鞘氨醇对人结肠癌细胞的抑制作用

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【论　　著】

鞘氨醇对人结肠癌细胞的抑制作用3

宋士利1,李百祥1,韩云峰2

　　摘　要:目的　研究鞘氨醇对人结肠癌细胞的影响。方法　采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)、细胞核分裂指数和

3

H-TdR掺入试验方法,所设剂量鞘氨醇分别为0,0182,1163,31125,6125,1215μmol/L,以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。结果　鞘氨醇对HT-29细胞的生长有明显抑制作用。在MTT试验中,不同浓度鞘氨醇对HT-29细胞的7d抑制率分别为18%,45%,72%,87%和89%;在核分裂指数试验中,随着鞘氨醇剂量的增高,其核分裂指数明显降低;在3H-TdR掺入试验中,可见随着鞘氨醇剂量的增高,3H-TdR掺入到HT-29细胞中明显的减少,与阴性对照组相比有显著性差异。结论　鞘氨醇对HT-29细胞的生长增殖有明显抑制作用,这可能是鞘磷脂抑制结肠癌的机制之一。

关键词:鞘氨醇;人结肠癌HT-29细胞

InhibitoryeffectofsphingosineonhumancolonHT-29cells　SONGShi2li,LIBai2xiang,HANYun2feng.DepartmentofHealthToxicology,PublicHealthCollegeofHarbinMedicalUniversity(Harbin150001,China)

Abstract:Objective　TostudytheinfluenceofsphingosineonthegrowthofhumancolonHT-29cellsinvitro.Meth2ods　Usingcellculturetests(MTTtest,indexofcellularmitosis,and3H-TdRincorporationtest),toexaminethegrowthofHT-29cellsatfiveconcentrations(0,0.82,1.63,3.125,6.25,12.5μmol/L)withanegativecontrol(DMSOv/v).Results

　SphingosinecaninhibitedthegrowthofHT-29cells.Aftertreatmentwithvarioussophingosineconcentrationsmentionedabovefor7days,theinhibitionrateswere18%,45%,72%,87%and89%respectively.Withtheincreaseofsphingosineconcentrations,3H-TdRincorporationwasdecreasedinHT-29cellsandthequantityof3H-TdRincorporationwassignif2icantlydecreasedascomparedwiththenegativecontrol(P<0.05).Conclusion　SphingosinecansignificantlyinhibitthegrowthofHT-29cells,whichwasprobablyoneofthepreventivemechanismsofsphingomyelinforcoloncancer.

Keywords:sphingosine;humanconloncarcinoma(HT-29)cell　　鞘氨醇是鞘磷脂(sphingomyelin)在体内的代谢产物。鞘磷脂是食物中的一种天然成分,它主要存在于细胞膜、脂蛋白和其他富含脂类的组织结构上。已有文献报道,鞘磷脂可以抑制由二甲肼(DMH)诱导的小鼠的结肠癌〔1〕。因此,鞘磷脂作为一种有潜力的化学预防剂/治疗剂的新资源已引起了国内外学者的广泛关注。体外试验中,鞘磷脂对结肠癌细胞

(HT-29)的生长增值没有作用,而神经酰胺则能明显抑制

2〕HT-29的生长增值〔。本实验采用体外细胞培养法,研究

112　方法

11211　单核细胞细胞毒性测定(MTT)试验　指数生长期HT-29细胞接种于24孔培养板中,每孔2×104个细胞,培

养24h后,更换含鞘氨醇的培养液,使其终浓度分别为0182,

1163,31125,6125,1215μmol/L,每个浓度设4个平行孔,另

设溶剂对照组,分别按培养1,2,3,4,5,6,7d分别加入新鲜配制的MTT(PBS配成1g/ml浓度)200μl孔,每天再培养4

h后倒尽板中的培养液,各孔加DMSO400μl溶解结晶物,吹

鞘氨醇对人结肠癌细胞(HT-29)的影响,以完善鞘磷脂抑制结肠癌的机制。

1　材料与方法111　材料

11111　受试物　鞘氨醇纯度为98%,购自美国matreya公

打,用酶标仪(波长570nm)测定各孔的吸光度A值,以每组

4个孔A的平均值作为各组的平均A值。根据下列公式计

算鞘氨醇对HT-29细胞的生长抑制率。

细胞生长抑制率(%)=(1-给药组A/对照组A)×

100%

11212　细胞核分裂指数　将HT-29细胞接种于24孔培养

司,溶于二甲基亚砜(DMSO),根据细胞毒性实验,确定其剂μg/ml,阴性对照为量分别为0182,1163,31125,6125,1215

DMSO,其终浓度为011%(v/v)。

11112　HT-29培养　HT-29细胞购自北京肿瘤研究所,

板内,每孔2×104个细胞,每个剂量4个平行孔,培养24h后,更换含不同浓度鞘氨醇的培养液,分别培养24,48h后,甲醇固定,Giemsa染色,计数2000个细胞中所含分裂相,分裂指数为每1000个细胞中有分裂相的细胞数。求出分裂指数与对照组比较,计算抑制率。

3

11213　H-TdR掺入试验　将HT-29细胞接种于24孔培

该细胞在含青-链霉素和10%胎牛血清的1640(Gibco公司)培养液(含谷氨酰胺)中,于37℃,5%CO2培养箱中培养,用乙二胺四乙酸(EDTA)和胰酶混合液消化、传代。

3基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170806)

　作者单位:11哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室,

哈尔滨150001;

21齐齐哈尔医学院公共卫生教研室

　作者简介:宋士利(1979-),男,黑龙江七台河人,硕士,研究方向:

卫生毒理学。

养板内,每孔3×104个细胞,培养24h后,换成含不同浓度鞘氨醇的培养液,分别作用24和48h后,在结束培养前6h加入3H-TdR,使其终浓度为015μci/ml,用细胞收集仪将细胞收集到玻璃滤膜上,干燥后在液闪仪上测定每分钟计数值

(CPM),测定抑制率。

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2　结果

中国公共卫生2004年7月第20卷第7期　　ChinJPublicHealthJul2004Vol.20No.7

(3H-TdR掺入试验)(表3)　从表3可以看出,鞘氨醇1215

211　MTT结果(表1)　镜下观察,1215μmol/L剂量组在第1d就开始有形态学变化。各个剂量组在第3d就开始出现A的差距。在第7d,各剂量组有明显的A值差距。结果显

μmol/L剂量组作用细胞24h和鞘氨醇1215,6125μmol/L剂量组作用细胞48h对HT-29细胞有明显抑制作用,并与阴性对照组比较有显著性差异(P<0105和P<0101)。值得注意的是,在作用48h时,1132和31125μmol/L剂量组的CPM要高于对照组。

3　讨论

1〕

鞘磷脂可以抑制化学诱导的小鼠结肠癌〔。神经酰胺和

示,鞘氨醇对HT-29细胞有生长抑制作用,且随药物浓度增加,作用时间延长,细胞增殖速度减慢,甚至细胞数量减少,呈剂量-效应关系。鞘氨醇各剂量7d抑制率分别为89%,

87%,72%,45%,18%。

表1　不同浓度鞘氨醇对HT-29细胞作用的MTT结果

浓度

(μmol/L)121561253112511630182

1d010660106401075010760107801085

2d0106101061010640107101079010843d010610106501075010970110601125

4d010560105501065010100112101176

5d010570106301099011450117401306

6d010570106001085011650133701360

7d010610107201146012970144101537

鞘氨醇都是鞘磷脂的代谢产物,神经酰胺又可以在神经酰胺酶的作用下脱使去的酞基生成鞘氨醇。神经酰胺是细胞凋亡中一个常见的第二信使分子,目前已经发现了神经酰胺能诱导多种肿瘤细胞的凋亡,(如人类白细胞CMK-7、HL-60、

3,4〕U937和JB6肿瘤细胞等)〔。鞘氨醇在基本的生物过程,

如细胞增殖、分化、受体功能、肿瘤发生方面发挥着非常重要的作用。研究报道,在人的白血病细胞系CMK-7,HL60和

U937细胞中加入20μmol/L的鞘氨醇,在6h内就可以使

4〕90%的细胞产生凋亡〔。

对照组

本研究MTT试验结果表明鞘氨醇对HT-29细胞的生长增殖有抑制作用,且随着浓度增高,呈现剂量-反应关系。细胞核分裂指数是用来检测细胞增殖的旺盛程度,在细胞核分裂试验中发现,随着鞘氨醇剂量增加,对HT-29细胞核分裂抑制作用增强;3H-TdR掺入试验反映细胞内DNA合成情况,其结果表明鞘氨醇对HT-29细胞内DNA合成有抑制作用,且抑制作用呈剂量-效应关系。作用48h时,1132和

31125μmol/L剂量组的CPM要高于对照组,可能是因为鞘氨

212　鞘氨醇对HT-29细胞核分裂指数的影响(表2)　鞘氨

醇各剂量组与对照组相比,鞘氨醇作用HT-29细胞24和48

h对细胞有丝分裂有一定的抑制作用,在1215和6125

μmol/L的剂量组表现非常明显。

表2　不同浓度鞘氨醇对HT-29细胞核分裂指数的影响

鞘氨醇

(μmol/L)

细胞分裂指数(%)

24h71657185614061103170303

3

抑制率(%)

24h--31620134814100

48h-7176162311100100

48h911081408157100303

33

　010

018311633112561251215

醇短期可能促进DNA的合成。

综上所述,鞘氨醇可以抑制结肠癌细胞的生长,这可能是鞘磷脂抑制结肠癌的机制之一,但这种抑制作用是否是通过凋亡途径,需要进一步研究。

参考文献:

〔1〕　SchmelzEM,DillehayDL,WebbSK,etal.Sphingomyelincon2

sumptionsuppressesaberrantcoloniccryptfociandincreasesthe

proportionofadenomasversusadenocarcinomasinCF1micetreat2

edwith1,2-dimethylhydrazine:implicationsfordietarysphin2golipidsandcoloncarcinogenesis[J].CancerRes,1996,56:4936-4941.

〔2〕　张涛,李百祥.鞘磷脂及神经酰胺对人结肠癌细胞(HT-29)的

影响[J].卫生毒理学杂志,2003,17(2):81-83.

　　注:与对照组比较,3P<0105,33P<0101

表3　不同浓度鞘氨醇对HT-29细胞DNA合成的影响

鞘氨醇

(μmol/L)

3

H-TdR掺入(CPM)

48h71415±12418104815±17810110110±701648013±8319316510±62143

3

抑制率(%)

24h-1217010701085319

48h--4617-541067127619

24h745±591365013±1091369113±1451968410±541934315±65193

　010

11323112561251215

〔3〕　DavisMA,FlawsJA,YoungM,etal.Effectofceramideonintra2

cellularglutathionedeterminesapoptoticornecroticcelldeathof

JB6tumorcells[J].ToxicoSci,2000,53:48-65.〔4〕　SweeneyEA,SakakuraC,ShirahamaT,etal.Sphingosineandits

methylatedderivativeN,N-dimethlysphingosine(DMS)induceapoptosisinavarietyofhumancancercelllines[J].IntJCancer,1996,66:358-366.

　　注:与对照组比较,3P<0105,33P<0101

213　不同浓度鞘氨醇对HT-29细胞DNA合成的影响

收稿日期:2003211212(宋艳萍编辑　郭长胜校对)