实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）
一、实验原理
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。反应式： (NH2)2CO+ H2O 脲酶 2NH3 + CO2
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。反应式：
NH3·H2O＋2K2HgI4 + 3KOH HgO·HgNH2I ＋7KI + 3H20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤
将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：
取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂： 试管号步骤 （1）适当稀释的待测酶液（mL） （2）标准硫酸铵溶液（mL） （3）蒸馏水（mL） （4）1 mol·L -1 H2SO4（mL） （5）25°C恒温水浴中平衡5min。 （6）3%尿素（mL） -1
1 0 0 2.00 1.00 1.00 2 0 0.30 1.70 1.00 1.00 3 1.00 0 1.00 0 1.00 （7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min，立即向样品管（3号管）加1 mol·L H2SO4 1.00mL，终止反应。 ① 反应液（mL） ② 蒸馏水（mL） ③ 纳氏试剂（mL） 比色记录A260nm 三、结果计算
脲酶活力（U · mL -1) = ( A3 - A1 ）* 标准管中的NH3微摩尔数 ( A2 - A1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂
1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷
0.20 4.30 0.50 A1 0.20 4.30 0.50 A2 0.20 4.30 0.50 A3 （8）另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。 （9）各管混匀后，30min内，用分光光度计测试：
酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。 4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5 、1 mol·L H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g， 蒸馏水溶解，并定容至100mL 。此溶液含NH3为40μmol·mL-1。
7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70 mL30% KOH ，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。
在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2 和7 g KI于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。（配置方法之二）
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