主鬯垫塑 生！旦第１２卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｊｕｌｙ ２０１２，Ｖｏ１．１２，Ｎｏ．７ 结核分枝杆菌效应Ｔ细胞斑点试验在临床快速诊断 结核病中的应用研究 布红丽智霞萍张娇月 【摘要】 目的探讨结核分枝杆菌效应Ｔ细胞斑点试验（ＥＬＩＳＰＯＴ－ＴＢ）在临床快速诊断结核病中的应用 利用ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ方法检测外周血中结核分枝杆菌效应Ｔ细胞的频率，同时与涂片抗酸染色及 ２００例结核病患者中，１６５例ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ阳性，提示方法敏感度为 价值。方法ＢＡＣＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄ结核菌培养做比对。结果８２．５％（１６５／２００），显著高于其他方法。７０例非结核其他呼吸道疾病组中有１０例阳性，８０名健康对照组中有１０ 例阳性，方法的特异度为８６．７％（１３０／１５０）。结论ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ方法的敏感度和特异度均很高，在结核病的快速 诊断中，尤其是菌阴患者的诊断中．有重要的临床价值。 【关键词】 结核；诊断；敏感性与特异性；结核分枝杆菌效应Ｔ细胞斑点试验 Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｅｓｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｑｕｉｃｋ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＢＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉ＊，ｚＨｌ Ｘｉａ－ｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｏ－ｙｕｅ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ Ｆｏｒｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ。ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔａｉｙｕａｎ．Ｓｈａｎｘ ０３０００１．Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｅｓｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｆＥＵＳＰＯＴ—ＴＢ、ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｑｕｉｃｋ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｔｉｓ Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆＰＢ１ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｉｄ ｆａｓｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ＢＡＣＴ／ ＡＩＪＥＲＴ ３Ｄ ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ０ｆ ２０ｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．１６５ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｆ０ｕｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ．ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＥＬＩＳＰ０Ｔ．ＴＢ ｈａｄ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ８２．５％（１６５／２００１ ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｎｏｎ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ（ｎ＝７０） ａｎｄ ｔｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｎ＝８ｏ），ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｂｅｉｎｇ ８６．７％（１３０／１５０）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＥＬＩＳＰＯＴ－ＴＢ ｈａｄ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ＴｈＵＳ．ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ｍａｊｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌ— ｕｅ ｉｎ ｑｕｉｃｋ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ；Ｔｅｓｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｒＥＬＩＳＰ０Ｔ．ＴＢ１ 结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据世 测定的是分泌细胞因子的活细胞数。实验采用结核 分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞，通过 捕获细胞分泌的细胞因子＾ｙ一干扰素（ＩＦＮ一＾ｙ），检测 界卫生组织（ＷＨＯ）估计，全球大约有２Ｏ亿感染结 核分枝杆菌，每年约２００万人死于结核病。卫生部 已将结核病列为全国重点控制的重大疾病之一。近 年来结核病的发病率有上升趋势。结核病可侵犯全 身各个系统．导致临床表现复杂多变，尤其是肺外结 核常因病情隐匿或临床表现不典型误诊漏诊。传统 的临床诊断结核的实验室方法有限，临床迫切需要 一体内抗原特异性Ｔ细胞的应答反应．从而判断结核 感染状态。同时与涂片抗酸染色、ＢＡＣＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄ 结核菌培养进行对比，探讨该方法在早期诊断结核 种准确、快速、可靠的检测结核分枝杆菌感染的方 病中的价值。 １资料和方法 １．１研究对象 收集我院２０１０年３月至８月住院结核患者 法，因此，发展能用于诊断结核的快速敏感的实验室 技术十分重要。新近开发的结核分枝杆菌效应Ｔ细 胞斑点试验（ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ）技术是一种酶联免疫斑 点技术，其原理与酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）类似，但 基金项目：国家“十一五”传染病重大专项课题（２００８ＺＸ１０００３— ００１） ２００例为结核病组，其中男性９８例，女性１０２例，年 龄１８～７４岁：其中涂片抗酸染色阳性患者１００例， 阴性患者１００例。其他呼吸道疾病患者７Ｏ例，其中 肺癌患者３０例，支气管扩张１５例，慢性阻塞性肺疾 病（ＣＯＰＤ）１５例，慢性支气管炎ｌ０例。健康体检者 ８０名为健康对照组，男性４９名，女性３１名，年龄 作者单位：０３０００１太原市第四人民医院检验科（布红丽、张娇月）， 院感科（智霞萍） 中国药物与临床２０１２年７月第ｌ２卷第７期ＣｈｉｎｅｓｅＲｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｊｕｌｙ ２０ｌ２１ ０１．！ ！ ．７ ２０－５５岁。 表１ ３组ＥＬＩＳＰＯＴ－ＴＢ检测结果 １．２方法 １．２．１ ＥＬＩＳＰＯＴ ＴＢ技术：采用上海铭源数康生物 芯片有限公司研制的《结核分枝杆菌效应Ｔ细胞检 测试剂盒（酶联免疫斑点法）》。（１）操作步骤：①采 集肝素锂抗凝的外周血５ ｍ１行外周血单个核细胞 分离．然后制备成浓度为２．５￣１０ 个／ｍｌ的单核细胞 表２ ＥＬＩＳＰＯＴ－ＴＢ检测敏感度和特异度比较分析 悬液。②每份待测样本需３个反应孔：空白对照、阳 性对照、样本检测。空白对照孔加人５０ ｌ无血清培 养基，阳性对照孑Ｌ加入５０ ｌ阳性对照刺激物，检测 孔加入５０ ｌ结核杆菌特异性刺激抗原。每孔加入 １００ ｔｘｌ配置好的单核细胞悬液，３７℃、体积分数为 ５％ＣＯ：培养箱中培养１８～２０ ｈ，磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ） 率为８２．５％。ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ在结核性疾病的检出率高 于其他检查方法，差异有统计学意义 ＝５０．５９，Ｐ＜ ０．０５）。 表３ ３种方法检测结果比较 洗板７次。③每孑Ｌ中加入１００ ｔｘｌ标记抗体工作液， ３７℃孵育１ ｈ，ＰＢＳ洗板５次，加入１００ Ｉｘｌ酶结合物 工作液，３７℃孵育３０ ｍｉｎ，洗板５次。④每孔加入平 衡至室温的显色液５０ ，置３７℃闭光显色７～ｌ５ ｍｉｎ至斑点显示出合适大小。用放大镜计数每个孑Ｌ 的斑点。（２）结果判断：①空白对照孑Ｌ斑点＜１３，且检 测孔斑点数一空白对照孔斑点数≥ｌ３；②空白对照 孔斑点≥ｌ３，且检测孔斑点数≥２×空白对照孔斑点 数，符合上述标准为阳性，不符合上述标准，且阳性 对照孔正常时，结果为阴性。 １．２．２涂片抗酸染色及ＢＡＣＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄ结核菌培 ２＿３ ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ分别与涂片抗酸染色及ＢＡＣＴ／ ＡＬＥＲＴ ３Ｄ培养的比较：见表４，５。１００例涂阳结核 患者中，ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ阳性为８８例，阳性率为８８％； １００例涂阴结核患者中ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ阳性为７７例。 阳性率为７７％。８５例ＢＡＣＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄ培养阳性 养：具体操作严格遵照标准操作规程（ＳＯＰ）文件，并 参照《全国临床检验规程》第３版执行。 １．３ 统计学处理 采用ＳＰＳＳ １３．０统计软件进行 检验，Ｐ＜Ｏ．０５ 为差异有统计学意义。 ２结 果 中，ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ阳性为８２例，阳性率为９６％；６７例 ＢＡＣＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄ培养阴性中。ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ阳性为 ５２例，阳性率为７８％。本研究表明ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ检 测在涂阴和培阴的患者中阳性率也较高．ＥＬＩＳＰＯＴ． ＴＢ对于及时发现菌阴的结核病患者有重要意义。 表４ ＥＬＩＳＰＯＴ－ＴＢ与涂片抗酸染色的比较 ２．１ ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ测试结果：２００例结核病患者中， １６５例ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ阳性，该方法敏感度为８２．５％。 肺结核及非结核其他呼吸道疾病患者、健康对照组 检测结果见表１。２００例肺结核患者中，１６５例 ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ阳性，其余为阴性；７０例非结核其他呼 吸道疾病组，１Ｏ例ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ阳性．其余均为阴 性；８０名健康对照组１Ｏ例ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ阳性，其余 均为阴性．表明该方法的特异度为８６．７％（１３０／ １５０）。ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ检测敏感度和特异度比较见表 ２。 ３讨 论 近年来，结核病疫情呈上升趋势。目前结核病的 诊断依然以细菌学检测为主。然而，涂片法敏感性 低，特异性差，各种分枝杆菌均可着色，需进一步鉴 定是否为结核分枝杆菌，而且无法区分死菌、活菌。 罗氏培养法虽是高敏感性方法．也是当今结核病确 ２．２ ３种方法检测结果的比较：见表３。本研究临床 诊断明确的结核患者涂片抗酸染色的阳性率为 ５０．０％，培养阳性率为５５．９％，而ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ阳性 中国药物与ｌ临床２０１２年７月第１２卷第７期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｊｕｌｙ ２０１２，Ｖｏ１．１２，Ｎ０．７ 表５ ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ与ＢＡＣＴ／ＡＬＥＲＴ ３Ｄ培养的比较 的细胞数目，准确判断机体是否存在结核感染，具有 较高的敏感性，且其选用的抗原在卡介苗菌株及大 部分环境分枝杆菌中缺失，因此不受卡介苗接种和 大部分环境分枝杆菌的影响，也不受年龄、性别、治 疗方法及免疫功能的影响，具有较高的特异性。 据报道，ＥＬＩＳＰＯＴ—ＴＢ对免疫正常的成年人活动 诊的依据和其他实验室方法的“金标准”，但仍有报 性肺结核诊断的敏感度为８３％～９７％．特异度为 告结果延误和无法培养出生长异型菌的缺陷。快速 仪器培养缩短了培养时间，平均报告时间为７ ｄ，为 ８５％～１００％。国内张瑛等［１］和邹盛华等［ｚ］的研究显示 该方法敏感度分别为９４．４％、９４．５％，特异度分别为 结核病的快速诊断提供了有效方法。但是。由于痰 液标本质量的不确定性，以及部分患者痰标本不易 取得，也影响了细菌学检测方法的敏感度。结核菌 素试验（ＰＰＤ皮试）是临床常用的筛查结核的方法， 因操作简单、快速，在临床上广泛使用，但对于感染 结核菌２周之内、近期免疫受抑制的患者，特别是合 并人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）感染、重症疾病者、年幼 儿童及营养不良、器官移植者，缺乏足够的灵敏度。 这使得结核菌素试验在结核病诊断应用中受到限 制。血清学诊断已成为结核病诊断的快速辅助手段， 但特异性差，敏感性低。聚合酶链反应（ＰＣＲ）为结核 病的快速诊断开辟了新途径，但由于假阳性较高影 响了结果的可靠性．其Ｉ临床应用受到了。诸多 因素制约了结核病的早期诊断与治疗。 ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ基于酶联免疫斑点技术，检测分泌 ＩＦＮ． 的外周血结核分枝杆菌效应Ｔ细胞，其原理 是Ｔ细胞受结核杆菌刺激致敏，形成活化的效应Ｔ 细胞，这些Ｔ细胞在体外受到结核分枝杆菌特异性 抗原刺激后可产生应答，分泌ＩＦＮ． 。提取患者外周 血中的Ｔ细胞，经体外培养受结核杆菌早期分泌靶 向抗原（ＥＳＡＴ．６）和培养滤过蛋白（ＣＦＰ１０）２个特异 性片段的重组融合抗原刺激后分泌ＩＦＮ． 。ＩＦＮ一＾ｙ被 反应板上预包被的特异性抗体捕获，捕获的ＩＦＮ． 与生物素标记的抗ＩＦＮ一 不同表位的抗体结合，在 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素一生物素放大系统作 用下．显色液在反应部位被酶分解成深蓝色斑点。 每个斑点代表１个ＩＦＮ． 分泌细胞（结核特异的效 应Ｔ细胞）。通过斑点计数可推测体内是否存在对 结核杆菌敏感的效应Ｔ细胞，从而对结核杆菌患者 进行辅助诊断。本方法在单细胞水平检测分泌ＩＦＮ． ９５．２％、９３．８％。本次试验该方法的敏感度为８２．５％， 特异度为８６．７％，与以上研究基本一致。 ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ在菌阳患者中的检出率是８８％， 在菌阴患者中的检出率为７７％Ｅ引，说明该方法在涂 阴、培阴患者中有很好的临床诊断意义。约占结核 患者一半的涂阴、培阴患者不能及时发现．他们随后 可发展成涂阳患者，最近的分子指印技术证明．由于 密切接触和免疫抑制．菌阴患者的传染性比原来认 为的要高。因此，及时发现菌阴的患者，对控制结核 病的传播，对有效遏制结核疫情居高不下的状况，有 着重要的现实意义。 总之，ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ技术有较高的敏感性和特异 性，所需时间少，２４ ｈ即可出结果，尽管目前操作繁 琐，成本较昂贵，但是在临床症状不典型、ＰＰＤ诊断 不明确、涂片及培养均为阴性的疑似结核患者．不易 获得痰标本的儿童结核和肺外结核患者，辅以 ＥＬＩＳＰＯＴ．ＴＢ，对确诊结核感染可以提供帮助［４］。当结 核菌被消灭后，随着人体对结核杆菌免疫反应的逐 渐减弱，效应Ｔ细胞也会逐渐减少直至消失Ｅ ．定期 测定效应Ｔ细胞也可对机体是否清除了结核菌进 行有效的临床疗效评估。 参考文献 ［１］张瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等．结核感染Ｔ细胞斑点试验在结核性 疾病中的诊断价值．中华临床医师杂志，２０１０，４（１２）：２４３１— ２４３４． ［２］邹盛华，张丽水，黄明翔，等．结核感染Ｔ细胞斑点试验Ｉｆ每床检 测研究．中国防痨杂志，２００９，３１（９）：５３９—５４２． ［３１史可云，胡忠义．酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用现 状．中华结核和呼吸杂志，２００６。２９（６）：４１４—４１６． ［４］肖倩，黄旭峰．Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ试验快速检测结核杆菌感染的临床 应用研究．实验与检验医学，２００９，２７（３）：２７２—２７４． （收稿日期：２０１ １－ｌ０—０９）
