实验与检验医学２０１４年４月第３２卷第２期Ｅｘｏｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｐｒ．２０１４，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．２ ・１２１・ ・论著・ 应用 甲胎蛋白化学发光免疫定量检测试剂的研制与临床 戴志文 ，蔡祥霞 ，杨湘越ｚ，戴振贤 ，谢玉玲 ，薛正翔 ，吴玉水 ｆｌ、福建省洪诚生物药业有限公司，福建莆田３５１２５４；２、临床检验医学研究所，福建福州３５００２５） 摘要：目的研制肿瘤标志物甲胎蛋白化学发光免疫定量检测试剂并建立检测方法，进行初步的临床应用评价。方法 将甲胎蛋白单抗包被微孔板．以辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白抗体为二抗．结合鲁米诺化学发光底物系统．建立甲胎蛋白 化学发光免疫定量检测方法。用甲胎蛋白检测试剂国家参考品分析所建立方法的准确性、灵敏度、稳定性和重复性等试剂性 能．并与西门子公司的甲胎蛋白定量检测试剂同时检测临床血清样本３５０例，比较检测结果。结果所研制的试剂性能符合 甲胎蛋白检测试剂国家参考品各项质量标准要求。批内变异系数４．１％ ５－２％、批间变异系数４．７％；试剂盒置３７℃考核３ｄ，其 稳定性良好。临床样本比对检测结果表明，两种方法相关性良好ｆ相关系数ｒ＝０．９８２３，阴性符合率９９．５％、阳性符合率９８．７％， 总符合率为９９．１％，Ｋａｐｐａ值为０．９８，一致性强度为最强）。结论疫定量试剂并建立其检测方法－适合临床检验推广应用。 成功研制了快速、特异、敏感和稳定的甲胎蛋白化学发光免 关键词：甲胎蛋白：化学发光：检测 中图分类号：Ｒ４４６．６１，Ｒ７３５．７，Ｒ４４６．６２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—１１２９（２０１４）０２—０１２１－０３ ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７４－１ １２９．２０１４．０２．００５ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＤＡ，Ｚｈｉｗｅｎ，ＣＡＩ Ｘｉａｎｇｘｉｃ￣ＹＡＮＧ Ｘｉａｎｇｙｕｅ，ｅｔ ．Ｔｈｅ凡 肌３５１２５４，Ｃｈｉｎａ Ｈｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｂｉｏ－ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃｏ１ Ｃｏ，Ｌｔｄ．凡 伽Ｐｕｔｉａｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆＣＵＡ）ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ ａｌｐｈａ ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ１ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＣＬＩＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＰ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏ－ ｐｌａｔｅｓ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＡＦＰ．ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ—ＡＦＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ．ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｌｕｍｉｎｏｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｅ— ｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＣＬＩＡ．ＡＦＰ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ３５０ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｋｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｉｅｍｅｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｆｈｅ ＣＬＩＡ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｍｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅ— ｍｅｎｔｓ ｏｆ ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ．Ｔｈｅ ｉｎｔｒａ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｆＣＶ）ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ４．１％一５．２％ａｎｄ ｉｎｔｅｒ ＣＶ ｗａｓ ４．７％．Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＣＬＩＡ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｋｉｔｓ ｆｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｅｅ ｒａｔｅ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ９９．５％．９８．７％ａｎｄ ９９．１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ） ａｎｄ ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｒ＝０．９８２３．Ｈｉｇｈ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｋａｐｐａ ｖａｌｕｅ ｏｆ ０．９８．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａ ｒａｐｉｄ，ｓｐｅｃｉｉｆｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ＣＬＩＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＰ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｔｈａｔ ｗｉｌｌ ｂｅ ｆｉｔ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｌｐｈａ ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 肿瘤标志物的血清含量水平与恶性肿瘤的发 生、发展、消退、复发等具有良好的相关性。定量检 测肿瘤标志物的血清含量对相关恶性肿瘤的早期 诊断、疗效和预后判断等均有重要参考价值。但 是．目前发现的用于肿瘤筛查诊断的标记物大都 在患者体内含量很低．一般的检测方法不够敏感． 难于精确定量测定 化学发光免疫检测技术具有 灵敏度高、线性范围宽、光信号持续时问长、结果 稳定、重复性好、检测快速、绿色环保、便于自动化 基金项目：福建省中小企业创新基金项目ｆ２０１１Ｃ００１４）。 作者简介：戴志文，男（１９８１．０９一），本科，药师，主要从事生物技 术研发下作 通信作者：吴玉水，博士，副主任技师，主要从事实验诊断学技 术与产品开发。 及实验室之间的标准化等优点ｌ“ 甲胎蛋白ｆＡＦＰ１是早期诊断原发性肝癌最敏 感、最特异的指标．７０～９５％的原发性肝癌患者的 ＡＦＰ升高 目前临床实验室大多采用国外的检测 系统，检测成本高昂。因此，研制肿瘤标志物化学 发光免疫定量检测试剂具有重要社会效益和经济 价值。本文报道甲胎蛋白ｆＡＦＰ））Ｉ￣瘤标志物化学发 光免疫定量检测试剂的研制及其检测方法的建 立．并初步进行临床应用评价 １材料与方法 １．１样本来源临床检验医学研究所２０１１ 年８月２２日至２０１１年１ １月３日临床血清样本 ３５１份。所有血清均一２０℃保存待检。男２４１份，女 ．１２２． 实验与检验医学２０１４年４月第３２卷第２期 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ［ａｎｄ ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉ￣ｉｎ％Ａｐｊ；：２０ １ ， ！： ， ．２ １０９份。年龄ｌ７～９２岁．平均５３．２岁。 １．４．４特异性实验用人血清白蛋白ｆ１００００ｎｇ／ｍ１）、 癌胚抗原（８０ｎｇ／ｍ１）、糖类抗原１２５（５００Ｕ／ｍｌ１、糖类 抗原１５—３（５００Ｕ／ｍｌ１、糖类抗原１９—９（４００Ｕ／ｍ１）与研 １．２主要试剂与仪器鲁米诺化学发光底物液ｆ自 制）：ＡＦＰ标准品、ＡＦＰ包被抗体和辣根过氧化物酶 标记的ＡＦＰ抗体均购自美国辉瑞公司：ＡＦＰ国家 参考品购自中围药品生物制品检定所ｆ批号： 制的ＡＦＰ抗体包被板进行交叉反应检测ｆ检测方 法同上）．其测定结果均应小于２．５ｎｇ／ｍｌ。 １．４．５稳定性实验将所研制的ＡＦＰ化学发光诊 １５０５４２—０００４１：ＨＣ—ＣＬＡ—ＩＩＩ化学发光分析仪ｆ洪诚 公司产品１；洗板机（北京天石公司１；对照试剂为：西 门子公司生产的ＡＦＰ定量检测试剂ｆ批号： 断ｉ￣ｑ（？ｔｔ次：１２０７０８）置３７℃３ｄ后，用于ＡＦＰ检测 试剂国家参考品的测定分析ｆ检测方法同上１，测定 １１０７６４１：白色不透明微孔板购自深圳市金灿华实 业有限公司 １－３方法 １．３．１校准品的配制将ＡＦＰ抗原原液标定后溶 于小牛血清中 配制成含０，５。２５，７５，１５０，４００ ｎｇ／ ｍｌ的校准品溶液 １．３．２ Ａｎｔｉ—ＡＦＰ—ＨＲＰ溶液的制备用含有５０％小 牛血清的ＰＢＳ将ＨＲＰ标记的ＡＦＰ抗体作适当稀 释．２ ８℃下保存备用 １－３－３抗体包被板的制备将ＡＦＰ包被抗体用 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．６的碳酸盐缓冲液作不同浓度稀 释后．向微孔板各孔中加入１００１￣１，４￣Ｃ包被过夜， 弃去包被液，加入含１０ｇ／Ｌ牛血清白蛋白的ＰＢＳ缓 冲液封闭．４￣Ｃ封闭过夜 弃去封闭液．除湿干燥后 备用 １－３．４实验操作方法采用双抗体夹心一步法定量 检测ＡＦＰ含量。实验设校准品ｆ０、５、２５、７５、１５０、 ４００ｎｇ／ｍ１）共６孔以及待检样品孔等。简要操作步 骤如下：分别向微孔板中加入各校准品或样品ｆ每 孑Ｌ ２５１￣１），再加酶结合物５０ ｖ混匀后，置３７℃温育 ６０ｒａｉｎ：用ＰＢＳ洗孔５次，拍干。每孔加发光底物液 Ａ和Ｂ各５０１ｘ１．混匀后室温避光放置１０ｍｉｎ。最后 用化学发光分析仪测量各孔相对发光值（ＲＬＵ１ 绘 出剂量一反应曲线．从剂量一反应曲线求得样品的 ＡＦＰ含量。 １．４试剂性能评估 １．４．１准确性实验将研制的－＝三批次ｆ批号： １２０６１８、１２０６２８、１２０７０８）ＡＦＰ化学发光免疫定量检 测试剂分别用于测定ＡＦＰ国家参考品ｆ检测方法 同上１，其结果的相对偏差应在±ｌ０％以内 １－４．２灵敏度平行测定２０孔零值校准品血清．以 ＳＯ＋２ＳＤ作为试剂盒的最低检测浓度 １＿４＿３精密度平行测定两个不同浓度（１２ｎｇ／ｍＬ和 １２０ ｎｇ／ｍ１）的质控血清各２０孔．求出批内和批问变 异系数 结果应符合产品质量标准 １．５与进口对照试剂比对将研制的ＡＦＰ检测试剂 ｆ考核试剂．批次：１２０２２ｌ１与西门子公司生产的ＡＦＰ 定量检测试剂（对照试剂．批次：１１０７６４）同时对３５０ 份临床样本进行比对检测 严格按照试剂盒中操 作步骤进行检测，并在试剂盒有效期内使用 以正 常人血清的ＡＦＰ含量小于ｌＯｎｇ／ｍｌ为判定标准．将 临床样本检测值按阴阳性结果进行统计分析．求 出灵敏度、特异性和总符合率：并对两种试剂的测 定值进行相关性分析。求出相关系数ｒ值 考核试 剂与对照试剂检测结果之间的一致性比较采用 Ｋａｐｐａ值进行分析 ２结果 ２．１剂量一反应曲线以所配制校准品浓度的对数 为横坐标．发光值的对数为纵坐标．用双对数数学 模型Ｌｏｇ－Ｌｏｇ函数处理，剂量一反应曲线线性方程 Ｙ：１．０４１６Ｘ＋３．１５６．线性相关系数ｒ＝０．９９９９．表明所 建立的化学发光免疫定量检测方法具有良好的剂 量反应线性关系 ２．２准确性ｊ批试剂（批号：１２０６１８、１２０６２８、 １２０７０８）用于测定ＡＦＰ检测试剂国家参考品．检测 结果均符合质量标准ｆ质量标准及检测结果见表 １）。 ２－３稳定性将所研制的试剂ｆ批次：１２０７０８）置 ３７ ３ｄ后．刖于ＡＦＰ检测试剂国家参考品的测定 分析 测定结果表明试剂的各项性能符合产品质 量标准要求ｆ见表１１ ２．４特异性检测结果表明人血清白蛋白ｆｌ０Ｏ００ ｎｇ／ｍ１）、癌胚抗原（８０ｎ￣ｍ１）、糖类抗原１２５（５００Ｕ／ ｍ１）、糖类抗原ｌ５－３（５００Ｕ／ｍ１）、糖类抗原１９－９（４００ Ｕ／ｍｌ１的测定结果均小于２．５ｎｇ／ｍＥ．符合质量标准 要求 ２．５与进口对照试剂比对以西门子的ＡＦＰ试剂 盒检测结果为参照标准，特异性ｆ阴性符合率＇｝＝ （１９９／２００）ｘ１００％＝９９．５０％；灵敏度ｆ阳性符合率１＝ 堕 匡堂 Ｑ 至 笙 ２鲞笙 塑垦 乜 卫 ！ Ａｐｒ： Ｙ ２ ・１２３・ 表１ ＡＦＰ检测试剂国家参考品测定结果 （１４８／１５０）ｘ１００％＝９８．７％；总符合率＝（３４７／３５０）Ｘ 广，因此近几年来在国内发展迅猛 ．然而 目前同内 １００％＝９９．１％（见表２）。与对照试剂比对，Ｋａｐｐａ值＝ 用于化学发光免疫法测定用的试剂大都以进口试 ０．９８，一致性强度最强（０．８１－１．０）。两种方法检测结 剂为主．这些试剂与所用仪器采用封闭式系统．使 果具有良好相关性（相关系数ｒ＝Ｏ．９８２３，见图１）。 得试剂与仪器必须相互依赖、相互配套．同时ｍ丁 表２两种检测试剂３５０份临床样本ＡＦＰ测定结果对比 进口试剂和仪器的价格比较昂贵．也不利于在闰内 的普及和推广 因此．研制肿瘤标志物化学发光免 疫定量检测试剂具有重要社会效益和经济效益 我们采用ＡＦＰ单抗包被微孔板．以辣根过氧 化物酶标记的ＡＦＰ抗体为二抗．结合鲁米诺化学 发光底物系统．研制了ＡＦＰ化学发光免疫定量检 测试剂并建立了检测方法 实验结果表明．所研制 删Ｏ ｔｏｏｏｏ 的试剂性能符合ＡＦＰ检测试剂国家参考品各项质 童粕ｏ∞ ■５洲 量标准要求。试剂的批内变异系数４．１％～５．２％、批 ■Ｉｏｏｏｏ ｌ间变异系数４．７％：试剂盒置３７ 考核３ｄ．其稳定 ＃ ｌ洲 ■ ● 性良好。并且与其他的肿瘤标志物无交叉反应，特 Ｏ Ｉ！ｏｏｌｌｏ∞∞０ ６∞∞■ｍ瑚１０ｏ￣０ １９００００ 舯魔域｛ｆ咔洲室但《ｎ‘ Ｌ） 异性高 与进口西门子对照试剂同时检测临床血 图１两种检测试剂３５０份临床样本ＡＦＰ 清样本３５０份．结果表明两种检测方法具有良好 测定值的相关性分析 相关性ｆ相关系数ｒ＝０．９８２３１． 以正常人血清的ＡＦＰ ３讨论 含量小于ｌＯｎｇ／ｍＬ为判定标准．将临床样本的检 原发性肝癌患者血清ＡＦＰ水平显著高于肝硬 测值按照阴阳性结果进行统计分析．结果阴性符 化患者和健康体检者．而肝硬化患者血清ＡＦＰ水 合率９９．５％、阳性符合率９８．７％．总符合率为 平又显著高于健康体检者。ＡＦＰ水平升高对原发 ９９．１％．Ｋａｐｐａ值为０．９８ 两种方法检测结果的一敛 性肝癌及肝硬化等肝病的诊断具有重要价值．对 性强度为最强．表明所研制的ＡＦＰ化学发光免疫 血清ＡＦＰ升高者．可通过阈值判断患者是原发性 定量检测试剂与市售的进ｆＪ同类产ｒ 同效 、本义 肝癌或者肝硬化 对患者血清ＡＦＰ水平进行动态 成功建立了快速、特异、敏感和稳定的肿瘤标志物 观察．发现慢性肝炎、肝硬化患者血清ＡＦＰ水平升 ＡＦＰ化学发光免疫定量检测试剂并建立其检测方 高多为一过性升高或呈反复波动性．而原发性肝 法．适合在临床上推广应用 癌患者多为稳定持续性升高 朱瑜等临床实验结 参考文献 果表明血清肿瘤标志物中ＡＦＰ的检测对于乙型肝 …ｌ汪晨，吴洁，宗晨，等．化学发光免疫分析方法与ｆ、 川进展ｌＩＪ分析化 Ｉｌｌ炎相关肝癌具有诊断价值ｒ２Ｊ 学．２０１２．４０（１）：３—１０． 化学发光免疫法同时具备了高灵敏度、高特 ［２１￣ｖ瑜．ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９９诊断乙型肝炎卡Ｈ火肝癌例步研究…．实验 异性、定量检测范围宽、无环境污染等优点，而且其 与检验医学．２０１１，２９（５）：５４１—５４２． 检测用仪器兼容性好．价格相对便宜易于普及和推 ｆ收稿日期２０１３—１０—３１；收同¨期２０ｌ４—０１—１７）
