性好。结果见表３。 表３ ３家临床研究单位１０２０份临床试验样本的 对比试验评价结果（例） 讨 论 ．丙型肝炎呈全球性流行，全球ＨＣＶ的感染率约为 ３％，我国一般人群抗－ＨＣＶ阳性率为３．２％，丙型肝炎 慢性化率为５０％～８５％，慢性丙型肝炎的肝硬化率为 １０％～１５％，失代偿期肝硬化的１０年生存率仅为 ２５％，慢性丙型肝炎导致的肝硬化患者中，每年肝癌发 生率为１％～７％ Ｊ。ＨＣＶ常呈隐匿性感染，容易被忽 视。一旦感染ＨＣＶ，病程越长，越难治愈；慢性丙型肝 炎可逐渐进展成肝硬化、肝细胞癌等严重肝脏疾患，从 而造成沉重的疾病负担，故应重视丙型肝炎的筛查 Ｊ。 目前丙型肝炎已有有效的治疗药物，如能及早治疗，可 防止其发展为肝硬化和肝癌。对丙型肝炎早期筛查、 早期诊断、早期治疗十分重要 。因此，研制一种高灵 敏度、高特异、快速检测的试剂盒对丙型肝炎的防治有 着重要的意义。 目前临床常规检测抗．ＨＣＶ的ＥＬＩＳＡ法，均采用二 抗作酶结合物，由于血清中ＩｇＧ含量高，故少量的非特 异吸附即可造成假阳性结果，血清中类风湿因子等也 可能干扰检测结果。已报道的抗一ＨＣＶ ＴＲＦＩＡ法Ｌ８ 仍 采用的是间接法。间接法中包被抗原的组成和质量是 关键因素，第一代抗．ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ法采用ＨＣＶ非结构 基因（ＮＳ３／ＮＳ４）和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达 的融合蛋白抗原Ｃ１００－３，灵敏度低，漏检率较高；第二 代抗一ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ法在第一代基础上增加了核心区重 组蛋白Ｃ２２和ＮＳ３区重组蛋白Ｃ３３ｃ，在灵敏度和特异 性上有很大改善，但仍不能排除由于重组融合蛋白带 来的少数假阳性和极少数的漏检；第三代抗．ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ试剂，其包被抗原为ＨＣＶ核心抗原、ＮＳ３、ＮＳ４ 和ＮＳ５抗原，特异性超过９９％，虽然目前缺乏判断其敏 感性的金标准，但对于免疫功能正常的ＨＣＶ ＲＮＡ阳性 感染者，抗 ＨＣＶ检出率也高于９９％ｌｌ。。。研究¨ 表明 ＥＬＩＳＡ法第二代和第三代在抗一ＨＣＶ流行率小于１０％ 的免疫活性人群中，假阳性率平均约为３５％（１５％～ ６０％），在免疫抑制人群中（如血液透析患者），假阳性 率平均约为１５％。检测ＨＣＶ—ＲＮＡ的ＰＣＲ法虽可进行 早期诊断，但费时、费力，且试剂昂贵，也较难普及 １ 。 本研究采用双抗原夹心法、时间分辨荧光免疫技术建 立了抗一ＨＣＶ检测方法，试剂盒采用的包被ＨＣＶ抗原 包括了ＨＣＶ核心蛋白区Ｃｏｒｅ和非结构蛋白区ＮＳ３、 ＮＳ４、ＮＳ５基因中的多个免疫优势表位区的多表位嵌合 蛋白，解决了以往单表位抗原的配比问题，但融合表达 大分子在形成高级构象时，可能会使得一些抗原表位 无法被充分地暴露，影响抗原与抗体分子的结合，本研 究已在包被优化过程中，在包被液中加人一定量的抗 原表位复性剂，提高了对抗体的特异性识别能力。建 立抗－ＨＣＶ双抗原夹心检测的主要技术难点在于抗原 的标记，因ＨＣＶ核心蛋白Ｃｏｒｅ富含碱性氨酸，若直接 对抗原进行化学标记，会造成这些位点被封闭或者失 去活性¨引，降低了检测的敏感性甚至造成漏检，为此， 中华临床医师杂志（电子版）２０１３年５月第７卷第９期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｙ １。２０１３．Ｖｏ１．７，Ｎｏ．９ 本研究在传统的双抗原夹心法的基础上建立一种新型 的桥式双抗原夹心法，将生物素分别与ＨＣＶ核心蛋白 区Ｃｏｒｅ、非结构蛋白区ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５基因融合表达后 的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术， 该技术灵敏度可高达１０ ｍｏｌ／Ｌ，特别是采用解离增 强原理，使其荧光检测信号增强１ ０００ ０００倍，其灵敏 度高，特异性强，线性范围宽，本底噪音低等优点。本 研究按照ＧＢ／Ｔ ２１４１５－２００８＿ｌ 以国家抗．ＨＣＶ血清标 准物质为溯源品对自研试剂盒的校准品进行了赋值， 实现了抗．ＨＣＶ结果的可溯源性。 自研试剂盒经ｌ生能评价，其分析内和分析间的ＣＶ 再稀释混合作为夹心抗原，这种单表位混合的夹心抗 原，避免了嵌合抗原表位暴露不足的缺点，有利于维持 ＮＳ３区空间构象依赖的抗原决定簇识别抗体的能力， 并有利于在生产中按需适当调整混合抗原中单表位抗 原的比例，特别是ＮＳ４抗原的浓度，有利于控制试剂盒 的本底，提高试剂盒的灵敏度和特异性。又通过铕标 记的ＳＡ与生物素特异性结合使ＨＣＶ抗原蛋白间接标 记，并形成生物素．亲和素信号放大系统，与包被抗原一 起对样品中的抗一ＨＣＶ进行检测。双抗原夹心法检测 的是血清中ＩｇＧ抗体和ＩｇＭ类总抗体，且不受不同患 者对ＨＣＶ反应时所产生不同ＩｇＧ亚型的 ，抗一 均小于１０％，精密性良好，分析灵敏度不高于０．０５ ＮＣＵ／ｍｌ；与相关疾病的抗原或抗体未见明显交叉反 应，表明试剂盒的特异性良好；在０．０５—４．０ ＮＣＵ／ｍｌ 内，检测抗一ＨＣＶ标准血清物质ＧＢＷ（Ｅ）０９００４７的稀 释品，其实测值与理论值的效价比在０．９００—１．１００，平 均回收率为１０１．４７％，表明准确性好；在线性范围 ０．０３１～４．００ ＮＣＵ／ｍｌ内，ｒ可达０．９９；与荧光免疫法参 比试剂平行比对试验，总符合率为９９．３１％，Ｋａｐｐａ指 数为０．９８４７，表明自研试剂检测抗 ＨＣＶ与参比试剂具 有等效性，能满足临床检测需要。自建的抗．ＨＣＶ桥式 双抗原夹心ＴＲＦＩＡ法对于提高ＨＣＶ感染辅助诊断试 剂的特异性和检出率，缩短病毒感染检出时间，有着重 要意义。 （本文图片及参考文献见光盘） （收稿日期：２０１３－０１４）４） ＨＣＶ ＩｇＧ阳性是目前常用的ＨＣＶ感染的辅助诊断指 标，但抗．ＨＣＶ ＩｇＧ在丙型肝炎患者血清中出现较晚。 虽然抗一ＨＣＶ ＩｇＭ不仅存在急性ＨＣＶ感染者，而且在慢 性ＨＣＶ感染者亦有高达７１％一９０％的检出率，不能作 为急性感染的指标，但ＩｇＭ检测有利于急性感染的辅 助诊断，因此双抗原夹心法有利于提高检出率，可以缩 短病毒感染检出的“窗口期”。自研试剂盒采用三步法 反应检测，避免了样本与桥接抗原同加入反应引起的 Ｈｏｏｋ效应造成结果假阴性。并且自研试剂盒采用的时 间分辨免疫学技术，是２０世纪８０年代迅速发展起来 （本文编辑：戚红丹） 谭玉华，孙勇，吴道贫，等．丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨荧光免疫分析法的建立［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电子版，２０１３，７（９） ３８１４－３８１９． ・消息 ・ 《先天性心脏病手术图谱》书讯 《先天性心脏病手术图谱》由美国著名先天性心脏病外科专家Ｌｉｔｗｉｎ教授撰写，中文版由邓勇志、李保等医师翻译，著名先天性 心脏病专家刘迎龙教授审校，原书作者为中文版作序，大１６开，铜版纸全彩色印刷，全书４８８页，９８．７万字，于２０１１年ｌ２月由人民卫 生出版社出版发行。定价１９９元。 本书以７００多幅逼真的术中照片和详细的标注为特征，作者通过全彩色照片展示了对手术技巧的理解和对术中奥妙的领悟。本 书基本涵盖了所有先天性心脏缺陷性疾病，首先通过照片描述修复前的病理改变，然后从简单的房间隔缺损到复杂的病变如完全型 大动脉转位的修复逐一介绍手术步骤和矫治技巧。对术中安全措施和失误防范有非常精当到位的简明提示。通观全书，标注详尽的 照片生动地展示了先天性心脏畸形的病理改变和外科解剖的三维空间关系。本书既是教科书，又是图谱，是每一位从事先天性心脏 畸形治疗的心外科医师难得的有益参考资料。处于先天性心脏病职业生涯培训任何阶段的学生和医师也可通过阅读本书有关心脏 解剖和外科手术的极佳照片而从中获益。本图谱也是所有儿童医院、儿童心脏中心、心血管病专科医院以及进行先天性心脏病手术 的综合医院图书馆的重要参考书，尤其是进行对于心脏内、外科临床医师培训的医院会有很大帮助。 人民卫生出版社（ｗｒｃｃｗ．ｐｍｐｈ．ｃｏｒｎ）、国内各大书店及图书网站（卓越网、当当网等）均有销售。
