基于G-四链体-氯化血红素DNA酶比色法测定银离子和汞离子传感器的构筑

银离子和汞离子传感器的构筑肖志友**，司恒丹，邓兰清，龙 丽，居荣梅，张 鑫，刘益飞

(贵州理工学院 化学工程学院，贵州 贵阳554003)摘 要：利用G-四链体DNAQWTGGGAGGGAGGGAGGGA氨)与氯化血红素结合形成G-四链体-Hemin

DNA酶，其能高效催化比。5氧化反应底物由无色变为绿色，当溶液中有Ag+或Hg5+存在时会阻碍该DNA

酶的形成，导致绿色溶液变浅。基于此，建立了比色法测定Ag +和Hg5+的传感器。在最佳实验条件下，溶

液的吸光度与Ay +和Hg5 +浓度分别在50. 0 - 9 000. 0 nmol/L和80. 0 - 800. 0 nmol/L范围内具有良好的线性 关系，检岀限(32/210X0)分别为55. 0 nmol/L和. 3 nmg/L。该方法具有较好的选择性，采用该方法对实际

样品进行测试，结果满意。关键词：G-四链体-氯化血红素DNA酶；比色法测定；银离子；汞离子；传感器

中图分类号：O657. 63； 065. 22

文献标识码：A 文章编号：504 - 4957(202 ) 07 - 0840 - 05Fan/cotiou of a Sensor for Colorimetric Determination of Silver and Mercnry Iony

Based on G-ptadruplea - Hemin DNAzymooXIAO Zhi-you* , SI Heqg-Sad, DENG Lgt-ping, LONG Li, JURong-mei, ZHANG XV, LID Yi-fei(School of Chemical Engiuee/ng, Guizhou IusPtutc of Techuology, Guiyang 554003, China)Abstract ： A sensor for coU/vetuc Ueteunination of silver and m—cog Vus based on G乙uPrupUa -

hemin DNAzymat was gp/cat—. The GqudtupUa - hemin DNAzymat was form— bf the combina- tiou of G-quPupma(5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA-3') with hemin, which could catalyea HO2 to

oxide the suUstrata eUiciectlf, and made the colorlest solution become green. The pus—a of Ay +or Hg0+ V the solution would hindef the founatiou of the DNAzyme, and the solution color became lighter. Under the optimal expe/v—ul coudiCout, there were good /near uUtUnships for the P-

sorbanco of the solution with Ay+ and Hg2 + V the cone—VPUu ranges of 170. 0 - 1 000. 0 nmoUL and 80. 0 - 0. 0 nmoUL, with detection /mCt(32/Smpe) of 55. 0 nmol/L and 69. 3 nmoUL, u-

spectivvlf. This method was of good selectivitf, and was applied it the detection of real samples with satisfactou usu/t.Key worbs: G—uPrupUa - hemin DNAzymet: coU/vetric determination, silver ion; merchg nog； segsoo银离子在制药、化工、制镜、电子工业中有较多应用［1］，其对人体的潜在危害逐渐受到人们的重

视，如导致人体疏基酶失活，引起肝肾损害，结合代谢分子中氨基、n基等［0-9］。汞离子是公认的高

毒性重金属离子，其通过火电厂煤燃烧、金矿开采、化石燃料燃烧、固体废弃物焚烧等途径进入人类

生存的环境中，并能在人体细胞中累积，从而对人体心脏、肾脏、免疫系统、中枢神经系统等产生损 害s-3。因此，建立简单、灵敏、高选择性测定银离子和汞离子的方法具有重要意义。G-四链体-氯化血红素DNA酶是一种由富含鸟瞟吟碱基G的DNA序列与氯化血红素(Hemin)结

收稿日期：2019 -03 -17；修回日期：255-04-25基金项目：国家自然科学基金资助项目(4176302)；贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J字［2015］ 2263号)；贵州理工学院高

层次人才科研启动经费项目(XGC2018125)；贵州理工学院大学生创新训练项目(201814440229)*通讯作者：肖志友，博士，副教授，研究方向：光谱分析、纳米生物分析，E - mail: zyxiao@ gio edu. 3k第7期肖志友等：基于G-四链体-氯化血红素DNA酶比色法测定银离子和汞离子传感器的构筑849合而形成的具有类似过氧化物酶活性的人工模拟酶［5］，该DNA酶能高效催化比。4氧化反应底物（如

2, 2，-联氮-二（3-乙基苯并-{-6-磺酸）二钱盐，ABTS）产生明显的颜色变化，利用金属离子能促进或

阻碍G-四链体-Hemin DNA酶的形成，导致溶液颜色发生改变。相关比色法测定金属离子的传感器已 有很多报道，在银离子传感器方面,L和Kong等［9-2］利用Ay+通过C -Ay+ - C配位键促进G-四链

体-Hemin DNA酶的形成建立了比色法测定银离子的传感器，Zhou等［5］利用Ay +与鸟瞟吟碱基G结

合阻碍G-四链体-Hemin DNA酶的形成构筑了比色法测定银离子的传感器；在汞离子传感器方面，Lu 和Kong等［5-5］利用Hg2+形成T- Hg0+ -T配位键抑制或促进该DNA酶的形成，从而建立了比色法

定量检测汞离子的传感器。上述传感器虽具有较好的灵敏度和选择性，但仅限于单独测定银离子或汞

离子，未见同时对银离子和汞离子产生响应的G-四链体-Hemin DNA酶传感器报道。本研究中，笔者

通过选择合适的G-四链体DNA传感序列，利用Ay+和Hg2 +阻碍G-四链体-Hemin DNA酶形成，建立

了比色 同 测 离子和 离子的传 器。1实验部分1- 1仪器与试剂PE - Umbda 35紫外可见分光光度计（珀金埃尔默公司）,Chimscan圆二色谱仪（英国应用光物理公

司），yHS_3CyH计（上海雷磁仪器厂）o银、氯化汞、氯化血红素（Hemid）、钠、钾、二甲亚X（DMSO）（上海国药集团化学

试剂有限公司）；2, 2，-联氮-二（3-乙基苯并-{咻-6-磺酸）二钱盐（ABTS）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠

（上海生工生物工程有限公司）；32%过氧化氢（成都金山化学试剂有限公司）；以上试剂均为分析纯。

G-四链体序^列（EAD2, 5\\CTGGGAGGGAGGGAGGGA5）及富含胞in碱基C的DNA序列购于上海生

工生物工程有 。显色工作缓冲液（自制含 20. 0 mmol/L KNO3、220. 0 mmol/L NaNO3、7. 0 mmol/L ABTS、22 mmoU L pH 7. 9的PBS缓冲溶液）；7 mmoUL Hemin储备液用DMSO配制于冰箱-22 C保存,使用时用DM-

SO进一步稀释为Hemin工作液；实验用水均为二次蒸僧水。1.2紫外可见吸收光谱及吸光度的测定室温27 C下，在总体积为50. 0 aL pH 7. 9的20 mmoUL PBS缓冲溶液（含20. 0 mmol/L KNO7、 50. 0 nmol/L EAD2、200. 0 mmoUL NaNO7）中，力口入不同浓度 Ay*保留 32 mix 后，力口入 100. 0 nmoUL

Hemin保留25 mV。取前述混合溶液5.0 aL于500 aL离心管中，加入490. 9 aL显色工作缓冲液、

7. 0 aL 32 mmoUL H2O2溶液，摇匀，显色27 min。采用PE - Umbda 35紫夕卜可见分光光度计扫描溶液在

394 - 450 nm波长范围内的紫外可见吸收光谱，或测其在422 nm波长处的吸光度（4）。1. 3圆二色光谱的测定在体积为 1 000 aL pH 7.5 的 20 mmol/L PBS（含22 mmoUL KAc、200 mmoUL NaAc）缓冲溶液中， 第1组样品加入7 amoUL EAD2保留32 mV,第2组样品加入7 amoUL EAD2及52 amoUL Ay+或

Hy2 + a留32 mV,第3组样品在第1组和第2组样品基础上分别加入6 amoUL Hemin保留25 mV。所

有样品溶液使用光径为/ 0 mm的石英样品池在Chirascan圆二色谱仪上进行测定。测定参数：扫描速率

100 nm/mix,带宽1.0 nm,响应时间0.5 s,步长1 nm,扫描次数3次。2结果与讨论2. 1实验的可行性分析从文献报道［4］的G-四链体DNA序列中，本文选择具有较高过氧化物酶活性的G-四链体DNA序列

J EAD2, 7 -CTGGGAGGGAGGGAGGGA5 ）作为识别银离子和汞离子的传感器序列。为了检验该方法的

可行性，实验对G-四链体DNA酶显色溶液加入金属离子前后颜色的变化及扫描的紫外可见吸收光谱进 行了比较。图la为加金属离子前显色溶液的紫外可见吸收光谱，可观察到在422 nm处有1个很强的

吸收峰，对应溶液为绿色；而图lb、c分别为加入1 000. 0 nmoUL银、汞离子后显色溶液的紫外可见

吸收光谱，可观察到422 nm处吸收峰的强度均明显降低，且溶液基本变为无色，说明该方法可用于比

842分析测试学报第33卷色法测、汞离子。了进一步考察G四 DNA测 离子的作用机理，采用圆二色谱对有

EAD2溶液进行了研究。如图2所示，

离子的离子的G四 溶液在263 mn处有1个明显的正圆二色峰，这是形成平行G四 结构的典征［13-4-。当溶液中加入银离子后（图2A）, 260 mn处的色谱峰明显减弱，表明银离子可能与鸟

碱基G 阻碍了 G四 结构的形成［3-； 入汞离子后（图2B）,该色谱峰同样明显减弱，表明汞离子可能通过非T-Hg2+ -T配 图1 G四链体DNA酶显色溶液不含银离子与汞离子(o)

以及含 1 000. 0 nmol/L 银离子(U)、1 000. 0 nmo/L 汞离 位作用 G四 结构的形成［—-。存在Hemix溶液的圆二色谱变化类似，说明Hemix对银离子

子(c的紫外可见吸收光谱和颜色变化Fig. 1 UV - Vis absorption spectre and coles change of the chmmoyenic solution of G-quaVupmx - hemin DNAzymes in the absence of silver ion and meuary ion( o) , and inthe presence of 1 000. 0 nmo/L silver ion( U) and

或汞离子与G四 相互作用的影响不大。2.2实验条件的优化G四链体-Hemix DNA酶显色溶液的吸光度

受多种因素影响，为了获得加入相同量 离子1 000. 0 nmo/L meuary ion( c)-,本文对影响显色溶液吸光度的实验条件进行了优化。图2加银离子前后(A)与加汞离子前后(B)的G四链体DNA溶液的圆二色光谱Fig. 2 CD spectre of G-quaVupmx DNA solution in the presence and absence of silver) A) and memory( B) ions2. 2. 1溶液pH值的影响 由于溶液的pH值会

影响G-四 结构的形成及显色溶液的吸光度大验对溶液的pH值进行了优化。如图3

所示，虽然pH 7. 0时G-四链体-Hemix DNA酶

显色溶液的吸光 化值（4A）最大，但从插图 可 看出，此 入银离子溶液的吸光度约0.5 ,

溶液 显绿色；而当pH为7.0时，存在同样 量的银离子,溶液的吸光度约为0.2 , 无色。因

此，本实验选择pH 7.5： 2.2.2保留时间的影响

DNA作用

溶液的最佳pH值。离子与「四 ：的长短会影响DNA酶的形成，从

图3溶液yH值对体系吸光度的影响Fig. 3 EEect of solution pH value on absoi/ance of the systeminseU: plot of aVsorgance of the system with er without Ag + vs. pH value影响 显色溶液 吸光 的大 因此 验

离子 的保留 行了优化。结果显的吸示，加Ag +后保留 大于34 mix时，

第7期肖志友等：基于G四链体-氯化血红素DNA酶比色法测定银离子和汞离子传感器的构筑343光 化值不再增加。因此，本实验选择32

miu )

离子与G四 DNA的最佳保留时。2. 2. 3钠浓度的影响 钠浓度会影响 EAD2折叠为G四链体结构及DNA酶的形成，从

而对显色溶液的吸光 生影响， 验对 NaNO浓度进行了优化。结果显示，随着NaNO

浓度的增加，加入相同量a(+引起的吸光度变化

值(ZU)增加，当浓度达到200.0 mmoUL时,AA

最大，继续增大NaNO浓度，44反而降低。因 此，

mmoUL。验选择NaNO的最佳浓 200.4图4不同浓度Ay )存在下显色溶液的紫外可见吸收光谱Fig. 4 UV - Vis adsoi/tUu spectre of the color solution it the2.3线性 与检出presence of di/erent concentrations of Ag +

concentration of A/ + ( a - i) ： 0. 0, 140.0, 200.0, 320.0, 400.0,

在最 验 下，考察了加入不同浓度银 离子和汞离子时，显色溶液在422 mn处吸光度

500. 0, 750. 0, 1 000. 0, 1 750. 3 nmol/e；的变化(图0)o结果显示，溶液的吸光度值(4)

与银离子浓度(C, nmol/L)在50. 0 - 1 000. 0 nmol/L范围内呈良好线性关系(图4插图),线性方程 为：4 二-3 272 xl4-4C+0. 355 3,相关系数(O 为 0.9913,检出限(32/Smpo)为 55. 9 nmoUL。同样

考察了不同浓度汞离子对溶液在422 mn处吸光度的变化 。结果显示，溶液的吸光度值与汞离子浓在80.4- 800.4 nmoUL范围内呈良好的

inseU: the plot of the assay，线性方程为:4二-5.459 x 10\"C+0. 713 1,相关系数(O为0.992 6,检出限(32/21ouo)为 .3 nmoUL。2. 4方法的选择性了 考 察 方 的 择 ， 验1 000. 4 nmoUL银离子、汞离子及5种常见其他

离子(Ba0+、Pb2+、Me0+、Mu0+、Co2+、

Fo3+、A13+、Z/+、0-+、N/+ )与 G-四链体

DNA作用后的溶液在422 nm的吸光度值进行对

比。如图5所示，只有银离子和汞离子存在会导

致溶液的吸光度明显降低，其他5种常见

离子的测

】:离子对溶液的吸光度几乎无影响。其中汞离子对

扰可通过加入EDTA ,

离子 离子的测定干扰可通过加入富含胞in碱基 C 的 DNA(5Z-CCACCACCACACACCACCACC- 3)消除。该方

有 的选择性，既可用于离子的测 。图5方法的选择性Fig. 5 Selectivity of the assay离子的测 可用

2.5水样中 的测定中的银离子和汞离子含量进行测定，均在最 验 下,采用该方法对贵阳市蔡家

未检出，进一步进行不同浓度(200.0、754. 4 nmol/L)银离子和汞离子的加标回收实验，测定结果见

表1。样品的加标回收率为94. 3%〜99. 5%,相对标准偏差(RSD)为2. 9%〜5. 4%。说明该方法用于银

离子和汞离子测 有 的精密度和重现性，可用 际样品的测定。944分析测试学报第30卷表-水样中银离子和汞离子的测定Table - Determiuatiou of Ag + and Hg2 + ix water samplesAnalyteAg +Hg5 +(o=9)RSD(% )Addeh (nmo/L) 7. 7 , 200. 7 , 730. 7

Fonud(nmo/L)

Ruxeu(%)- * , 187. 3 , 747. 3 - , 94. 9 , 99. 0-,4.0 , 5.0-,4.0 , 4.37.0, 220. 0 , 730. 2 -, 192.0 , 715.5 -, 95. 3 , 95.4* nc data3结论本文基于G-四链体(5'OTGGGAGGGAGGGAGGGAO)与氯化血红素(Hemin)结合形成G-四链体-He­

min DNA酶后,能高效催化比。2氧化反应底物(ABTS)使得溶液由无色变绿色，当溶液中存在Ag+或 Hg2+^会阻碍该DNA酶的形成，溶液绿色变浅，从而构筑了比色法测定Ag + 和 Hg0+的传感器。在最

佳实验条件下，溶液的吸光度与Ag+和 也八的浓度分别在100. 9 - 1 000. 9 nmol/L和86. 9 - 860. 9

nmo/L范围内具有良好的线性关系，检出限分别为55. 9 nmo/L和07. 0 nmo/L。该方法具有较好的选

择性，采用该方法对实际样品进行测试，结果令人满意。参考文献：[1- [2-

Lu Z , Lin Y , Lu S , Li Y , Lin X , Qix Y , Zheng L. RSC Adv. , 2018 , 8(35) : 1770( - 16740.Kim S , Choi 0 E , Choi 0 , Chung K H , Park K , Yi、，Ryn DY. Toxicol. Vitro , 2009 , 23(0) : 1076 -—84.Jia S M , Lin X F , Li P , Koug D M , Sheu H X. Biosecc. Aioelectroo. , 2011 , 27(() : —3 - 132.[3 - [4- [5- [6- [7- [8- [9-

Xiao Z Y , Guo X T , Ling L S. J8fefm.Afe (肖志友，郭晓婷，凌连生.分析测试学报),2010 , 32(9)：1117-117(.ZUve Y , Yang X , Cui L , Sun Y , Soug Q. Dyes Pinmente. 2010 , 134: 2( - 22.Cheu B , Lin J , Yang T , Cheu L , Hx J , Feug C , Huang C Z.

Talanto, 2019 , (91 : 357 -363.Li L , Weu Y , Xu L , Xu Q , Soug S , Zuo X , Yan J , Zhang W , Lin G. Bioseos. Bioelectron. , 2016 , 75 : 433 -445.Leug T , Ma Y , Cheu G. J. Ahotocoem. AhotobioO A , 2010 , 353 : —3 - —7.Ami/an- A , HagVsPedgs D F. Talaatu, 2010 , —2 : 418 -423.Koug D M. Pug. Chem.(孔德明.化学进展)，2011 , 23(10)： 2117 -218(.Li T , Shi L , Wang E , Doug S. Chem - Eau J. , 2009 , 13(14) : 3347 -3350.Koug D M , Cai L L , Sheu H X. Analyst, 2010 , 135(6)： —53 -1759.[10-

[1(-

[—- [13-

ZUon X H , Koug D M , Sheu H X. And. Ahem. , 2010 , 82(3)： 77-793.[—-Li T , Doug S , Wang E. And. Chem. . 2009 , 8((6)： 2—4 -2—7.[13- Lu N , SUve C , Deug Z. Analyst, 2009 , 134(9)： 1822 -1825.[17- Koug D M , Wang N , Guo X X , Sheu H X. Analyst, 2017 , 135(3)： 545 -549.[—-CUeug X , Lin X , Bing T , Cao Z , SVanggpan D. Biocoemistru, 2009 , 48(33)： 7317 -7323.[18-

Koug D M , Cai L L , Guo J H , Wu J , Sheu H X. Biopolymers, 2010 , 9((5) : 33( -339.[—-Zhu LN , Wang H X , Sun RF , Li P , Koug D M , Li X乙 Chin. J 0x101. Ahem.(朱莉娜,王海仙，孙润丰，李平，

孔德明，李孝增.无机化学学报)，2013 , (10)： 2213 -2224.（责任编辑：龙秀芬）